Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Analyse av oksidativt stress i sebrafisk embryo

Published: July 7, 2014 doi: 10.3791/51328
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Molecular Biotechnology and Health Science, University of Torino, 2Laboratory of Endothelial Molecular Biology, Vesalius Research Center, VIB

Abstract

Høye nivåer av reaktive oksygen arter (ROS) kan føre til en endring av mobilnettet redoks staten mot oksidativt stress tilstand. Denne situasjon fører til oksydasjon av molekyler (lipid, DNA, protein) og fører til celledød. Oksidativt stress påvirker også utviklingen av flere patologiske tilstander som diabetes, retinopathies, nevrodegenerasjon, og kreft. Således er det viktig å definere verktøy for å undersøke oksidative stressbetingelser, ikke bare på nivået av enkeltceller, men også i sammenheng med hele organismer. Her ser vi på sebrafisk embryo som et nyttig in vivo systemet til å utføre slike studier og presentere en protokoll for å måle in vivo oksidativt stress. Benytte seg av fluorescerende ROS prober og sebrafisk transgene fluorescerende linjer, vi utvikle to ulike metoder for å måle oksidativt stress in vivo: i) en "hel embryo ROS-påvisningsmetode" for kvalitativ måling av oksidativt stress og ii) et "encellede ROS påvisningsmetoden "for kvantitative målinger av oksidativt stress. Heri vi demonstrere effekten av denne fremgangsmåten ved å øke oksidativt stress i vev ved oksiderende midler og fysiologiske eller genetiske metoder. Denne protokollen er mottagelig for termin genetiske skjermer, og det vil avhjelpe årsak-virkningsforhold av ROS i dyremodeller av oksidativt stress-relaterte sykdommer som nevrologiske lidelser og kreft.

Introduction

Oksidativt stress er nærmere definert som en tilstand som resulterer fra en ubalansert cellulære redoks staten. Komplekset redoksreaksjoner som rutinemessig oppstår inni cellene bestemme cellulære redoks-stat. Redoksreaksjoner består av alle kjemiske reaksjoner som består i overføring av elektroner mellom atomer av biologiske molekyler som produserer reduksjon og oksydasjon av molekyler (det vil si redoks-reaksjoner). Disse reaksjonene er katalysert av elektronisk aktivert arter (dvs. pro-oksidative arter), som er preget av en ekstrem strukturelle ustabilitet og spontan aktivering av ubalanserte elektroner som utveksler med nabo biomolekyler. Disse uregelmessige reaksjoner føre til DNA-skade, protein karboksylering, og fettoksidasjon, og til slutt føre til celledød 1.. Økte nivåer av oksidativt stress har blitt assosiert med aldring og progresjonen av forskjellige patologiske tilstander 2. Oksidativt stress harblitt rapportert å være ansvarlig for vaskulære endringer i diabetes og hjerte-og karsykdommer 3,4. Det spiller også en avgjørende rolle i nevronale degenerasjon ved Alzheimers sykdom og Parkinsons sykdom 5. Videre har oksidativt stress er påvist som en kritisk faktor i styrende kreft progresjon og metastatisk hendelser 6,7. I tillegg, kan inflammasjon og immunresponser fremkaller og ytterligere støtte oksidativt stress 8..

I levende celler, er pro-oksidative arter avledet fra oksygen (ROS; reaktive oksygenforbindelser) eller nitrogen (RNS, reaktive nitrogenforbindelser). ROS har hydroksylradikalet, den superoksid anion (OH.) (O 2 -), og hydrogenperoksyd (H 2 O 2). Den primære RNS er lystgass (NO.). En rekke sekundære reaktive arter kan genereres av spontane interaksjoner between ROS og RNS eller gratis metaller ioner ni. For eksempel reagerer superoxide anion med dinitrogenoksid og danner peroxynitrate (ONOO -), mens H 2 O 2 reagerer med Fe 2 + genererer hydroksylradikaler. ROS og RNS, på grunn av deres evne til å reagere med flere biomolekyler, betraktes en farlig trussel for opprettholdelse av den fysiologiske redox state 10.. For å opprettholde redox state cellene er utstyrt med en serie av avgifte anti-oxidant-molekyler og enzymer. Den superoksid dismutase (SOD), Katalase, glutation peroxidase og Peroxiredoxins hovedsak utgjør den anti-oksidanter enzymatisk-arsenal som tilbyr mobil-beskyttelse fra pro-oksidative arter inkludert H 2 O 2, OH og Oono -. 11. Også anti-oksidanter molekyler som vitamin C og E, polyfenoler og CoenzymeQ10 (Q10) er av avgjørende betydning for å slukke ROS og deres farlige dederivater 12,13. Imidlertid forskyver en overdreven produksjon av ROS og RNS, eller en dysfunksjon i det anti-oxidant-systemet, den cellulære redoks-tilstand mot oksidativt stress 14..

Foruten sin negative konnotasjon, kan ROS spille ulike fysiologiske roller i celler av ulik opprinnelse. Celler normalt produsere ROS som signalmolekyler å megle normale biologiske hendelser som vert forsvar og såret reparasjon 15-17. Reaktive arter blir vanligvis produsert i celler av intracellulære enzymer så som NOX (NADPH oksidase) og XO (Xantine oksidase) som reaksjon på signalering faktorer, vekstfaktorer og intracellulære svingninger av kalsiumnivået 18,19. Det har blitt rapportert at ROS differensielt kan modulere aktiviteten til nukleære viktige faktorer slik som p53 eller cellulære komponenter som for eksempel ATM-kinase, en hovedregulator av respons på DNA-skade tjue. Analogt ROS sterkt påvirke cellulære signaler ved å formidle the oksidasjon og inaktivering av protein tyrosin fosfataser (PTP), som er etablert som kritiske regulatorer av signaltransduksjon 21. Videre, proteomikk baserte metoder viser at RNS er også ansvarlig for spesifikke protein modifikasjoner og endringer av molekylær signalering. RNS reagere med cystein tiolgrupper modifisere dem inn i S-nitrothiols (SNO) og utløsende molekylære stier samtidig med patologiske tilstander som inflammatoriske og autoimmune sykdommer 22,23.

Etter cellekultur eksperimenter bare delvis reprodusere de mange faktorer som virker in vivo, er det av stor interesse å utføre redoks-studier i dyremodeller 24,25. For å oppnå dette har sebrafisk vært betraktet som en egnet virveldyr dyremodell for å studere oksidativt stress dynamikk 26. Sebrafisk er et nytt modellsystem som gir flere fordeler for å studere cellulære og genetiske hendelser i løpet av virveldyr development og sykdom. Store klynger av embryoer kan genereres og tilgjengelig ukentlig for eksperimentelle behov. Videre har den ekstraordinære optisk klarhet av sebrafisk embryoer, samt deres lille størrelse, gjør det mulig enkelt celle avbildning og dynamisk sporing i et helt organismer 27.. I det siste tiåret har blitt generert et betydelig antall sebrafisk mutanter å modellere menneskelige patologiske tilstander som kreft og genetiske sykdommer 28-31. Viktigst, har et mangfold av transgene linjer blitt produsert for å tillate omfattende muligheter av genetiske og biologiske manipulasjoner 32. For eksempel er det transgene vevsspesifikke sebrafisk linjer ofte benyttet for in vivo-studier. Disse linjer uttrykker et fluorescerende protein under kontroll av en promoter valgt, blir evnen til å identifisere enkeltceller in vivo, så vel som den anatomiske strukturen det omfatter.

Flere toksikologiske studier har allerede brukt tHan sebrafisk for å evaluere in vivo virkning av kjemikalier på redoks-homeostase, noe som tyder på egnetheten av denne virveldyr som en dyremodell for feltet for medisiner og oksidativt stress 33-35. Selv om noen fluorescerende prober er testet for å overvåke oksidativt stress i sebrafisk larver 36,37, er det ingen etablerte metoder for å detektere og måle nivåene av oksidativt stress i sebrafisk vev og levende celler. Her beskriver vi en prosedyre for in vivo kvantifisering av oksidativt stress i levende celler av sebrafisk embryo. Tenkelig verktøy, FACS sortering, fluorescerende prober og pro-oksidative betingelser er alle sammen til å generere en enkel test for påvisning og kvantifisering av oksidative arter i sebrafisk embryo og vev.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. Utarbeidelse av instrumenter og arbeids Solutions

  1. Forbered fisken vannløsning. Gjør en stamoppløsning ved å oppløse 2 g sjøsalt 'Instant Ocean "i 50 ml destillert vann. Tilsett 1,5 ml av tørrfisk vann til 1 liter destillert vann for å tilberede ferdig til bruk fisk vann (60 ug / ml sjøsalt sluttkonsentrasjon). Autoklaveres klar til å bruke fisk vann før bruk. Denne løsningen benyttes som sebrafisk embryo medium.
  2. Forbered methylcellulose for embryo montering. Oppløs 1,5 g metylcellulose i 50 ml sterilt vann fisk. Tilrettelegge oppløsningen ved hjelp av en magnet på en røre plate. Den fullstendige oppløsning av pulveret kreve flere timer. Kontroller løsning for klarhet og alikvoter i små rør. Oppbevares ved -20 ° C i flere måneder og tine opp alikvoter ved bruk. Sentrifuger methylcellulose ved 950 xg i 5 min før bruk. Unngå fryse-tine sykluser av mengdene.
  3. Forbered 50 ml Tricaine / etyl-3-aminobenzoat mEthansulfonatsaltet (stamløsning) ved å oppløse 200 mg av Tricaine i 100 ml vann og juster pH til 7,0 ved bruk av Tris-HCl-1 M (pH 9). Oppbevar denne aksjen ved 4 ° C for ikke mer enn 30 dager. FORSIKTIG: Tricaine er giftig. Bruk i overensstemmelse med godkjente retningslinjer for håndtering.
  4. Indusere oksidativt stress i sebrafisk embryo
    1. Forbered en oksidant løsning for generiske oksidativt stress induksjon: Lag 50 ml oxidant løsning ved å legge H 2 O 2 stamløsning (hydrogenperoksid, 100 mM) til fiskevann. Bruk H 2 O 2 av en endelig konsentrasjon på mellom 2 mM og 100 mM. Forbered denne løsningen rett før bruk. Oksidanten løsningen kan brukes på både hel mount ROS-deteksjon og encellede ROS-deteksjonsmetoder. Ikke oppbevar denne løsningen. FORSIKTIG: H 2 O 2 er farlig, og farlig ved innånding og svelging. Kontakt med brennbare stoffer kan forårsake brann. Håndtak under en avtrekkshette og slitasje passende personal verneutstyr.
    2. Tilbered en oksidant løsning for mitokondrier-avledet oksidativt stress induksjon: Lag en oksidant stamløsning (5 mM) ved å oppløse 3,9 mg av rotenon i 2 ml dimetyl-sulfoksyd (DMSO). Hold denne løsningen ved romtemperatur i mørket.
      1. Oppløs rotenon stamoppløsning til 10 ml av fisk vann for å lage en bruksferdig oppløsning. Bruk rotenon i en konsentrasjon mellom 5 til 50 uM. Ikke bruk rotenon ved konsentrasjoner høyere enn 100 mikrometer. Ved passende konsentrasjoner, kan dette oxidant løsningen brukes på både hel mount ROS-deteksjon og encellede ROS-deteksjonsmetoder. FORSIKTIG: Rotenon er giftig og farlig. Håndtering ifølge riktige forholdsregler uttalelser.
    3. Indusere oksidativt stress ved genet knock-down: Knock-down nrf2a genuttrykk i sebrafisk embryo ved morfolinogruppe mikroinjeksjon som tidligere rapportert av Timme-Laragy A. et al, 2012 38..
    4. Fremkall oxidAtive stress etter vevsskade: generere et sår margin på halefinnen på sebrafisk embryo på 72 HPF som tidligere beskrevet av Niethammer et al, 2009 39..
  5. Forbered 5 ml av ROS-deteksjon løsning for enkelt celle ROS-påvisningsmetode:
    1. Løsning for generell ROS deteksjon: Løs opp generiske ROS-sensitive molekylær probe i HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) for å forberede en fungerende løsning (konsentrasjonsområde: 2,5-10 mm). Denne løsningen må tilberedes rett før bruk.
    2. Løsning for spesifikk påvisning ROS indusert av mitokondrier: Kort tid før bruk, oppløse en mitokondriell ROS-følsom sonde med DMSO lage en 5 mM stamløsning. Løs opp stamløsning i HBSS for å forberede en fungerende løsning (konsentrasjonsområde: 2,5-10 mm).
      MERK: lys og oksygen eksponering av ROS-gjenkjenning arbeidsløsninger og deres respektive lager løsninger Unngå. Beskytt røret fra lyset ved å brukeen aluminiumfolie. Ikke lagre eller gjenbruk prober oppløst i HBSS. Oppbevar lager løsninger ved -20 ° C i en måned.
      FORSIKTIG: Håndter molekylære prober og DMSO under en avtrekkshette i overensstemmelse med godkjente retningslinjer.
  6. Forbered 5 ml av ROS-deteksjon løsning for hele fjellet ROS-påvisningsmetoden: Løs opp generiske ROS-sensitive probe stamløsning (stabilisert i DMSO) i HBSS for å forberede en fungerende løsning (konsentrasjonsområde: 2,5-5 mm). Unngå lys og oksygen eksponering. Beskytt røret mot lys. Forbered denne løsningen før bruk. Ikke oppbevar eller gjenbruke denne løsningen. FORSIKTIG: Håndter molekylære prober under en avtrekkshette i overensstemmelse med godkjente retningslinjer.
  7. Lag 25 ml stoppløsning ved tilsetning av 10 ml føtalt bovint serum til 15 ml med PBS 1x. Hold løsning steril. Oppbevar denne løsningen ved 4 ° C. Denne løsningen er nødvendig bare for enkelt celle - ROS gjenkjenning metoden.
  8. Sett sebrafisk luft inkubator ved 28 &# 176; C.
  9. Sett sentrifuge ved 4 ° C i én celle ROS-påvisningsmetoden.

2. Mating av Adult Fishes og utvelgelse av sebrafisk embryo

  1. Set-up voksen sebrafisk par krysser henhold til standard protokoller 40. Velg den aktuelle transgene linjen i samsvar med spesifikke eksperimentelle behov.
  2. Samle egg og plassere dem i en 90-mm tallerken med fisk vann / embryo medium. Hold egg ved 28 ° C før embryo vil utvikle seg og vokse til ønsket utviklingsstadiet (f.eks 48 HPF, 72 HPF; HPF: timer etter befruktning).
  3. Screen for å utvikle embryoer. Ekskluder alle ubefruktede egg eller underutviklede embryoer.
  4. Anesthetize embryoer ved å tilsette 1 ml av Tricaine (stamløsning) i 50 ml vann fisk.
  5. Velg Tg fluorescerende embryoer under et stereomikroskop.

Tre. Behandling av embryo med oxidant Agent

  1. Bruk minst 30 embryoer mellom 48 hPF og 72 HPF per annen tilstand. Vask embryoer to ganger med fersk fisk vann for å fjerne Tricaine.
  2. Splitte fluorescerende embryoer i tre retter. Sett ikke mer enn 30 embryo / fatet.
  3. Fjerner vaskevannet og tilsett 10 ml av oksydant-løsning eller 10 ml av fisk vann som kontrolloppløsning.
  4. Inkuber embryoer for 10 min til 1 time ved 28 ° C. Inkubasjonstiden er avhengig av nivået på oksidativt stress til å bli indusert i spesifikke vev. Korte perioder er det beste som celler påvirkes av oksidativt stress gradvis gjennomgå celledød.
  5. Overføre embryo til en ny rett som inneholder HBSS og vaske embryoer ved å svinge. Forvarm HBSS ved 28 ° C.

4. Whole Mount ROS Detection Method

  1. Samle embryoer etter oxidant behandling og satt ikke mer enn ti embryoer i en liten tube. Rens med HBSS så mye som mulig. Beskytt røret fra lys ved hjelp av aluminiumsfolie.
  2. Tilsett 1 ml av ROS-deteksjon løsning forhvert rør.
  3. Inkuber embryoer i mørke i 15 min ved 28 ° C for å unngå lyseksponering.
  4. Under inkubasjonstiden forberede en glass-slide for hele embryoet analyse. Sett 300 mL av methylcellulose på en "depresjon" glass lysbilde og spre den på glassflaten med en pipette tips. Unngå bobler mens slippe methylcellulose.
  5. Ved slutten av inkubasjonstiden, umiddelbart fjerne ROS-deteksjon løsningen og vask to ganger med 2 ml HBSS. Vask embryoer ved å snu røret flere ganger. Ikke pipette eller vortex.
  6. Aspirer embryoer opp i et glass Pasteur pipette. Posisjons embryoer i nærheten av åpningen av pipette og forsiktig mate dem inn i metylcellulose. Orientere embryoene hensiktsmessig med en fin nylonsnor.
  7. Sammenlign fluorescens av kontroll embryoer med behandlede embryoer. Alternativt kan løse parametre av fluorescens stereomikroskop eller konfokal mikroskop slik at alle embryoer blir avbildet ved hjelp av det sammebildeinnstillinger.

5. Single Cell ROS-deteksjon Metode

  1. Starte fra trinn: 3,5. Sørg for å ha minst 35 embryoer for hver tilstand.
  2. Overfør embryo inn en ny matrett. Fjern fisk vann så mye som mulig. Tilsett 10 ml iskald PBS 1x og 400 mL av proteasehemmere Cocktail. Manuelt dechorionate embryoer med pinsett og fjern plommen sekk med en tynn nål. Merk: Fjerning av plommesekken sikrer rene prøver for følgende FACS analyse. Dette trinnet kan unngås ifølge FACS instrument.
  3. Overfør de-yolked embryo i en 24-brønns multiwell plate (15 embryoer / brønn) og fjerne all fisk vann.
  4. Legg 300 ul HBSS, 30 pl kollagenase P, 50 ul Trypsin-EDTA i hver brønn.
  5. Homogen embryoer ved å forsiktig pipettering opp og ned med et stramt pipettespissen (1000 mL).
  6. Inkuber ved 28 ° C i 20 min, og homogenisere prøvene ved å pipettere hver 5 min.
  7. Sjekk vev DISRuption ved å observere en alikvot av homogenatet ved sammensatt mikroskop. Tilrettelegge enkelt celle suspensjon ved pipettering. Ikke ruge embryoer for mer enn 30 min.
  8. Stopp reaksjonen ved å tilsette 200 mL av stoppløsning. Bland ved å pipettere forsiktig.
  9. Overfør cellesuspensjonen til en pre-kjølt rør med tett bunn. Hold røret på is og unngå lyseksponering.
  10. Sentrifuger i 5 min ved 250 xg ved 4 ° C.
  11. Fjern den øvre fase og re-suspendere celler med iskald HBSS ved forsiktig pipettering.
  12. Telle celler og sørg for at du har samme antall celler i alle prøvene. Ikke bruk mindre enn 2 x 10 6 celler.
  13. Sentrifuger cellene for 5 min ved 250 xg ved 4 ° C.
  14. Fjern supernatant og suspen pellet med 1 ml is-kjølt HBSS inneholdende ROS-følsom sonde.
  15. Inkuber røret ved romtemperatur i 3 min i mørket. Varier inkubasjonstid i henhold til nivået av oksidativt stress og til tHan sensitivitet i proben.
  16. Overfør cellene til en FACS rør. Hold rørene på is og unngå lyseksponering før FACS analyse.
  17. Sortere celler med en fluorescens-aktivert cellesorterer (FACS). Set bølgelengder i henhold til Tg vev fluorescens (f.eks GFP) og eksitasjon / utslipp spektra av molekylær probe brukes for ROS deteksjon (bl.a. bruk mitokondrie ROS-sensitive prober, generiske ROS-sensitive prober).
  18. For hver tilstand, måler alle prøver i det samme eksperimentelle sesjonen ved å anvende de samme FACS-innstillinger. Beregn prosentandelen av fluorescerende celler som gjennomsnittet av forskjellige biologiske replikater. Analyser minst to replikater for hver tilstand.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved å bruke den metoden her er beskrevet, kan vi enkelt måle og oppdage oksidativt stress (og ROS nivåer) i sebrafisk embryonale vev. Etter å ha krysset voksen sebrafisk, er egg innsamlet og lov til å utvikle seg på 28 ° C til 72 timer etter befruktning (HPF). For å indusere oksidativt stress, foreslår vi to ulike tilnærminger: 1) behandling av embryoer med sterke pro-oksiderende reagenser eller 2) å fremme ROS dannelse etter vevsskade.

I den første tilnærmingen, vi ansatt to forskjellige reagenser i henhold til de spesifikke behov: hydrogenperoksid (H 2 O 2), som den generiske celle ROS forming agent, og rotenon, som den spesifikke mitokondrie ROS driver. Rotenon er en hemmer av kompleks I i ETC, som dereguleringer er forårsakende av oksidativt stress 41..

I den andre fremgangsmåten, indusert vi akkumulering av ROS ved å skape et sår på halefinnen på en sebrafisk embryo39. Alternativt kan oksidativt stress forhold fremmes i sebrafisk vev ved å banke ned med morpholino injeksjon den Nrf2 antioksidant respons bane som er den primære cellular forsvaret mot de cytotoksiske effektene av oksidativt stress 38.

Når oksidativt stress er indusert i sebrafisk embryo, kan akkumulering av reaktive oksygen arter (ROS) måles ved hjelp av generiske eller mitokondrielle spesifikke ROS-sensitive prober, som blir selvlysende ved aktivering (dvs. oksidasjon).

Behandlede embryoene kan bli analysert ved å bruke hele fjellet ROS-påvisningsmetoden, eller ved å anvende en enkelt celle ROS påvisningsmetode som er oppsummert i figur 1. Valget mellom metodene er avhengig av behovet for å utføre kvalitativ eller kvantitativ måling av oksidativt stress. Representative resultater av begge metoder er representert i figur 2 Fig. 3.

Whole Mount ROS-deteksjon Metode

Fig. 2 viser anvendelsen av hele monterings ROS-deteksjon Fremgangsmåte for in vivo avbildning av det oksidative stress. Spesielt har denne metoden blitt brukt til å følge både "sterk" oksidativt stress generert av eksogene pro-oksiderende behandlinger samt "lav" oksidativt stress generert av flere fysiologiske tilstander som sår skader eller genet sletting.

Fysiologiske nivåer av oksidativt arter er indusert ved å generere en mikro skade eller et stort sår på halefinnen på en live sebrafisk embryo ved 72 HPF. Det har vist seg at etter skade, H 2 O 2 akkumulerer på sår margin 20 min etter at såret 39.. For å visualisere akkumulering av oksidativt stress på såret margin, ble embryoene ble inkubert med en generiskROS-sensitive probe og avbildes på 20 min etter såret 39. Ved å sammenligne intakte halefinnene med skadde haler, er det mulig å skille en oppsamling av den fluorescerende probe på såret margin (figur 2A). Ikke-spesifikk svak fluorescens-signalet blir detektert over hele halefinnen vev i begge tilstander.

For å validere den spesifikke opphopning av ROS-sensitive probe på såret margin, H 2 O 2 nivåer på såret har blitt senket av en farmakologisk tilnærming. Siden det er blitt vist at såret margin H 2 O 2 akkumulering er ekstremt følsomme for DUOX-inhibitor VAS2870 39, embryoene ble forbehandlet med denne inhibitor før såret. Sammenlikning av fluorescensen av ROS-følsom sonde, fra VAS pre-behandlede embryoer og respektive kontroller, angir at signalet er avhengig av ROS akkumulering (dvs. H to O to) (Figur 2B).

I tillegg genererte vi høye nivåer av oksidativt arter i sebrafisk vev ved å behandle sebrafisk embryo med rotenon. Rotenon-behandlet embryoer og kontroller ble inkubert med en generisk ROS-sensitive probe for spesifikt å påvise ROS arter. Etterpå ble sonden vasket ut, og embryoene ble fotografert under et fluorescens-stereomikroskop. Den oksidative stresset ble oppdaget i hele kroppen av embryoene (Figur 2C). Høye forstørrelse bilder viser anatomiske regioner hvor sonden er vellykket metaboliseres (figur 2D). Bright feltet bilder (øvre paneler) skille anatomiske strukturer, mens fluorescens bilder (nedre paneler) indikerer ROS-positive celler. Som vist av de fluorescerende bilder resultatene er hovedsakelig en kvalitativ rapport av oksidativt stress deteksjon, noe som oppnås ved å sammenligne kontrollen med behandlede embryoer.

Single Cell-ROS Detection Method

Figur 3 rapporter representative FACS plott og kvantifisering av oksidativt stress ved å bruke den enkelt celle ROS påvisningsmetode. Denne metoden har blitt tilpasset for å måle oksidativt stressnivå i sebrafisk celler som ble utsatt for pro-oksiderende forhold som rapportert i protokollen og detaljerte i figur legender. Som beskrevet har den oksidativt stress er målt ved inkubering av sebrafisk vev dissosiert til enkeltceller med en ROS-sensitive molekylær probe. Siden dissosiasjon prosedyren og FACS i seg selv kan forårsake celleskade, er analyse av prøver krever at bare "levende celler" er regnet for oksidativt stress kvantifisering. Følgelig er dissosiert celler analysert ved å velge brøkdel av celler som viser "levende celle" fysiske parametere (figur 3A) og ved å utelukke døde celler (Figur 3B). Dermed blir prøvene ble kvantifisert foroksidativt stress i henhold til fluorescensen av ROS-følsom sonde og for å vise en endogen fluorescens som positivitet for GFP (figur 3C). En negativ kontrollprøve for ROS-sensitive probe bør inkluderes for å evaluere oksidativt stress forårsaket av håndtering og tekniske prosedyrer (Figur 3C, panel: Control -). Relativ FACS tomten kvantifisering demonstrert i histogrammet viser målinger av ulike biologiske gjentak (Figur 3D-E).

Foruten oksidativt stress nivå kvantifisering på hydrogen peroxide behandlinger, har denne metoden blitt brukt til å kvantifisere oksidativt stressnivå innenfor fysiologiske forhold slike oss i nrf2a morphants og respektive kontroller (Figur 3F).

Videre, ved å kombinere den encellede ROS påvisning metode med spesifikke ROS-sensitive prober slike oss mitokondrie ROS-sensitive sonder, er det også mulig å måle oksidativt stress i sammenheng med spesifikke mitokondrier-rettet pro-oksiderende behandling (figur 3G).

Figur 1

Figur 1. Skjematisk figur av metoden for måling av ROS-nivåer i sebrafisk embryo. Sebrafisk voksne krysset i de aktuelle hekketanker. Befruktede egg blir deretter samlet inn retter og lagret ved 28 ° C for å tillate embryo til fullt ut å utvikle seg. Induksjon av oksidativt stress kan oppnås på forskjellige måter, enten ved farmasøytiske behandlinger, eller ved genetiske eller fysiske krenkelser. Alternativt, i tilfelle en genetisk mutant er analysert, er det mulig å hoppe over denne inkubasjon og gå videre. På dette punktet, er det mulig å fortsette å følge to forskjellige metoder. Ifølge "hele mount ROS-gjenkjenning "-metoden (til venstre), er sebrafisk embryo umiddelbart inkuberes med et fluorescerende ROS-sensitive probe (1) og deretter analysert med fluorescens eller konfokalmikroskop (2). I "enkeltcelle ROS-deteksjon"-metoden (høyre) blir sebrafisk embryoer dissosiert til enkeltceller (1), inkubert med en fluorescerende ROS-følsom sonde (2), og analysert ved hjelp av FACS for fluorescens påvisning og kvantifisering (3). Mens "hele fjellet-ROS gjenkjenning" metoden tillater påvisning oksidativt stress i levende embryoer primært som en kvalitativ analyse, "encellede basert metode" tilskudd både kvalitative og kvantitative målinger av oksidativt stressnivå.

Fig. 2
Figur 2. Representative resultater av hele fjellet ROS-gjenkjenning metoden. A) sebrafisk embryoer ved 72 HPF ble utsatttil såret som tidligere beskrevet av Niethammer et al., 2009 39.. Representative confocal bilder viser pro-oksidative arter (ROS) akkumulering (pilspiss) på såret margin av de sårede halefinnen. Oksidative arter har blitt oppdaget med det generiske ROS sonde (CellROX; 2,5 mikrometer) 20 min etter at såret har blitt gjort. Scale bar 20 mikrometer. B) Representative confocal bilder som viser sår margin på sebrafisk embryo ved 72 HPF. Embryoer ble forbehandlet med VAS2870 (20 uM) eller DMSO i 90 minutter før såret er blitt gjort. ROS har blitt oppdaget med en generisk ROS-sensitive probe (CellROX; 2,5 mikrometer) 20 min etter såret. Scale bar 20 mikrometer. C) Hele kroppen bilde som viser rotenon-indusert oksidativt stress i sebrafisk embryo. Oksidativ belastning er sterkt detektert i kaudal region av embryoene som er vist i panel D). Rotenon er en potent hemmer av mitokondrie ETC påvirker hovedsakelig skelETAL muskelceller i sebrafisk. Scale bar, 180 mikrometer.

Figur 3
Figur 3. Representative resultatene av enkeltceller ROS-gjenkjenning metoden. A) Representant FACS plott som viser et typisk eksempel på sebrafisk embryo dissosiert til enkeltceller. Levende celler er inngjerdet i R1-regionen i henhold til FSC-H og SSC-H parametere. SSC-H: 539 (Voltage), 1,0 (AmpGain), Mode: lineær; FSC-H:. E00 (Voltage), 2,1 (AmpGain) B) Representant FACS plott som viser et typisk eksempel på sebrafisk embryo dissosiert til enkeltceller. Før FACS-analyse, og prøven blitt inkubert med propidium jodid (PI, 1 pg / ml) i 5 min. Døde celler er inngjerdet på R2-regionen i henhold med PI fluorescens (FL2-H-kanal). FSC-H: E00 (Voltage), 2,1 (AmpGain), Mode: lineær, SSC-H: 539 (Voltage), 1,0 (AmpGain), Mode: linær. Spenning Kanaler: FL-2:. 613 Logg C) Representative FACS plott som viser dissociated sebrafisk embryo utsatt for pro-oksidanter behandling (H 2 O 2) og tilhørende kontroller. Endotelceller er visualisert av GFP-kanal. FACS tomter representerer alle celler påvirkes av oksidativt stress (ROS) på UL og UR. Negative celler er plottet på nedre kvadranter (LL og LR). Tg (Kdrl: GFP) s843 sebrafisk embryoer ved 48hpf ble inkubert med H 2 O 2 (2 mm) eller H 2 O som kontroll i 10 min. Før FACS-analyse, blir embryoer behandlet som beskrevet i protokollen. Celler som påvirkes av oksidativt stress er oppdaget ved hjelp av en generisk ROS-sensitive fluorescerende probe (CellROX; 2,5 mikrometer). Et eksempel ikke inkuberes med ROS-sensitive sonde har blitt inkludert som negativ kontroll. Sammenligning av prøven underkastet pro-oksydant behandling med den respektive kontroll, antall celler er plottet på øvre kvadranter (UL + UR) er høyere. FACS-regelverketition innstillinger var som følger: Spenning kanaler: FL-1: 582 Log; FL-4:. 410 Logg D) Histogram som viser prosentandelen av celler (UL + UR) påvirkes av oksidativt stress i H 2 O 2-behandlede embryoer og respektive kontroll. Målinger er knyttet til prøvene vist i C. Celler som påvirkes av oksidativt stress er oppdaget ved hjelp av en generisk ROS-sensitive fluorescerende probe (CellROX; 2,5 mikrometer). Resultatene er gjennomsnittet av n = 2 forskjellige biologiske replikat ± SD. E) Histogram som viser prosentandelen av endotelceller (GFP +) påvirkes av oksidativt stress (ROS +) i H 2 O 2-behandlede embryoer og respektive kontroll. Målinger er knyttet til prøvene vist i C. Resultatene er gjennomsnittet av n = 2 forskjellige biologiske replikat ± SD. F) Histogram som viser hvor stor prosentandel av celler påvirkes av oksidativt stress (ROS +) i nrf2a morphants (nrf2a MO) og respektive kontroller(Ctrl MO) ved 24 HPF. Resultatene er gjennomsnittet av n = 2 forskjellige biologiske gjentak ± SD G) Histogram som viser hvor stor prosentandel av celler påvirkes av mitokondrie oksidativt stress i behandlede embryoer (Rotenon;. 10 mikrometer) og respektive kontroller (Ctrl; DMSO) ved 72 HPF. Etter dissosiasjon av befruktede egg i enkeltceller, ble mitokondrie oksidativt stress (mitokondrie ROS +) målt med en mitokondrie spesifikk probe (MitoSOX, 5 mikrometer). Resultatene er gjennomsnittet av n = 3 forskjellige biologiske replikater ± SD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kritiske Steps

Fremgangsmåten for oksidativt stress deteksjon i sebrafisk embryoer beskrevet her består av to forskjellige metoder. Hele mount ROS-gjenkjenning metoden er i hovedsak en kvalitativ analyse for ROS-deteksjon, mens den enkelt celle ROS-gjenkjenning metoden gir mer spesifikke kvantitative målinger (figur 1). Begge metodene gir en rask og enkel måte å vurdere in vivo ROS-deteksjon på sebrafisk embryo. Men de begge presentere noen viktige skritt.

Kritiske trinn Relaterte til metode jeg

Den første metoden for hele fjellet ROS-deteksjon har den store fordelen for enkelt å oppdage oksidativt stress i alle vev i levende embryoer (figur 2). Imidlertid er det tre viktige kritiske aspekter som må tas i betraktning, og kan ha innflytelse på resultatet av analysen: 1) en permeabilitet av proben til embryo vev, 2) sonden toksisitet og 3) the probe følsomhet for lav ROS konsentrasjon.

Det første aspektet er spesielt relatert til in vivo anvendelse av fremgangsmåten 42. Den "celle-permeabilitet" eiendom av ROS-sensitive probe er en viktig funksjon for oppnåelse av denne analysen. Ideelt sett alle vannløselige kjemikalier er optimal for levering i levende sebrafisk embryo; Imidlertid har de fleste av de anvendte reagenser for oksidativt stress deteksjon er uløselige i vann. Således er det vanligvis anbefalt å bruke prober som er løselig i DMSO (dimetylsulfoksyd).

Det er mulige toksiske effekter på embryoer knyttet til konsentrasjonen av ROS probe. Bivirkninger er vanligvis representert med vevsskade (dvs. nekrose) eller akselerert metabolisme av sonden. Lange inkubasjoner (dager) av sebrafisk embryoer med hydroethidine probe årsak embryo døde, mens høye doser av 5 - (-og-6)-karboksy-2 ', 7'-Dichlorofluorescein diacetate resulterer i non-spesifikk akkumulering av fluorescensen i tarmen (upubliserte data). For å overvinne dette problemet er det viktig å overvåke embryoene i løpet av inkubasjon med proben. Tester av flere konsentrasjoner og tider av inkubering med samme probe ville være fordelaktig i tillegg. Den optimale inkubasjonstid tillater levering, og oksydasjon av den molekylære proben uten overflatisk vev skader. Inkubasjonstider ved anvendelse av kjemiske sonder (0,5-10 uM) kan generelt fast i området fra 10 til 30 min, og bør ikke overstige en time. Denne tilstanden kan være ganske vanskelig å sette opp, spesielt når mengden av oksyderende art er nær fysiologiske nivåer, eller når den er begrenset til innvendige embryonale vev. Faktisk, når en hel organisme blir inkubert med en ROS-deteksjon kjemisk sonde, den mest overfladiske vev (dvs. hud, øyne, og hjerte) er der sonden er hovedsakelig oksydert og blir fluorescent. Senere blir sonde progressivt levert til indre organer, lever eller vessels. Som en konsekvens av dette, er en passende tid for inkuberingen av sebrafisk embryoer med ROS-detektering av proben kritisk å detektere oksidativt stress i alle vev.

Til slutt, ved bruk av denne metoden er det viktig å ta hensyn til følsomheten av sonden til nivået av oksidativt stress uttrykt av vevet. De fleste av de kommersielt tilgjengelige prober ikke er fint karakterisert for deres følsomhet og dette betyr at den optimale sonde for bestemte applikasjoner, må bestemmes empirisk. Alle ROS-sensitive prober generelt oppdage høye nivåer av oksidativt stress, men de fleste av dem er ikke følsomme for minimale endringer av oksidativt stressnivå 43.

For å redusere denne ulempe og tillate en mer detaljert og nøyaktig analyse er det foreslått å anvende den andre metoden basert på enkeltceller påvisning av oksidativt stress.

Kritiske trinn Relaterte til metode II

Den single-celle ROS-gjenkjenning metoden presenterer noen viktige skritt. De er i hovedsak bestemt av 1) effektiviteten av embryoniske celle dissosiasjon og ved 2) den type ROS-følsomme sonde forbundet til analysen.

Denne dissosiasjon av befruktede egg til enkeltceller har blitt tilpasset fra tidligere protokoller for sebrafisk celleanalyse via strømningscytometri 44 og presenterer to kritiske aspekter som sterkt påvirker resultatet av hele prosedyren. Det første aspekt gjelder metoden som brukes for å dissosiere embryoer, mens den andre er relatert til utvinning av dissosierte celler.

Denne dissosiasjon av befruktede egg til enkeltceller er i hovedsak kontrollert ved konsentrasjonen av dissosiasjon reagenser (dvs. P kollagenase og trypsin). Det må imidlertid tas i betraktning at effektiviteten av vev dissosiasjon er avhengig av antallet embryoer inkubert og deres utviklingsstadiet. Sebrafisk embryo på tidligere utviklingsstadier (24 HPF-48 HPF) er mer fornuftig å dissosiasjon reagenser enn larver (96 HPF-120 HPF) på grunn av progressive vev vekst 45. Dermed blir justeringer i dissosiasjon prosedyre nødvendig når du arbeider med sebrafisk embryo på ulike utviklingsstadier enn 72 HPF. Overdreven inkubasjon med reagenser som fører til celledød, mens redusert konsentrasjon av reagenser som bare delvis dissosierer embryoene. Ettersom det er viktig å fullstendig disaggregate vev, er det like viktig å samle opp og ta vare på enkeltceller. En viktig faktor er den temperatur ved hvilken cellene er gjenopprettet etter at vevet divisjon. Det er viktig å opprettholde cellene på is eller ved 4 ° C ved sentrifugering for å begrense oksidativt stress sekundært for mekanisk forstyrrelse av vev eller håndteringsprosedyrer.

Den andre kritiske trinnet vedrørende den tilhørende sonde er koblet til analyse på et bestemt vev av interesse. Den enkleste måten å oppdage en celle populasjon i sebrafisk er tilbudt av det brede utvalget av transgene linjer som har blitt etablert de siste tiårene 46,47. Imidlertid fluorescensen av den valgte transgen linje må være kompatibelt med den ROS-detektering probe. Det er avgjørende for å unngå krysstale mellom bakgrunnen vev fluorescens og den lave, men spesifikk fluorescens-signalet som sendes ut av sonden.

Søknader av denne protokoll

Vurderer begge metodene gir en enkel og kostnadseffektiv analyse for å måle oksidativt stress in vivo, er det mulig å anvende denne protokollen til flere forhold:

Målinger av oksidativt stress i ulike genetiske (f.eks patologiske) Forhold

Oxidant og antioksidant gener kan lett moduleres i sebrafisk embryoer ved injeksjon av Morpholinos (tap-av-funksjon) eller mRNA (gain-of-funksjon). Nylig rapporterte eksperimenter av genet knock-down og microinjection av avkortet mRNA i sebrafisk embryo etablert ulike roller for antioksidant Nrf2a og Nrf2b gener i å beskytte celler mot oksidativt stress under utvikling. Tilnærminger av genuttrykk module vurderes et evolusjonært konservert aksen mellom pattedyr og sebrafisk til hypoksi respons og oksidativt stress i nerveceller 38,48. I tillegg er en flott mulighet til å studere oksidativt stress tilbys av flere sebrafisk mutant linjer. For eksempel, sebrafisk ducttrip (DTP) mutant representerer et interessant eksempel for karakterisering av oksidativt stress i forhold til en patologisk tilstand. Den dtp mutant bærer en mangel for den S-adenosylhomocystein hydrolase (ahcy) genet og dets karakterisering viste at tapet av Ahcy aktivitet forårsaker lever degenerasjon ved å påvirke nivåene ROS 49.. Ekvivalent, sebrafisk mutant Nrf2 fh318, bærer en tap-av-funksjonalitetn mutasjon av den transkripsjonelle faktor Nrf2 genet, er blitt betraktet med betydelig interesse for å undersøke den beskyttende rollen av denne antioksydant genet i lavere virveldyr 50.

Målinger av Redox State utløst av farmasøytiske forbindelser

Behandling av sebrafisk embryo med små midler kan hemme eller aktivere oksidativt stress. Vi har nylig viser at statin behandling av sebrafisk embryo indusert oksidativt stress som kan utvinnes av CoQ10 behandling 51. Alternativt analysen av oksidativt stress i sebrafisk dyremodell for menneske RYR1 relaterte myopatier fremhevet rollen som antioksidant narkotika NAC (N-acetyl cystein) som en potensiell terapeutisk tilnærming for muskelsykdom 52.

Large Scale Screening av små molekyler og narkotika for å karakterisere sin oxidative egenskaper

Sebrafisk er et veletablert dyr model for stor kjemisk screening. En nylig kjemisk screening av små molekyler som utføres i sebrafisk identifiserte antioksidanter som modulatorer av dopaminerge nevroner overlevelse, som er hardt rammet i pattedyr nevrodegenerative sykdommer som Parkinsons sykdom 53. Denne metoden kan bli brukt for screening av nye pro-eller anti-oxidant-molekyler in vivo.

Betydning og begrensninger

Den fremtredende av både "hele fjellet" og "encellede" ROS-deteksjonsmetoder er avhengig av evnen til å utføre in vivo målinger av oksidativt stress ved hjelp av enkle laboratorieteknikker og grunnleggende utstyr. Anvendelsen av sebrafisk som en dyremodell i kombinasjon med ROS-detekterende sonder gjør det mulig ikke bare den rene åpenbaringen av oksidativt stress, men også dets deteksjon i forbindelse med en levende organisme og kvantifisering på nivået av enkelt vev. Viktigere, kan disse analysene væreutført med kommersielt tilgjengelige verktøy og ikke krever spesifikk kompetanse for å bli realisert. I tillegg har begge metoder er ikke tidskrevende fremgangsmåter, og kan anvendes med passende tid til store sett av prøver. Alle sammen disse praktiske fordelene gjør disse metodene av særlig betydning for å forbedre oksidativt stress analyse in vivo.

Men disse prøvene viser også noen begrensninger. Generelt er de fleste ROS-sensitive sonder nå kommersielt tilgjengelige ikke vurderes for fine kvalitativ og kvantitativ analyse av oksidativt stress i levende celler. Den brukte hydroethidine og MitoSOX prober ble designet for sensing av superoksid (O 2 -.), Men nylig bekymringer om deres spesifisitet har vært reist, spesielt når du bruker fluorescens-baserte analyser 54. Analogt noen rapporter avanserte tvil om dichlorofluorescein diacetat (DCFH-DA) for eksklusive H 2 2 sensing 55,56. Videre har slike redoks-aktive fluorescerende prober er karakterisert ved partiell ikke-spesifikk aktivering (dvs. vev auto-fluorescens) og ikke er reversible etter oksidasjon. Når den fluorescerende probe oksyderes ved ROS den ikke kan komme tilbake til sin ikke-fluorescerende redusert tilstand. Følgelig påvisning av ROS svingninger med tidsmessig oppløsning er begrenset ved bruk av slike kjemiske prober 43.

En betydelig begrensning av denne banen er representert ved den manglende prober for eks RNS deteksjon. Nylig proteomic baserte metoder viste at RNS indusere proteinmodifiseringer som anses som biomarkører av nitroso-aktive stress og kan evalueres gjennom immunoblottingforsøk analyser ved hjelp av spesifikke antistoffer til protein oxidation / nitrering (for eksempel anti-SNO-cystein, anti-3- Nitrotyrosine) 22,23. Men alle disse analysene er kun indirekte målinger av oksidativt stress utløst av RNS og i de fleste tilfeller krever de cellulære ekstrakter, noe som betyr at de ikke er aktuelt for levende celler eller levende sebrafisk embryo.

En gyldig alternativ til konvensjonelle sonder er representert ved genetisk kodede redoks-følsomme fluorescerende proteiner. De viktigste bestanddelene av denne gruppen er: roGFP, avledet fra grønne fluorescerende proteiner, rxYFP og cpYFP, ​​begge avledet fra det gule fluorescerende protein og hyper sonde, en bestemt H 2 O 2-sensitive fluorescerende probe 57. Alle disse konstruerte redoks sonder skapt av fluorescerende proteiner tillate fluorescens-basert ratiometric kvantifisering og muliggjøre høyere tidsoppløsning (fra sekunder til minutter) enn kjemiske prober 58. In vivo anvendelse av disse biosensorer er også mulig som demonstrert av sebrafisk transgene linjen uttrykker HyPer for sanntids sensing av endogent H 2 O 2 nivåer 39,59. Jegmplementing sebrafisk med genetisk kodet sensorer tilbyr et optimalt system for å undersøke oksidativt stress, men krever å sette opp en transgene dyr linje og passende billed verktøy. Fremgangsmåten for oksidativt stress deteksjon i sebrafisk som presenteres her er mindre nøyaktig enn genetiske fremgangsmåter, men er rask og gir en primær test for in vivo deteksjon av høye nivåer av pro-oksidative arter. Nøyaktig måling av individuelle reaktive oksygen-og / eller nitrogenforbindelser er for tiden en grense på dette fagfelt. I fremtiden kan kommende nanoskala redoks-sensorer bidra til å løse dette problemet. Vellykket bruk av nanopartikler og nanorør basert redoks-sensorer har blitt testet i flere in vitro-studier, men ikke tilgjengelig som i vivo-tester til nå 60 år.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hydrogen peroxide solution SIGMA 516813 DO NOT STORE DILUITIONS
Hank's Balanced Salt Solution 1x GIBCO 14025
Methyl cellulose SIGMA M0387
Instant Ocean Aquarium Sea Salt Mixture INSTANT OCEAN SS15-10
Tricaine SIGMA A5040
Cgeneric ROS-sensitive probe: CellROX Deep Red Reagent INVITROGEN C10422
Mitochondria specific ROS-sensitive probe: MitoSOX  INVITROGEN M36008 dissolve one vial with 13 μl of DMSO
Hydroethidine INVITROGEN D23107
Rotenone SIGMA R8875 Prepare 5 mM stock solution in DMSO. 
Dimethyl sulfoxide SIGMA D2650
VAS2870; 3-Benzyl-7-(2-benzoxazolyl)thio-1,2,3-triazolo(4,5-d)pyrimidine EnzoLifeScience BML-EI395 dissolve the powder in DMSO; diluite in fish water
Propidium Iodide  Molecular probes
(Life Technologies)		 P3566
7-aminoactinomycin D (7-AAD)  Molecular probes
(Life Technologies)		 A1310
Nrf2a Morpholino GeneTools 5'-CATTTCAATCTCCAT
CATGTCTCAG-3'		 Ref: Timme-LaLaragy et al.; 2012 (PMID: 22174413); Kobayashi et al.; 2002 (PMID:12167159)
Collagenase P ROCHE 11213857001 Dissolve the powder at 100 mg/ml in sterile HBSS. Store aliquots at -20 °C
Phosphate-Buffered Saline (PBS) GIBCO 10010-056
Fetal Bovine Serum  GIBCO 10082-147
Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets ROCHE Dissolve one tablet in 1 ml of water
0.5% Trypsin-EDTA (10x), no phenol red GIBCO 15400-054 Prepare 1x working solution before usage
Compound microscope  ZEISS
Stereo microscope with fluorescent illumination Nikon AZ100
Camera ZEISS AxioCamMRm
software for fluorescence image acquisition ZEISS ZEN 2011
Fluorescence-activated cell sorter BD FACSCalibur
Centrifuge  Eppendorf 5417R
FACS tubes  BD 342065
Multiwell Plate  BD Falcon 353047
Sterilized, non treated Petri dishes 90 mm VWR 391-1915
Confocal microscope Leica Leica SP5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alfadda, A. A., Sallam, R. M. Reactive oxygen species in health and disease. J Biomed Biotechnol. 2012, (2012).
  2. Lu, T., Finkel, T. Free radicals and senescence. Exp Cell Res. 314, 1918-1922 (2008).
  3. Chen, A. F., et al. Free radical biology of the cardiovascular system. Clin Sci (Lond. 123, 73-91 (2012).
  4. Selvaraju, V., et al. Diabetes, oxidative stress, molecular mechanism, and cardiovascular disease--an overview. Toxicol Mech Methods. 22, 330-335 (2012).
  5. Gandhi, S., Abramov, A. Y. Mechanism of oxidative stress in neurodegeneration. Oxid Med Cell Longev. 2012, (2012).
  6. Shi, X., Zhang, Y., Zheng, J., Pan, J. Reactive oxygen species in cancer stem cells. Antioxid Redox Signal. 16, 1215-1228 (2012).
  7. Cui, X. Reactive oxygen species: the achilles' heel of cancer cells. Antioxid Redox Signal. 16, 1212-1214 (2012).
  8. Park, H., Bourla, A. B., Kastner, D. L., Colbert, R. A., Siegel, R. M. Lighting the fires within: the cell biology of autoinflammatory diseases. Nat Rev Immunol. 12, 570-580 (2012).
  9. Nathan, C., Ding, A. SnapShot: Reactive Oxygen Intermediates (ROI). Cell. 140, 951-951 (2010).
  10. Brown, G. C., Borutaite, V. Interactions between nitric oxide, oxygen, reactive oxygen species and reactive nitrogen species. Biochem Soc Trans. 34, 953-956 (2006).
  11. Brieger, K., Schiavone, S., Miller, F. J., Krause, K. H. Reactive oxygen species: from health to disease. Swiss Med Wkly. 142, (2012).
  12. Littarru, G. P., Tiano, L., Belardinelli, R., Watts, G. F. Coenzyme Q(10), endothelial function, and cardiovascular disease. Biofactors. 37, 366-373 (2011).
  13. Landete, J. M. Dietary intake of natural antioxidants: vitamins and polyphenols. Crit Rev Food Sci Nutr. 53, 706-721 (2013).
  14. Finkel, T. Oxidant signals and oxidative stress. Curr Opin Cell Biol. 15, 247-254 (2003).
  15. Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417, 1-13 (2009).
  16. Sarsour, E. H., Kumar, M. G., Chaudhuri, L., Kalen, A. L., Goswami, P. C. Redox control of the cell cycle in health and disease. Antioxid Redox Signal. 11, 2985-3011 (2009).
  17. Nathan, C., Shiloh, M. U. Reactive oxygen and nitrogen intermediates in the relationship between mammalian hosts and microbial pathogens. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 8841-8848 (2000).
  18. Finkel, T. Signal transduction by reactive oxygen species. J Cell Biol. 194, 7-15 (2011).
  19. Autreaux, B., Toledano, M. B. ROS as signalling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 813-824 (2007).
  20. Maryanovich, M., Gross, A. A ROS rheostat for cell fate regulation. Trends Cell Biol. 23, 129-134 (2013).
  21. Tonks, N. K. Redox redux: revisiting PTPs and the control of cell signaling. Cell. 121, 667-670 (2005).
  22. Antelmann, H., Helmann, J. D. Thiol-based redox switches and gene regulation. Antioxid Redox Signal. 14, 1049-1063 (2011).
  23. Foster, M. W., Hess, D. T., Stamler, J. S. Protein S-nitrosylation in health and disease: a current perspective. Trends Mol Med. 15, 391-404 (2009).
  24. Albrecht, S. C., Barata, A. G., Grosshans, J., Teleman, A. A., Dick, T. P. In vivo mapping of hydrogen peroxide and oxidized glutathione reveals chemical and regional specificity of redox homeostasis. Cell Metab. 14, 819-829 (2011).
  25. Knoefler, D., et al. Quantitative in vivo redox sensors uncover oxidative stress as an early event in life. Mol Cell. 47, 767-776 (2012).
  26. Fang, L., Miller, Y. I. Emerging applications for zebrafish as a model organism to study oxidative mechanisms and their roles in inflammation and vascular accumulation of oxidized lipids. Free Radic Biol Med. 53, 1411-1420 (2012).
  27. White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
  28. Amatruda, J. F., Patton, E. E. Genetic models of cancer in zebrafish. Int Rev Cell Mol Biol. 271, 1-34 (2008).
  29. Jing, L., Zon, L. I. Zebrafish as a model for normal and malignant hematopoiesis. Dis Model Mech. 4, 433-438 (2011).
  30. Shin, J. T., Fishman, M. C. From Zebrafish to human: modular medical models. Annu Rev Genomics Hum Genet. 3, 311-340 (2002).
  31. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
  32. Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Dev Cell. 21, 48-64 (2011).
  33. Duan, J., Yu, Y., Li, Y., Sun, Z. Cardiovascular toxicity evaluation of silica nanoparticles in endothelial cells and zebrafish model. Biomaterials. 34, 5853-5862 (2013).
  34. Sobrino-Figueroa, A. S. Evaluation of oxidative stress and genetic damage caused by detergents in the zebrafish Danio rerio (Cyprinidae). Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 165, 528-532 (2013).
  35. Xu, H., et al. Oxidative stress and immune related gene expression following exposure to di-n-butyl phthalate and diethyl phthalate in zebrafish embryos. Ecotoxicol Environ Saf. 93, 39-44 (2013).
  36. Hermann, A. C., Millard, P. J., Blake, S. L., Kim, C. H. Development of a respiratory burst assay using zebrafish kidneys and embryos. J Immunol Methods. 292, 119-129 (2004).
  37. Rieger, S., Sagasti, A. Hydrogen peroxide promotes injury-induced peripheral sensory axon regeneration in the zebrafish skin. PLoS Biol. 9, (2011).
  38. Timme-Laragy, A. R., et al. Nrf2b, novel zebrafish paralog of oxidant-responsive transcription factor NF-E2-related factor 2 (NRF2). J Biol Chem. 287, 4609-4627 (2012).
  39. Niethammer, P., Grabher, C., Look, A. T., Mitchison, T. J. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459, 996-999 (2009).
  40. Murphy, M. P., et al. Perspective. Cell Metabolism. 13 (4), 361-366 (2011).
  41. Li, N., et al. Mitochondrial complex I inhibitor rotenone induces apoptosis through enhancing mitochondrial reactive oxygen species production. J Biol Chem. 278, 8516-8525 (2003).
  42. Rhee, S. G., Chang, T. S., Jeong, W., Kang, D. Methods for detection and measurement of hydrogen peroxide inside and outside of cells. Mol Cells. 29, 539-549 (2010).
  43. Murphy, M. P., et al. Unraveling the biological roles of reactive oxygen species. Cell Metab. 13, 361-366 (2011).
  44. Covassin, L., et al. Global analysis of hematopoietic and vascular endothelial gene expression by tissue specific microarray profiling in zebrafish. Dev Biol. 299, 551-562 (2006).
  45. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
  46. Beis, D., Stainier, D. Y. In vivo cell biology: following the zebrafish trend. Trends Cell Biol. 16, 105-112 (2006).
  47. Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140, 2835-2846 (2013).
  48. Moussavi Nik, S. H., et al. The BACE1-PSEN-AbetaPP regulatory axis has an ancient role in response to low oxygen/oxidative stress. J Alzheimers Dis. 28, 515-530 (2012).
  49. Matthews, R. P., et al. TNFalpha-dependent hepatic steatosis and liver degeneration caused by mutation of zebrafish S-adenosylhomocysteine hydrolase. Development. 136, 865-875 (2009).
  50. Mukaigasa, K., et al. Genetic evidence of an evolutionarily conserved role for Nrf2 in the protection against oxidative stress. Mol Cell Biol. 32, 4455-4461 (2012).
  51. Mugoni, V., et al. Ubiad1 is an antioxidant enzyme that regulates eNOS activity by CoQ10 synthesis. Cell. 152, 504-518 (2013).
  52. Dowling, J. J., et al. Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy. Brain. 135, 1115-1127 (2012).
  53. Sun, Y., Dong, Z., Khodabakhsh, H., Chatterjee, S., Guo, S. Zebrafish chemical screening reveals the impairment of dopaminergic neuronal survival by cardiac glycosides. PLoS One. 7, (2012).
  54. Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radic Biol Med. 48, 983-1001 (2010).
  55. Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy. Free Radic Res. 44, 587-604 (2010).
  56. Karlsson, M., Kurz, T., Brunk, U. T., Nilsson, S. E., Frennesson, C. I. What does the commonly used DCF test for oxidative stress really show. Biochem J. 428, 183-190 (2010).
  57. Belousov, V. V., et al. Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nat Methods. 3, 281-286 (2006).
  58. Bjornberg, O., Ostergaard, H., Winther, J. R. Measuring intracellular redox conditions using GFP-based sensors. Antioxid Redox Signal. 8, 354-361 (2006).
  59. Yoo, S. K., Starnes, T. W., Deng, Q., Huttenlocher, A. Lyn is a redox sensor that mediates leukocyte wound attraction in vivo. Nature. 480, 109-112 (2011).
  60. Uusitalo, L. M., Hempel, N. Recent Advances in Intracellular and In Vivo ROS Sensing: Focus on Nanoparticle and Nanotube Applications. Int J Mol Sci. 13, 10660-10679 (2012).

Tags

Developmental Biology , Sebrafisk embryo endotelceller redoks staten analyse deteksjon oksidativt stress, FACS (fluorescens aktivert celle sorter) molekylære prober
Analyse av oksidativt stress i sebrafisk embryo
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mugoni, V., Camporeale, A., Santoro, … More

Mugoni, V., Camporeale, A., Santoro, M. M. Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (89), e51328, doi:10.3791/51328 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter