Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Analyse af oxidativt stress i zebrafisk embryoner

Published: July 7, 2014 doi: 10.3791/51328
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Molecular Biotechnology and Health Science, University of Torino, 2Laboratory of Endothelial Molecular Biology, Vesalius Research Center, VIB

Abstract

Høje niveauer af reaktive ilt arter (ROS) kan medføre en ændring i cellulær redox tilstand mod oxidativt stress tilstand. Denne situation medfører oxidation af molekyler (lipid, DNA, protein) og fører til celledød. Oxidativt stress påvirker også udviklingen af ​​en række patologiske tilstande som diabetes, retinopathier, neurodegeneration og kræft. Derfor er det vigtigt at definere redskaber til at undersøge oxidative stress betingelser ikke kun på niveauet af enkelte celler, men også i forbindelse med hele organismer. Her mener vi, at zebrafisk foster som en nyttig in vivo system til at udføre sådanne undersøgelser og præsentere en protokol til at måle in vivo oxidativ stress. Drage fordel af fluorescerende ROS sonder og zebrafisk transgene fluorescerende linjer, vi udvikler to forskellige metoder til at måle oxidativt stress in vivo: i) et "hel foster ROS-afsløring Method" til kvalitativ måling af oxidativt stress og ii) et "encellede ROS afsløring metode "for kvantitative målinger af oxidativ stress. Heri, vi påvise effekten af ​​disse procedurer ved at øge oxidativt stress i væv ved oxidant agenter og fysiologiske eller genetiske metoder. Denne protokol er modtagelig for forward genetiske skærme, og det vil bidrage til at løse årsagssammenhængen af ​​realkreditobligationer i dyremodeller af oxidative stress-relaterede sygdomme såsom neurologiske lidelser og kræft.

Introduction

Oxidativt stress er specifikt defineret som en tilstand, der skyldes en ubalanceret cellulær redox tilstand. De komplekse redox reaktioner, der rutinemæssigt opstår inde i cellerne bestemme den cellulære redox-tilstand. Redoxreaktioner består af alle kemiske reaktioner, der består i overførsel af elektroner mellem atomer af biologiske molekyler, der producerer reduktion og oxidation af molekyler (dvs. redox reaktioner). Disse reaktioner katalyseres af elektronisk aktiverede arter (dvs. pro-oxidative arter), der er karakteriseret ved en ekstrem strukturel ustabilitet og spontan aktivering af ubalancerede elektroner, der udveksler med nabolandene biomolekyler. Disse uregelmæssige reaktioner resultere i DNA-skader, protein carboxylering og lipid oxidation, og i sidste ende føre til celledød 1. Øgede niveauer af oxidativ stress har været forbundet med aldring og progression af forskellige patologiske tilstande 2. Oxidativ stress harblevet rapporteret til at være ansvarlig for vaskulære ændringer i diabetes og hjerte-kar-sygdomme 3,4. Det spiller også en afgørende rolle i neuronal degeneration i Alzheimers sygdom og Parkinsons sygdom 5.. Desuden har oxidativt stress blevet påvist som en kritisk faktor i styrende kræft progression og metastatiske begivenheder 6,7. Desuden kan inflammation og immunresponser fremkalde og yderligere støtte oxidativt stress 8.

I levende celler, der pro-oxidative arter stammer fra ilt (ROS, reaktive ilt arter) eller kvælstof (RNS, reaktive nitrogen arter). ROS indbefatter hydroxyl-radikal, superoxid anion (OH). (O 2 -) og hydrogenperoxid (H2O 2). Den primære RNS er lattergas (NO).. En række sekundære reaktive arter kan genereres ved spontane interaktioner between ROS og RNS eller frie metalioner 9. For eksempel superoxidanionen reagerer med nitrogenoxid for at danne peroxynitrate (ONOO -), mens H 2 O 2 reagerer med Fe2 + genererer hydroxylradikaler. ROS og RNS på grund af deres evne til at reagere med flere biomolekyler, betragtes en farlig trussel for opretholdelse af den fysiologiske redoxtilstand 10. For at opretholde redoxtilstanden celler er udstyret med en række afgiftende antioxidant molekyler og enzymer. Superoxid dismutase (SOD), katalase, glutathion-peroxidase og Peroxiredoxins væsentlige udgør antioxidanten enzymatisk-arsenal, der giver cellulære beskyttelse mod pro-oxidative arter herunder H 2 O 2, OH og Oono -. 11.. Også anti-oxidant molekyler som vitamin C og E, polyphenoler og CoenzymeQ10 (CoQ10) er af afgørende betydning at slukke ROS og deres farlige dederivater 12,13. Imidlertid er en overdreven produktion af ROS og RNS eller en dysfunktion i antioxidant-system, skifter cellulær redox-state mod oxidativ stress 14.

Udover deres negative konnotationer, kan ROS spille forskellige fysiologiske roller i celler af forskellig oprindelse. Celler producerer normalt ROS som signalmolekyler at mægle normale biologiske begivenheder såsom vært forsvar og sår reparation 15-17. Reaktive arter produceres normalt i celler ved intracellulære enzymer, såsom NOX (NADPH oxidase) og XO (Xantine Oxidase) som reaktion på signalering faktorer, vækstfaktorer og intracellulære udsving i calciumniveauer 18,19. Det er blevet rapporteret, at ROS differentielt kan modulere aktiviteten af vigtige nukleare faktorer, såsom p53 eller cellulære bestanddele, såsom ATM-kinase, en master regulator af respons på DNA-skade 20. Analogt ROS stor indflydelse cellulær signalering ved at formidle the oxidation og inaktivering af protein tyrosinphosphataser (PTP'er), der er etableret som kritiske regulatorer af signaltransduktion 21. Desuden proteom baserede metoder viser, at RNS også er ansvarlige for specifikke protein modifikationer og ændringer af molekylære signalering. RNS reagerer med cystein thiolgrupperne ændre dem i S-nitrothiols (SNO) og udløser molekylære veje samtidig med patologiske tilstande såsom inflammatoriske og autoimmune sygdomme 22,23.

Da celledyrkningsforsøg kun delvist gengive de mange faktorer, der handler in vivo, er det af stor interesse for at udføre redox studier i dyremodeller 24,25. For at opnå dette, har zebrafisk blevet betragtet som en passende hvirveldyr model til at studere oxidative stress dynamik 26. Zebrafisken er en ny model system, der giver flere fordele til at studere cellulære og genetiske begivenheder i hvirveldyr development og sygdom. Store klynger af embryoer kan genereres og ugenligt til forsøg behov. Desuden den ekstraordinære optisk klarhed af zebrafisk embryoner, samt deres lille størrelse, giver enkelt celle billedbehandling og dynamisk tracking i en hel organismer 27. I det sidste årti, har et betydeligt antal zebrafisk mutanter blevet genereret til at modellere humane patologiske tilstande som kræft og genetiske sygdomme 28-31. Vigtigst er det, har et væld af transgene linier blevet produceret til at tillade omfattende muligheder af genetiske og biologiske manipulationer 32. For eksempel er transgene vævsspecifikke zebrafisk linjer regelmæssigt anvendes til in vivo-undersøgelser. Disse linjer udtrykker et fluorescerende protein under kontrol af en udvalgt promotor, som giver mulighed for at identificere enkelte celler in vivo, såvel som den anatomiske struktur, de omfatter.

Adskillige toksikologiske undersøgelser har allerede brugt than-zebrafisk at vurdere in vivo-virkningen af kemikalier på redox homeostase, hvilket antyder egnetheden af denne hvirveldyr som en dyremodel for området for lægemiddelforskning og oxidativt stress 33-35. Selvom nogle fluorescerende prober er blevet testet til at overvåge oxidativt stress i zebrafisk larver 36,37, er der ingen etablerede assays at påvise og måle niveauet af oxidativt stress i zebrafisk væv og levende celler. Her beskriver vi en procedure for in vivo kvantificering af oxidativt stress i levende celler i zebrafisk embryoner. Billedbehandling værktøjer, FACS sortering, fluorescerende prober og pro-oxidative betingelser er alle sammen til at generere en simpel analyse til påvisning og kvantificering af oxidative arter i zebrafisk embryoner og væv.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Udarbejdelse af instrumenter og Arbejdsvilkårene Solutions

  1. Forbered fiskevand løsning. Lav en stamopløsning ved at opløse 2 g havsalt 'Instant Ocean' i 50 ml destilleret vand. Tilføj 1,5 ml af stock fisk vand til 1 L destilleret vand til fremstilling af klar til brug fisk vand (60 ug / ml havet salte slutkoncentration). Autoklaver den klar til brug fisk vand før brug. Denne opløsning anvendes som zebrafisk embryo medium.
  2. Forbered methylcellulose for embryo montering. 1,5 g methylcellulose opløses i 50 ml sterilt fisk vand. Lette opløsning ved hjælp af en magnet på opsigt plade. Den fuldstændige opløsning af pulveret kan kræve flere timer. Kontroller løsningen for klarhed og alikvot i små rør. Opbevar ved -20 ° C i flere måneder og tø portioner ved brug. Centrifuger methylcellulose ved 950 xg i 5 min før brug. Undgå fryse-tø-cyklusser af alikvoter.
  3. Forbered 50 ml tricaine / ethyl-3-aminobenzoat methansulfonat salt (stamopløsning) ved at opløse 200 mg tricaine i 100 ml vand og justere pH til 7,0 under anvendelse af Tris-HCI 1 M (pH 9). Opbevar denne bestand ved 4 ° C i højst 30 dage. ADVARSEL: tricaine er giftig. Anvendelse i overensstemmelse med passende retningslinjer håndtering.
  4. Induktion af oxidativt stress i zebrafisk embryoner
    1. Forbered en oxidant løsning for generisk oxidativt stress induktion: Lav 50 ml oxidant ved tilsætning af H 2 O 2 stamopløsning (hydrogenperoxid; 100 mM) til fiskevand. Brug H 2 O 2 i en slutkoncentration på mellem 2 mM og 100 uM. Denne opløsning fremstilles umiddelbart før brugen. Oxidanten løsning kan anvendes på både hele mount ROS-detektion og encellede ROS-metoder til påvisning. Opbevar ikke denne løsning. ADVARSEL: H 2 O 2 er farlig, og farlig ved indånding og ved indtagelse. Kontakt med brændbart materiale kan forårsage brand. Håndtag under en emhætte og bære passende pers.Onal værnemidler.
    2. Forbered en oxidant løsning til mitokondrier-afledt oxidativt stress induktion: Lav en oxidant stamopløsning (5 mM) ved at opløse 3,9 mg rotenone i 2 ml dimethylsulfoxid (DMSO). Denne opløsning opbevares ved stuetemperatur i mørke.
      1. Rotenon stamopløsning opløses i 10 ml af fisk vand for at lave en brugsklar opløsning. Brug rotenon ved en koncentration mellem 5-50 uM. Brug ikke rotenon ved koncentrationer højere end 100 uM. På passende koncentrationer kan denne oxidant løsning anvendes på både hele mount ROS-detektion og encellede ROS-metoder til påvisning. ADVARSEL: Rotenone er giftigt og farligt. Håndtag ifølge passende sikkerhedssætninger.
    3. Fremkald oxidativt stress ved gen knock-down: Knock-down nrf2a genekspression i zebrafisk embryoner morpholino mikroinjektion som tidligere rapporteret af Timme-Laragy A. m.fl. 2012 38...
    4. Fremkald oxidtive stress efter vævsskade: generere et sår margen på halefinnen af zebrafisk embryoner ved 72 HPF som tidligere beskrevet af Niethammer et al, 2009 39..
  5. Forbered 5 ml ROS-afsløring løsning til enkelt celle ROS-påvisningsmetode:
    1. Løsning til almindelig ROS afsløring: Opløs generiske ROS-følsomme molekylær sonde i HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) for at forberede en brugsopløsning (koncentrationsområde: 2,5-10 uM). Denne opløsning skal fremstilles umiddelbart før brugen.
    2. Opløsning til specifik påvisning ROS induceret af mitokondrier: Kort før brug opløses en mitokondrie ROS-følsomme sonde med DMSO gør en 5 mM stamopløsning. Stamopløsning i HBSS opløses i for at forberede en brugsopløsning (koncentrationsområde: 2,5-10 uM).
      BEMÆRK: Undgå lys og ilt eksponering af ROS-detektion arbejder løsninger, og deres respektive stamopløsninger. Beskyt røret mod lys ved hjælp afaluminiumsfolie. Må ikke opbevares eller genbrug sonder opløst i HBSS. Opbevar stamopløsninger ved -20 ° C i en måned.
      ADVARSEL: Håndter molekylære prober og DMSO under en emhætte i overensstemmelse med relevante retningslinjer.
  6. Forbered 5 ml ROS-afsløring løsning for hele mount ROS-detektion metode: generiske ROS-følsomme sonde stamopløsning (stabiliseret i DMSO) opløses i HBSS for at forberede en brugsopløsning (koncentrationsområde: 2,5-5 uM). Undgå lys og udsættelse for oxygen. Beskyt røret fra lys. Denne opløsning fremstilles før brug. Må ikke opbevares eller genbruge denne løsning. ADVARSEL: Håndter molekylære prober under en emhætte i overensstemmelse med relevante retningslinjer.
  7. Lav 25 ml stopopløsning ved tilsætning af 10 ml af oksefosterserum til 15 ml PBS 1x. Hold løsning steril. Opbevar denne løsning ved 4 ° C. Kræves denne løsning kun til enkelt celle - ROS påvisningsmetode.
  8. Indstil zebrafisk luftinkubator ved 28 &# 176; C.
  9. Indstil centrifuge ved 4 ° C for det indre celle ROS-påvisningsmetode.

2.. Parring af Voksen Fishes og udvælgelse af zebrafisk embryoner

  1. Set-up voksen zebrafisk par sender i overensstemmelse med standardprotokoller 40. Vælg den relevante transgene linje i overensstemmelse med specifikke eksperimentelle behov.
  2. Indsamle æg og placere dem i en 90 mm skål med fisk vand / embryo medium. Hold æg ved 28 ° C, indtil embryoer vil udvikle sig og vokse til den ønskede udviklingsstadiet (fx 48 HPF 72 HPF; HPF: timer efter befrugtning).
  3. Screen for udvikling af embryoner. Udelukke alle ubefrugtede æg eller underudviklede embryoner.
  4. Bedøver embryoner ved at tilsætte 1 ml tricaine (stamopløsning) i 50 ml fiskevand.
  5. Vælg Tg fluorescerende embryoner under et stereomikroskop.

3.. Behandling af embryoner med oxidant agent

  1. Brug mindst 30 fostre mellem 48 hpf og 72 HPF pr forskellig tilstand. Vask embryoner to gange med frisk fisk vand for at fjerne tricaine.
  2. Split fluorescerende embryoner i tre skåle. Put ikke mere end 30 fostre / parabol.
  3. Fjern vaskeopløsningen og tilsættes 10 ml af oxidanten opløsning eller 10 ml af fisk vand som kontrolopløsning.
  4. Inkuber embryoner til 10 min til 1 time ved 28 ° C. Inkubationstiden afhænger af niveauet af oxidativt stress at blive induceret i specifikke væv. Korte perioder er det bedste som celler ramt af oxidativ stress gradvist undergå celledød.
  5. Overfør embryoner i en ny skål indeholdende HBSS og vaske embryoner ved omrystning. Pre-varme HBSS ved 28 ° C.

4.. Hele Mount ROS Detection Method

  1. Saml embryoner efter oxidant behandling og sætte ikke mere end 10 embryoner i et lille rør. Skyl med HBSS så meget som muligt. Beskyt røret fra lys ved hjælp af aluminiumsfolie.
  2. Der tilsættes 1 ml ROS-afsløring løsning tilhvert rør.
  3. Inkubér embryoner i mørke i 15 minutter ved 28 ° C for at undgå lys.
  4. I inkubationstiden forberede en glasplade for hele embryo analyse. Put 300 pi methylcellulose på en "depression" objektglas og sprede det på glaspladen med en pipettespids. Undgå bobler mens slippe methylcellulose.
  5. Ved slutningen af ​​inkubationstiden, straks fjerne ROS-løsning til detektion og vaskes to gange med 2 ml HBSS. Vask embryoner ved at vende røret flere gange. Må ikke pipette eller vortex.
  6. Aspiratprøver embryoner op i et glas Pasteur-pipette. Position embryoner nær åbningen af ​​pipette og forsigtigt skubbe dem i methylcellulose. Orientere embryoner hensigtsmæssigt med en fin nylon linje.
  7. Sammenlign fluorescensen af ​​kontrol embryoer med behandlede embryoer. Alternativt fastsætte parametrene for fluorescens stereomikroskop eller konfokalt mikroskop, så alle embryoner afbildes under anvendelse af sammeimaging indstillinger.

5.. Single Cell ROS-afsløring Method

  1. Start fra trin: 3.5. Sørg for at have mindst 35 embryoner til hver tilstand.
  2. Overfør embryoner i en ny skål. Fjern fisk vand så meget som muligt. Der tilsættes 10 ml iskold PBS 1x og 400 pi proteasehæmmere Cocktail. Manuelt dechorionate embryoner med pincet og fjern blommen sæk med en fin nål. Bemærk: Hvis du fjerner æggeblomme sæk garanterer rene prøver for følgende FACS-analyse. Dette trin kan undgås ifølge FACS instrument.
  3. Overfør de-yolked embryoner i en 24-brønds multibrøndsplade (15 embryoner / godt), og fjern alle fisk vand.
  4. Der tilsættes 300 pi HBSS, 30 pi collagenase P, 50 pi trypsin-EDTA i hver brønd.
  5. Der homogeniseres embryoner ved forsigtigt at pipettere op og ned med en stram pipettespids (1.000 ul).
  6. Inkuber ved 28 ° C i 20 minutter og homogeniseres prøver ved pipettering hver 5 min.
  7. Tjek væv disruption ved at observere en portion af homogenat ved sammensat mikroskop. Lette enkelt celle suspension ved pipettering. Må ikke inkuberes embryoner til mere end 30 min.
  8. Reaktionen standses ved tilsætning af 200 pi Stop Solution. Bland ved pipettering forsigtigt.
  9. Overførsel cellesuspension i en forafkølet rør med tæt bund. Hold røret på is og undgå udsættelse for lys.
  10. Centrifuger i 5 minutter ved 250 xg ved 4 ° C.
  11. Fjern det øverste fase og re-suspendere cellerne med iskold HBSS ved forsigtigt at pipettere.
  12. Tæl celler og sørg for at have det samme antal celler i alle dine prøver. Brug ikke mindre end 2 x 10 6 celler.
  13. Centrifuger cellerne i 5 minutter ved 250 xg ved 4 ° C.
  14. Fjern supernatanten og suspendere pillen med 1 ml is afkølet HBSS indeholdende ROS-følsomme sonde.
  15. Inkuber røret ved stuetemperatur i 3 minutter i mørke. Variere inkubationstiden i henhold til niveauet af oxidativt stress og til than følsomhed af sonden.
  16. Overfør celler til FACS rør. Hold rørene på is og undgå lys eksponering før FACS-analyse.
  17. Sortere celler med et fluorescensaktiveret cellesorteringsapparat (FACS). Set bølgelængder i overensstemmelse med Tg væv fluorescens (f.eks GFP) og excitation / emission spektre af den molekylære sonde, der anvendes til ROS detektion (fx specifikke mitokondrie ROS-følsomme sonder, generiske ROS-følsomme sonder).
  18. For hver tilstand, måle alle prøver inden for den samme eksperimentelle session ved at anvende de samme FACS indstillinger. Procentdelen af ​​fluorescerende celler som middelværdien af ​​forskellige biologiske replikater. Analyser mindst to replikater for hver betingelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved at anvende den metode, der er beskrevet her, kan vi nemt måle og registrere oxidativt stress (og ROS-niveauet) i zebrafisk embryonale væv. Efter at have krydset voksen zebrafisk bliver æg opsamles og får lov at udvikle sig ved 28 ° C til 72 timer efter befrugtning (HPF). For at fremkalde oxidativ stress, foreslår vi to forskellige tilgange: 1) behandling af fostre med stærke pro-oxidant reagenser eller 2) at fremme ROS dannelse efter vævsskade.

I den første metode, vi ansat to forskellige reagenser i henhold til de specifikke behov: hydrogenperoxid (H 2 O 2), som den generiske cellulære ROS dannende middel, og rotenon, som den specifikke mitokondrie ROS driver. Rotenon er en hæmmer af komplekse I af ETC, som liberaliseringer er sygdomsfremkaldende for oxidativ stress 41.

I den anden fremgangsmåde, vi induceret akkumulering af ROS ved at skabe et sår på halefinnen af ​​en zebrafisk embryo39.. Alternativt kan fremmes oxidative stress betingelser i zebrafisk væv ved at banke ned med morpholino injektion Nrf2 antioxidant reaktion vej, der er den primære cellulære forsvar mod de cytotoksiske virkninger af oxidativt stress 38..

Når oxidativt stress induceres i zebrafisk embryoner kan måles ophobning af reaktive ilt arter (ROS) ved hjælp af generiske eller mitokondrie specifikke ROS-følsomme sonder, der bliver fluorescerende ved aktivering (dvs. oxidation).

Behandlede embryoner kan analyseres ved hjælp af hele mount ROS-detektion eller ved at anvende enkelt celle-ROS påvisningsmetode som opsummeret i figur 1.. Valget mellem metoder afhængig af behov for at udføre en kvalitativ eller kvantitativ måling af oxidativ stress. Repræsentative resultater af begge metoder er repræsenteret i figur 2 figur 3.

Hele Mount ROS-afsløring Method

Figur 2 viser anvendelsen af hele mount ROS-påvisningsmetode til in vivo billeddannelse af oxidativ stress. Især er denne fremgangsmåde blevet anvendt til at følge både "stærke" oxidativt stress genereret af exogene pro-oxidant behandlinger samt "lav" oxidativt stress genereret af flere fysiologiske betingelser, såsom sår skader eller gendeletion.

Fysiologiske niveauer af oxidative arter induceres ved at generere en mikro skade eller et bredt sår på halefinnen af ​​en levende zebrafisk embryo på 72 HPF. Det er blevet påvist, at efter skade, H 2 O 2 akkumuleres ved sårmargen 20 min efter at såret 39. For at visualisere akkumuleringen af ​​oxidativt stress på sårmargen blev embryoner inkuberet med et generiskROS-sensitive probe og afbildet ved 20 min efter sårdannelse 39. Ved at sammenligne intakte halefinnerne med sårede haler, er det muligt at skelne en akkumulering af fluorescerende probe ved sårmargen (figur 2A). Detekteres ikke-specifikke svage fluorescenssignal hele halefinnen væv i begge betingelser.

For at validere den specifikke akkumulering af ROS-følsomme sonde på såret margin, H 2 O 2 niveauer på såret er blevet sænket med en farmakologisk tilgang. Eftersom det er blevet påvist, at såret margin H 2 O 2 akkumulation er yderst følsom over for DUOX-inhibitor VAS2870 39, embryoer blev forbehandlet med denne inhibitor før såret. Sammenligning af fluorescensen af ROS-sensitive probe fra VAS forbehandlede embryoner og respektive kontrol indikerer, at signalet er afhængigt af ROS akkumulation (dvs. H 2 O 2) (Figur 2B).

Derudover har vi genererede høje niveauer af oxidative arter i zebrafisk væv ved at behandle zebrafisk embryoner med rotenon. Rotenon-behandlede embryoer og kontroller blev inkuberet med en generisk ROS-sensitive probe til specifik påvisning ROS arter. Bagefter blev sonden vasket ud og embryonerne blev afbildet under en fluorescens-stereomikroskop. Den oxidative stress blev opdaget i hele kroppen af embryonerne (Figur 2C). Stor forstørrelse billeder viser anatomiske regioner, hvor sonden er held metaboliseres (Figur 2D). Bright felt billeder (øverste paneler) skelne mellem anatomiske strukturer, mens fluorescens billeder (lavere paneler) angiver ROS-positive celler. Som det fremgår af de fluorescerende billeder resultaterne er hovedsagelig en kvalitativ rapport af oxidativt stress påvisning, som er opnået ved at sammenligne kontrol med behandlede embryoer.

Single Cell-ROS Detection Method

Figur 3 rapporter repræsentative FACS plots og kvantificering af oxidativ stress ved at anvende enkelt celle ROS påvisningsmetode. Denne metode er blevet tilpasset til at måle oxidative stressniveau i zebrafisk celler, der blev udsat for pro-oxidant betingelser som rapporteret i protokollen og udførligt beskrevet i figur legender. Som beskrevet, er den oxidative stress blevet målt ved at inkubere zebrafisk væv dissocieret i enkeltceller med ROS-sensitive molekylær probe. Da dissociation proceduren og FACS selv kan forårsage celleskader, analyse af prøver forudsætter, at kun "levende celler" anses for oxidativ stress kvantificering. Følgelig er dissocierede celler analyseres ved at vælge den fraktion af celler, der viser "levende celle" fysiske parametre (figur 3A) og ved at udelukke døde celler (figur 3B). Således er de prøver kvantificeres foroxidativt stressniveau ifølge fluorescensen af ROS-sensitive probe og til at vise en endogen fluorescens som positivitet for GFP (figur 3C). En negativ prøve for ROS-følsomme sonde kontrol bør medtages for at vurdere oxidativt stress fremkaldt af håndtering og tekniske procedurer (figur 3C panel: Control -). Relativ FACS plot kvantificering demonstreret i histogrammer, der viser målinger af forskellige biologiske gentagelser (Figur 3D-E).

Udover oxidativ stress-niveau kvantificering på hydrogenperoxid behandlinger har denne metode været anvendt til at kvantificere oxidative stressniveau inden for fysiologiske tilstande såsom os i nrf2a morphants og respektive kontroller (Figur 3F).

Desuden ved at kombinere den encellede ROS påvisningsmetode med specifikke ROS-følsomme sonder sådanne os mitokondrie ROS-følsomme prober, er det også muligt at måle oxidativ stress i forbindelse med specifikke mitokondrier målrettet pro-oxidant-behandlinger (figur 3G).

Figur 1

Figur 1.. Skematisk figur af metode til måling af ROS niveauer i zebrafisk embryoner. Zebrafisk voksne krydset i de relevante avls tanke. Befrugtede æg bliver derefter samlet i skåle og opbevaret ved 28 ° C for at tillade foster for at udvikle. Induktion af oxidativt stress kan opnås på forskellige måder, enten ved farmaceutiske behandlinger eller af genetiske eller fysiske fornærmelser. Alternativt, i tilfælde af en genetisk mutant analyseres, er det muligt at springe denne inkubation og bevæge sig fremad. På dette tidspunkt er det muligt at gå efter to forskellige metoder. Ifølge "hele mount ROS-afsløring "-metoden (til venstre), er zebrafisk embryoner straks inkuberes med et fluorescerende ROS-følsomme sonde (1) og derefter analyseret med fluorescens eller konfokal mikroskop (2). I "enkelt celle ROS-detektion"-metoden (til højre), er zebrafisk embryoner dissocieres til enkeltceller (1), inkuberet med et fluorescerende ROS-sensitive probe (2) og analyseret ved FACS til fluorescens detektion og kvantificering (3). Mens "hele mount-ROS afsløring" metode giver oxidativt stress detektion i levende embryoner primært som en kvalitativ analyse, "encellede baserede" metode tilskud både kvalitative og kvantitative målinger af oxidative stressniveau.

Figur 2
Figur 2.. Repræsentative resultaterne af hele mount ROS-påvisningsmetode. A) Zebrafisk embryoner ved 72 HPF blev udsatsårdannelse som tidligere beskrevet af Niethammer et al., 2009 39. Repræsentant konfokal billeder viser pro-oxidative arter (ROS) akkumulation (pilespids) på såret margen af sårede halefinnen. Blevet påvist Oxidative art med den generiske ROS probe (CellROX; 2,5 uM) 20 min efter at såret er foretaget. Scale bar 20 um. B) Repræsentant konfokal billeder, der viser sår margin zebrafisk embryoner ved 72 HPF. Embryoer blev forbehandlet med VAS2870 (20 uM) eller DMSO i 90 minutter, før såret er foretaget. ROS er blevet opdaget med en generisk ROS-følsomme sonde (CellROX, 2,5 uM) 20 min efter sår. Scale bar 20 um. C) Hele kroppen billede, der viser rotenon-induceret oxidativt stress i zebrafisk embryoner. Oxidativ stress kraftigt detekteret i den kaudale område af embryoner som vist i panel D). Rotenon er en potent hæmmer af mitokondrie ETC påvirker primært skelEtal muskelceller i zebrafisk. Scale bar, 180 pm.

Figur 3
Figur 3.. Repræsentative resultater af de enkelte celler ROS-påvisningsmetode. A) Repræsentant FACS plot viser en typisk prøve af zebrafisk embryoner dissocieret til enkelte celler. Levende celler er gated i R1 regionen i henhold til FSC-H og SSC-H-parametre. SSC-H: 539 (spænding), 1.0 (AmpGain) Mode: lineær; FSC-H:. E00 (spænding), 2,1 (AmpGain) B) Repræsentant FACS plot viser en typisk prøve af zebrafisk embryoner dissocieret til enkelte celler. Før FACS-analyse, er prøven inkuberet med propidiumiodid (PI, 1 ug / ml) i 5 min. Døde celler er gated på R2 regionen i henhold til PI-fluorescens (FL2-H-kanal). FSC-H: E00 (spænding), 2,1 (AmpGain) Mode: lineær, SSC-H: 539 (spænding), 1.0 (AmpGain) Mode: linær. Spænding Channels: FL-2:. 613 Log C) Repræsentative FACS plots viser dissocieret zebrafisk embryoner udsat for pro-oxidant behandling (H 2 O 2) og de ​​respektive kontroller. Endotelceller visualiseres ved GFP kanal. FACS plots repræsenterer alle celler er berørt af oxidativt stress (ROS) på UL og UR. Negative celler afbildes på lavere kvadranter (LL og LR). Tg (Kdrl: GFP) s843 zebrafisk embryoner på 48hpf blev inkuberet med H 2 O 2 (2 mM) eller H 2 O som kontrol i 10 min. Før FACS-analyse, der embryoer behandlet som beskrevet i protokollen. Celler, der er berørt af oxidativ stress detekteres ved hjælp af en generisk ROS-følsomme fluorescerende probe (CellROX, 2,5 uM). En prøve ikke inkuberet med ROS-følsomme sonde er medtaget som negativ kontrol. Sammenligning af prøven underkastet pro-oxidant behandling med den respektive kontrol antallet af celler afbildet på de øverste kvadranter (UL + UR) større. FACS-reglerneition indstillinger var som følger: Spænding kanaler: FL-1: 582 Login; FL-4:. 410 Log D) Histogram viser procentdelen af celler (UL + UR), der berøres af oxidativ stress i H 2 O 2-behandlede embryoner og respektive kontrol. Målinger er relateret til prøver, der er vist i C. Celler, der er berørt af oxidativ stress detekteres ved hjælp af en generisk ROS-følsomme fluorescerende probe (CellROX, 2,5 uM). Resultaterne er gennemsnittet af n = 2 forskellige biologiske replikater ± SD. E) Histogram, der viser procentdelen af endotelceller (GFP +) påvirket af oxidativt stress (ROS +) i H 2 O 2-behandlede embryoer og den respektive kontrol. Målinger er relateret til prøver, der er vist i C. Resultaterne er gennemsnittet af n = 2 forskellige biologiske gentagelser ± SD. F) histogram, der viser procentdelen af celler ramt af oxidativ stress (ROS +) i nrf2a morphants (nrf2a MO) og respektive kontroller(Ctrl MO) ved 24 HPF. Resultaterne er gennemsnittet af n = 2 forskellige biologiske replikater ± SD G) Histogram, der viser procentdelen af celler påvirket af mitokondriel oxidativ stress i behandlede embryoer (Rotenon. 10 uM) og de ​​respektive kontroller (Ctrl; DMSO) ved 72 HPF. Efter dissociation af embryoner i enkelte celler blev mitokondriel oxidativ stress (mitokondrie ROS +) målt med en mitochondrial specifik probe (MitoSOX, 5 uM). Resultaterne er gennemsnittet af n = 3 forskellige biologiske replikater ± SD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kritiske trin

Proceduren for oxidativt stress detektion i zebrafisk embryoner beskrevet heri omfatter to forskellige metoder. Hele mount ROS-påvisningsmetode er primært en kvalitativ analyse for ROS-detektion, mens enkelt celle ROS-detektionsmetode giver mere specifikke kvantitative målinger (figur 1). Begge metoder giver en hurtig og nem måde at vurdere in vivo ROS-afsløring på zebrafisk embryoner. Men de begge præsentere nogle kritiske trin.

Kritiske trin Relateret til metode I

Den første metode til hele mount ROS-detektion har den store fordel for nemt at detektere oxidativt stress i alle væv af levende embryoner (figur 2). Men der er tre vigtige kritiske aspekter, der skal overvejes, og kan påvirke resultatet af analysen: 1) permeabilitet af sonden til embryo væv, 2) sonden toksicitet og 3) the sonde følsomhed for lav ROS koncentration.

Det første aspekt er specifikt relateret til in vivo anvendelse af metoden 42.. Den "celle-permeabilitet" ejendom ROS-følsomme sonde er et væsentligt element for opnåelsen af ​​denne analyse. Ideelt set alle vandopløselige kemikalier er optimale til levering i levende zebrafisk embryoner; men de fleste af reagenser til oxidativt stress detektion er uopløselige i vand. Således er det normalt anbefales at bruge sonder, der er opløselige i DMSO (dimethylsulfoxid).

Der er mulige toksiske virkninger på fostre i forbindelse med koncentrationen af ​​ROS proben. Bivirkninger er normalt repræsenteret af vævsskader (dvs. nekrose) eller accelereret metabolisme af sonden. Lange inkubationer (dage) i zebrafisk embryoner med hydroethidine probe årsag fosterdød, mens høje doser af 5 - (and-6)-carboxy-2 ', 7'-dichlorfluorescein-diacetat resultater i nden specifikke akkumulering af fluorescens i tarmen (upublicerede data). For at overvinde dette problem er det vigtigt at overvåge embryoner under inkubationen med proben. Test af flere koncentrationer og inkubationstider med samme probe ville være gavnligt så godt. Den optimale inkuberingstid tillader levering og oxidation af den molekylære probe uden overfladiske væv skader. Inkubationstider anvendelse af kemiske prober (0,5-10 uM) kan almindeligvis fastsat i intervallet 10-30 min og bør ikke overstige 1 time. Denne tilstand kan være ganske vanskelig at etablere, især når mængden af ​​oxidative arter er tæt på fysiologiske niveauer, eller når det er begrænset til interne embryonale væv. Faktisk, når en hel organisme inkuberes med en ROS-afsløring kemisk sonde, de mest overfladiske væv (dvs. hud, øjne og hjerte) er der, hvor sonden er primært oxideres og bliver fluorescerende. Senere er proben gradvis leveret til indre organer, lever eller vessels. Som følge heraf et passende tidspunkt for inkubation af zebrafisk embryoner med ROS-påvisning sonde er kritisk at detektere oxidativt stress i alle væv.

Endelig, når anvendelse af denne metode er det vigtigt at overveje følsomheden af ​​probe til niveauet af oxidativt stress udtrykt ved væv. De fleste af de kommercielt tilgængelige prober ikke fint karakteriseret for deres følsomhed, og det betyder, at den optimale probe til specifikke anvendelser skal bestemmes empirisk. Alle ROS-følsomme sonder generelt finde høje niveauer af oxidativ stress, men de fleste af dem er ikke følsomme over for minimale forskydninger af oxidative stressniveau 43.

For at begrænse denne ulempe og give en mere detaljeret og præcis analyse foreslås det at anvende den anden metode baseret på enkelte celler påvisning af oxidativ stress.

Kritiske trin Relateret til metode II

Den sIngle-celle ROS-påvisningsfremgangsmåde præsenterer nogle kritiske trin. De er hovedsageligt bestemt af 1) effektiviteten af ​​embryocelle dissociation og 2) typen af ​​ROS-sensitive probe forbundet til assayet.

Adskillelsen af embryoner i enkelte celler er blevet tilpasset fra tidligere protokoller for zebrafisk celle analyse via flowcytometri 44 og præsenterer to kritiske aspekter som stærkt påvirke resultatet af hele proceduren. Det første aspekt angår den metode, der bruges til at adskille embryoner, mens det andet er relateret til genopretning af dissocierede celler.

Adskillelsen af embryoner i enkelte celler er primært styret af koncentrationen af dissociation reagenser (dvs. collagenase P og trypsin). Det skal imidlertid tages i betragtning, at effektiviteten af ​​væv dissociation er afhængig af antallet af embryoner inkuberet og deres udviklingsstadium. Zebrafisk embryoner på tidligere udviklingsstadier (24 hpf-48 HPF), er mere fornuftigt at dissociation reagenser end larver (96 HPF-120 HPF) på grund af progressive væv vækst 45. Således er justeringer i dissociation procedure, der kræves ved arbejde med zebrafisk embryoner på forskellige udviklingsstadier end 72 HPF. Overdreven inkubation med reagenser forårsager celledød, mens reduceret koncentration af reagenser kun delvist dissocieres embryoner. Da det er vigtigt at rette disaggregere væv, er det lige så vigtigt at indsamle og bevare enkeltceller. En vigtig overvejelse er den temperatur, hvor cellerne genvindes efter væv division. Det er vigtigt at opretholde celler på is eller ved 4 ° C under centrifugering for at begrænse den oxidative stress sekundært til mekanisk ødelæggelse af væv eller håndteringsprocedurer.

Det andet kritiske trin i forbindelse med tilhørende sonde er knyttet til analyse på et specifikt væv af interesse. Den nemmeste måde at opdage en celle population i zebrafisk udbydes af den brede vifte af transgene linjer, der er blevet etableret i de seneste årtier 46,47. Imidlertid fluorescensen af ​​den valgte transgen linje skal være forenelige med ROS-påvisning sonde. Det er afgørende at undgå cross-talk mellem baggrund væv fluorescens og den lave, men specifik fluorescens signal, der udsendes af sonden.

Anvendelser af denne protokol

Overvejer begge metoder tilbyder en nem og omkostningseffektiv assay til måling af oxidativt stress in vivo, er det muligt at anvende denne protokol til flere forhold:

Målinger af oxidativt stress i forskellige genetiske (f.eks patologiske) Betingelser

Oxidant og antioxidant gener kan let moduleres i zebrafisk embryoner ved injektion af morpholinos (tab af funktion) eller mRNA (gain-of-funktion). Nyligt rapporterede forsøg med gen knock-down og microinfremskrivningen af ​​det udjævnede mRNA i zebrafisk embryoner etableret forskellige roller for de antioxidant Nrf2a og Nrf2b gener i at beskytte celler fra oxidativ stress under udvikling. Tilgange af genekspression modulation vurderede en evolutionær bevaret akse mellem pattedyr og zebrafisk til hypoxi respons og oxidativt stress i neuronale celler 38,48. Desuden er en stor mulighed for at studere oxidativt stress tilbydes af flere zebrafisk mutant linjer. For eksempel zebrafisk ducttrip (DTP) mutant udgør et interessant eksempel til karakterisering af oxidativ stress i forbindelse med en patologisk tilstand. DTP mutant bærer en mangel for S-adenosylhomocysteinhydrolase (ahcy) gen og dets karakterisering viste, at tabet af Ahcy aktivitet forårsager leverkræft degeneration ved at påvirke ROS niveauet 49. Ækvivalent, zebrafisk mutant Nrf2 fh318, bærer en tab af function mutation af transskriptionsfaktor Nrf2 genet er blevet betragtet med stor interesse for at undersøge den beskyttende rolle i denne antioxidant gen i lavere hvirveldyr 50.

Målinger af Redox stat udløst af farmaceutiske forbindelser

Behandling af zebrafisk embryoner med små stoffer kan hæmme eller aktivere oxidativ stress. Vi har for nylig viser, at statin behandling af zebrafisk embryoner induceret oxidativt stress, der kan inddrives ved CoQ10 behandling 51.. Alternativt analyse af oxidativt stress i zebrafisk dyremodel for humane RYR1-relaterede myopatier fremhævet rolle antioxidant stof NAC (N-acetyl cystein) som en potentiel terapeutisk tilgang til muskelsygdom 52..

Large Scale Screening af små molekyler og narkotika til at karakterisere deres Oxidative Properties

Zebrafisken er en veletableret dyr model for store kemiske screening. En nylig kemisk screening af små molekyler, der udføres i zebrafisk identificeret antioxidanter som modulatorer af dopaminerge neuroner overlevelse, der er alvorligt ramt i pattedyrs neurodegenerative sygdomme som Parkinsons sygdom 53.. Denne metode kan anvendes til screening for nye pro-eller anti-oxidant molekyler in vivo.

Betydning og begrænsninger

Den fremtrædende af både "hel mount" og "single-celle" ROS-påvisningsmetoder er afhængig af evnen til at udføre in vivo målinger af oxidativt stress ved hjælp af simple laboratorieteknikker og basisudstyr. Anvendelsen af ​​zebrafisk som dyremodel i kombination med ROS-påvisning prober ikke kun giver den blotte åbenbaring af oxidativ stress, men også dets detektering i forbindelse med en levende organisme og kvantificering på niveauet af enkelte væv. Vigtigere, kan disse assays væreudføres med kommercielt tilgængelige værktøjer og ikke kræver særlig ekspertise at blive realiseret. Desuden har begge metoder ikke tidskrævende procedurer og kan anvendes med passende tid til store sæt af prøver. Alt sammen disse praktiske fordele gør disse metoder af særlig betydning for at forbedre oxidativt stress analyse in vivo.

Men disse analyser viser også nogle begrænsninger. Generelt er de fleste ROS-følsomme sonder nu kommercielt tilgængelige ikke værdsat for fine kvalitativ og kvantitativ analyse af oxidativ stress niveauer i levende celler. Den almindeligt anvendte hydroethidine og MitoSOX sonder var designet til sansning af superoxid (O 2 -.), Men for nylig bekymringer deres specificitet er blevet rejst, især ved anvendelse af fluorescens-baserede assays 54. Analogt nogle rapporter avancerede tvivl om dichlorfluorescein diacetat (DCFH-DA) for eksklusiv H 2 2 sensing 55,56. Desuden er disse redox-aktive fluorescerende prober er karakteriseret ved en delvis ikke-specifik aktivering (dvs. væv auto-fluorescens) og er ikke reversibel efter oxidation. Når den fluorescerende probe oxideres af ROS det ikke kan komme tilbage til sin ikke-fluorescerende reduceret tilstand. Derfor påvisning af ROS udsving med tidsmæssige opløsning er begrænset af anvendelsen af sådanne kemiske prober 43.

En betydelig begrænsning af dette felt er repræsenteret ved manglen på sonder til eksklusiv RNS detektion. For nylig, proteom baserede metoder viste, at RNS fremkalde protein modifikationer, der betragtes som biomarkører for nitroso-aktiv stress og kan evalueres via immunoblotting assays ved hjælp af specifikke antistoffer til protein oxidation / nitrering (fx anti-SNO-cystein, anti-3- nitrotyrosin) 22,23. Men alle disse assays er kun indirekte målinger af oxidativ stress udløst af RNS og i de fleste tilfælde kræver de cellulære ekstrakter, hvilket betyder, at de ikke finder anvendelse på levende celler eller levende zebrafisk embryoner.

Et brugbart alternativ til konventionelle sonder er repræsenteret ved genetisk kodede redox følsomme fluorescerende proteiner. De vigtigste bestanddele af denne gruppe er: roGFP, der stammer fra grønt fluorescerende proteiner, rxYFP og cpYFP begge afledt af gult fluorescerende protein og Hyper sonden en specifik H 2 O 2-sensitive fluorescerende probe 57. Alle disse manipulerede redox prober skabt af fluorescerende proteiner tillader fluorescens-baserede ratiometrisk kvantificering og muliggøre højere tidsopløsning (fra sekunder til minutter) end kemiske prober 58. In vivo anvendelse af disse biosensorer er også muligt som vist ved zebrafisk transgene linje udtrykker Hyper for real-time sensing af endogent H 2 O 2 etager 39,59. Jeggennemførelsesretsakter den zebrafisk med genetisk kodede sensorer tilbyder en optimal system til at undersøge oxidativ stress, men kræver etablering af en transgen dyr linje og hensigtsmæssige billeddiagnostiske værktøjer. Proceduren for oxidativt stress opdagelse i zebrafisk præsenteres her, er mindre præcise end genetiske metoder, men er hurtig og giver en primær assay til in vivo detektion af høje niveauer af pro-oxidative arter. Nøjagtig måling af individuel reaktive oxygen og / eller nitrogen arter er i øjeblikket en grænse for dette forskningsfelt. I fremtiden kan de kommende nanostørrelse redox-sensorer bidrage til at løse dette problem. Den vellykkede anvendelse af nanopartikler og nanorør baseret redox-sensorer er blevet testet i flere in vitro-undersøgelser, men ikke tilgængelig som in vivo-analyser indtil nu 60 år.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hydrogen peroxide solution SIGMA 516813 DO NOT STORE DILUITIONS
Hank's Balanced Salt Solution 1x GIBCO 14025
Methyl cellulose SIGMA M0387
Instant Ocean Aquarium Sea Salt Mixture INSTANT OCEAN SS15-10
Tricaine SIGMA A5040
Cgeneric ROS-sensitive probe: CellROX Deep Red Reagent INVITROGEN C10422
Mitochondria specific ROS-sensitive probe: MitoSOX  INVITROGEN M36008 dissolve one vial with 13 μl of DMSO
Hydroethidine INVITROGEN D23107
Rotenone SIGMA R8875 Prepare 5 mM stock solution in DMSO. 
Dimethyl sulfoxide SIGMA D2650
VAS2870; 3-Benzyl-7-(2-benzoxazolyl)thio-1,2,3-triazolo(4,5-d)pyrimidine EnzoLifeScience BML-EI395 dissolve the powder in DMSO; diluite in fish water
Propidium Iodide  Molecular probes
(Life Technologies)		 P3566
7-aminoactinomycin D (7-AAD)  Molecular probes
(Life Technologies)		 A1310
Nrf2a Morpholino GeneTools 5'-CATTTCAATCTCCAT
CATGTCTCAG-3'		 Ref: Timme-LaLaragy et al.; 2012 (PMID: 22174413); Kobayashi et al.; 2002 (PMID:12167159)
Collagenase P ROCHE 11213857001 Dissolve the powder at 100 mg/ml in sterile HBSS. Store aliquots at -20 °C
Phosphate-Buffered Saline (PBS) GIBCO 10010-056
Fetal Bovine Serum  GIBCO 10082-147
Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets ROCHE Dissolve one tablet in 1 ml of water
0.5% Trypsin-EDTA (10x), no phenol red GIBCO 15400-054 Prepare 1x working solution before usage
Compound microscope  ZEISS
Stereo microscope with fluorescent illumination Nikon AZ100
Camera ZEISS AxioCamMRm
software for fluorescence image acquisition ZEISS ZEN 2011
Fluorescence-activated cell sorter BD FACSCalibur
Centrifuge  Eppendorf 5417R
FACS tubes  BD 342065
Multiwell Plate  BD Falcon 353047
Sterilized, non treated Petri dishes 90 mm VWR 391-1915
Confocal microscope Leica Leica SP5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alfadda, A. A., Sallam, R. M. Reactive oxygen species in health and disease. J Biomed Biotechnol. 2012, (2012).
  2. Lu, T., Finkel, T. Free radicals and senescence. Exp Cell Res. 314, 1918-1922 (2008).
  3. Chen, A. F., et al. Free radical biology of the cardiovascular system. Clin Sci (Lond. 123, 73-91 (2012).
  4. Selvaraju, V., et al. Diabetes, oxidative stress, molecular mechanism, and cardiovascular disease--an overview. Toxicol Mech Methods. 22, 330-335 (2012).
  5. Gandhi, S., Abramov, A. Y. Mechanism of oxidative stress in neurodegeneration. Oxid Med Cell Longev. 2012, (2012).
  6. Shi, X., Zhang, Y., Zheng, J., Pan, J. Reactive oxygen species in cancer stem cells. Antioxid Redox Signal. 16, 1215-1228 (2012).
  7. Cui, X. Reactive oxygen species: the achilles' heel of cancer cells. Antioxid Redox Signal. 16, 1212-1214 (2012).
  8. Park, H., Bourla, A. B., Kastner, D. L., Colbert, R. A., Siegel, R. M. Lighting the fires within: the cell biology of autoinflammatory diseases. Nat Rev Immunol. 12, 570-580 (2012).
  9. Nathan, C., Ding, A. SnapShot: Reactive Oxygen Intermediates (ROI). Cell. 140, 951-951 (2010).
  10. Brown, G. C., Borutaite, V. Interactions between nitric oxide, oxygen, reactive oxygen species and reactive nitrogen species. Biochem Soc Trans. 34, 953-956 (2006).
  11. Brieger, K., Schiavone, S., Miller, F. J., Krause, K. H. Reactive oxygen species: from health to disease. Swiss Med Wkly. 142, (2012).
  12. Littarru, G. P., Tiano, L., Belardinelli, R., Watts, G. F. Coenzyme Q(10), endothelial function, and cardiovascular disease. Biofactors. 37, 366-373 (2011).
  13. Landete, J. M. Dietary intake of natural antioxidants: vitamins and polyphenols. Crit Rev Food Sci Nutr. 53, 706-721 (2013).
  14. Finkel, T. Oxidant signals and oxidative stress. Curr Opin Cell Biol. 15, 247-254 (2003).
  15. Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417, 1-13 (2009).
  16. Sarsour, E. H., Kumar, M. G., Chaudhuri, L., Kalen, A. L., Goswami, P. C. Redox control of the cell cycle in health and disease. Antioxid Redox Signal. 11, 2985-3011 (2009).
  17. Nathan, C., Shiloh, M. U. Reactive oxygen and nitrogen intermediates in the relationship between mammalian hosts and microbial pathogens. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 8841-8848 (2000).
  18. Finkel, T. Signal transduction by reactive oxygen species. J Cell Biol. 194, 7-15 (2011).
  19. Autreaux, B., Toledano, M. B. ROS as signalling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 813-824 (2007).
  20. Maryanovich, M., Gross, A. A ROS rheostat for cell fate regulation. Trends Cell Biol. 23, 129-134 (2013).
  21. Tonks, N. K. Redox redux: revisiting PTPs and the control of cell signaling. Cell. 121, 667-670 (2005).
  22. Antelmann, H., Helmann, J. D. Thiol-based redox switches and gene regulation. Antioxid Redox Signal. 14, 1049-1063 (2011).
  23. Foster, M. W., Hess, D. T., Stamler, J. S. Protein S-nitrosylation in health and disease: a current perspective. Trends Mol Med. 15, 391-404 (2009).
  24. Albrecht, S. C., Barata, A. G., Grosshans, J., Teleman, A. A., Dick, T. P. In vivo mapping of hydrogen peroxide and oxidized glutathione reveals chemical and regional specificity of redox homeostasis. Cell Metab. 14, 819-829 (2011).
  25. Knoefler, D., et al. Quantitative in vivo redox sensors uncover oxidative stress as an early event in life. Mol Cell. 47, 767-776 (2012).
  26. Fang, L., Miller, Y. I. Emerging applications for zebrafish as a model organism to study oxidative mechanisms and their roles in inflammation and vascular accumulation of oxidized lipids. Free Radic Biol Med. 53, 1411-1420 (2012).
  27. White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
  28. Amatruda, J. F., Patton, E. E. Genetic models of cancer in zebrafish. Int Rev Cell Mol Biol. 271, 1-34 (2008).
  29. Jing, L., Zon, L. I. Zebrafish as a model for normal and malignant hematopoiesis. Dis Model Mech. 4, 433-438 (2011).
  30. Shin, J. T., Fishman, M. C. From Zebrafish to human: modular medical models. Annu Rev Genomics Hum Genet. 3, 311-340 (2002).
  31. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
  32. Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Dev Cell. 21, 48-64 (2011).
  33. Duan, J., Yu, Y., Li, Y., Sun, Z. Cardiovascular toxicity evaluation of silica nanoparticles in endothelial cells and zebrafish model. Biomaterials. 34, 5853-5862 (2013).
  34. Sobrino-Figueroa, A. S. Evaluation of oxidative stress and genetic damage caused by detergents in the zebrafish Danio rerio (Cyprinidae). Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 165, 528-532 (2013).
  35. Xu, H., et al. Oxidative stress and immune related gene expression following exposure to di-n-butyl phthalate and diethyl phthalate in zebrafish embryos. Ecotoxicol Environ Saf. 93, 39-44 (2013).
  36. Hermann, A. C., Millard, P. J., Blake, S. L., Kim, C. H. Development of a respiratory burst assay using zebrafish kidneys and embryos. J Immunol Methods. 292, 119-129 (2004).
  37. Rieger, S., Sagasti, A. Hydrogen peroxide promotes injury-induced peripheral sensory axon regeneration in the zebrafish skin. PLoS Biol. 9, (2011).
  38. Timme-Laragy, A. R., et al. Nrf2b, novel zebrafish paralog of oxidant-responsive transcription factor NF-E2-related factor 2 (NRF2). J Biol Chem. 287, 4609-4627 (2012).
  39. Niethammer, P., Grabher, C., Look, A. T., Mitchison, T. J. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459, 996-999 (2009).
  40. Murphy, M. P., et al. Perspective. Cell Metabolism. 13 (4), 361-366 (2011).
  41. Li, N., et al. Mitochondrial complex I inhibitor rotenone induces apoptosis through enhancing mitochondrial reactive oxygen species production. J Biol Chem. 278, 8516-8525 (2003).
  42. Rhee, S. G., Chang, T. S., Jeong, W., Kang, D. Methods for detection and measurement of hydrogen peroxide inside and outside of cells. Mol Cells. 29, 539-549 (2010).
  43. Murphy, M. P., et al. Unraveling the biological roles of reactive oxygen species. Cell Metab. 13, 361-366 (2011).
  44. Covassin, L., et al. Global analysis of hematopoietic and vascular endothelial gene expression by tissue specific microarray profiling in zebrafish. Dev Biol. 299, 551-562 (2006).
  45. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
  46. Beis, D., Stainier, D. Y. In vivo cell biology: following the zebrafish trend. Trends Cell Biol. 16, 105-112 (2006).
  47. Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140, 2835-2846 (2013).
  48. Moussavi Nik, S. H., et al. The BACE1-PSEN-AbetaPP regulatory axis has an ancient role in response to low oxygen/oxidative stress. J Alzheimers Dis. 28, 515-530 (2012).
  49. Matthews, R. P., et al. TNFalpha-dependent hepatic steatosis and liver degeneration caused by mutation of zebrafish S-adenosylhomocysteine hydrolase. Development. 136, 865-875 (2009).
  50. Mukaigasa, K., et al. Genetic evidence of an evolutionarily conserved role for Nrf2 in the protection against oxidative stress. Mol Cell Biol. 32, 4455-4461 (2012).
  51. Mugoni, V., et al. Ubiad1 is an antioxidant enzyme that regulates eNOS activity by CoQ10 synthesis. Cell. 152, 504-518 (2013).
  52. Dowling, J. J., et al. Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy. Brain. 135, 1115-1127 (2012).
  53. Sun, Y., Dong, Z., Khodabakhsh, H., Chatterjee, S., Guo, S. Zebrafish chemical screening reveals the impairment of dopaminergic neuronal survival by cardiac glycosides. PLoS One. 7, (2012).
  54. Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radic Biol Med. 48, 983-1001 (2010).
  55. Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy. Free Radic Res. 44, 587-604 (2010).
  56. Karlsson, M., Kurz, T., Brunk, U. T., Nilsson, S. E., Frennesson, C. I. What does the commonly used DCF test for oxidative stress really show. Biochem J. 428, 183-190 (2010).
  57. Belousov, V. V., et al. Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nat Methods. 3, 281-286 (2006).
  58. Bjornberg, O., Ostergaard, H., Winther, J. R. Measuring intracellular redox conditions using GFP-based sensors. Antioxid Redox Signal. 8, 354-361 (2006).
  59. Yoo, S. K., Starnes, T. W., Deng, Q., Huttenlocher, A. Lyn is a redox sensor that mediates leukocyte wound attraction in vivo. Nature. 480, 109-112 (2011).
  60. Uusitalo, L. M., Hempel, N. Recent Advances in Intracellular and In Vivo ROS Sensing: Focus on Nanoparticle and Nanotube Applications. Int J Mol Sci. 13, 10660-10679 (2012).

Tags

Developmental Biology , Zebrafisk embryoner endotelceller redoxtrin analyse oxidativt stress afsløring, FACS (fluorescens-aktiveret cellesortering) molekylære prober
Analyse af oxidativt stress i zebrafisk embryoner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mugoni, V., Camporeale, A., Santoro, … More

Mugoni, V., Camporeale, A., Santoro, M. M. Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (89), e51328, doi:10.3791/51328 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter