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Biology

Análise do estresse oxidativo em embriões Zebrafish

Published: July 7, 2014 doi: 10.3791/51328

Abstract

Altos níveis de espécies reativas de oxigênio (ROS) pode causar uma mudança de estado redox celular para condição de estresse oxidativo. Esta situação faz com que a oxidação de moléculas de lípidos (, ADN, proteína), e leva à morte das células. O estresse oxidativo também afeta a progressão de várias condições patológicas como diabetes, retinopatias, neurodegeneração e câncer. Assim, é importante definir ferramentas para investigar condições de stress oxidativo, não só ao nível das células individuais, mas também no contexto de todo o organismo. Aqui, consideramos o embrião zebrafish como um útil no sistema vivo para realizar estudos e apresentar um protocolo para medir in vivo do estresse oxidativo. Aproveitando fluorescentes sondas ROS e linhas fluorescentes transgênicos zebrafish, desenvolvemos dois métodos diferentes para medir o estresse oxidativo in vivo: i) um "método de detecção de ROS todo embrião" para a medida qualitativa do estresse oxidativo e ii) um "unicelular método de detecção de ROS "para medições quantitativas de estresse oxidativo. Aqui, nós demonstramos a eficácia desses procedimentos, aumentando o estresse oxidativo nos tecidos por agentes oxidantes e métodos fisiológicos ou genéticos. Este protocolo é favorável para telas genéticos para a frente e vai ajudar as relações de causa-efeito endereço de ROS em modelos animais de patologias relacionadas ao estresse oxidativo, tais como doenças neurológicas e câncer.

Introduction

O estresse oxidativo é especificamente definida como uma condição que resulta de um estado redox celular desequilibrado. As reações redox complexas que rotineiramente ocorrem no interior das células determinar o estado redox celular. Reacções redox constituído por todas as reacções químicas que consistem na transferência de electrões entre os átomos das moléculas biológicas que produzem redução e oxidação de moléculas (por exemplo, reacções redox). Estas reacções são catalisadas por espécie activada electronicamente (por exemplo, espécies de pró-oxidantes), que são caracterizadas por uma instabilidade estrutural extrema e a activação espontânea de electrões desequilibradas que trocam com biomoléculas vizinhos. Estas reacções irregulares resultar em danos no DNA, carboxilação de proteínas e oxidação lipídica e, eventualmente, levar à morte celular 1. Aumento dos níveis de stress oxidativo têm sido associados com o envelhecimento e a progressão de diversos estados patológicos 2. O estresse oxidativo temfoi relatado para ser responsável por alterações vasculares em diabetes e doenças cardiovasculares 3,4. Também desempenha um papel crítico na degeneração neuronal na doença de Alzheimer e doença de Parkinson 5. Além disso, o estresse oxidativo tem sido demonstrada como um fator crítico para governar a progressão do câncer e eventos metastáticos 6,7. Além disso, as respostas imunes e inflamação pode provocar estresse e mais apoio oxidativo 8.

Em células vivas, espécies pró-oxidantes são derivados de oxigênio (ROS, espécies reativas de oxigênio) ou de nitrogênio (RNS; espécies reativas de nitrogênio). ROS incluem o radical hidroxilo, anião de superóxido (OH.) (O 2 -), e o peróxido de hidrogénio (H 2 O 2). O primário RNS é o óxido nitroso (NO.). Uma série de espécies reactivas secundárias podem ser gerados por interacções espontâneas between ROS e RNS ou metais livres íons 9. Por exemplo, o anião superóxido reage com o óxido nitroso para formar peroxinitrato (ONOO -), enquanto H 2 O 2 a reagir com Fe 2 + gera radicais hidroxilo. ROS e RNS, devido à sua capacidade de reagir com várias biomoléculas, são consideradas uma grave ameaça para a manutenção do estado redox fisiológica 10. Para manter as células do estado redox estão equipadas com uma série de desintoxicar moléculas anti-oxidantes e enzimas. A superóxido dismutase (SOD), catalase, glutationa peroxidase e Peroxirredoxinas constituem o essencial do anti-oxidante enzimático-arsenal que fornece proteção celular de espécies pró-oxidantes, incluindo H 2 O 2, OH e OONO -. 11. Também moléculas anti-oxidantes como a vitamina C e E, polifenóis e CoenzymeQ10 (CoQ10) são de importância crítica para saciar ROS e sua perigosa deusa derivativos 12,13. No entanto, uma produção excessiva de ROS e RNS, ou uma disfunção no sistema anti-oxidante, muda o estado redox celular para o estresse oxidativo 14.

Além de sua conotação negativa, ROS pode desempenhar várias funções fisiológicas em células de origem diferente. As células normalmente produzem ROS como moléculas sinalizadoras para mediar eventos biológicos normais, tais como a defesa do hospedeiro e reparação de feridas 15-17. Espécies reactivos são normalmente produzidas em células por enzimas intracelulares, tais como NOX (NADPH oxidase) e XO (xantina oxidase), em resposta a factores de sinalização, factores de crescimento, e as flutuações de níveis de cálcio intracelulares 18,19. Tem sido relatado que as ROS pode diferencialmente modular a actividade dos factores nucleares importantes, tais como p53 ou componentes celulares, tais como a ATM-quinase, um regulador do mestre de a resposta ao dano no DNA de 20. Analogamente ROS influenciar fortemente a sinalização celular através da mediação the oxidação e inactivação da proteína tirosina fosfatases (DPT), os quais são estabelecidos como reguladores críticos de transdução de sinal 21. Além disso, as metodologias proteômicas baseadas demonstrar que RNS também são responsáveis ​​por modificações e alterações de sinalização molecular de proteínas específicas. RNS reagem com os grupos tiol de cisteína modificados los em S-nitrothiols (SNO) e provocando vias moleculares concomitantes com os estados patológicos tais como doenças inflamatórias e auto-imunes 22,23.

Desde experimentos de cultura de células se reproduzem apenas parcialmente a multiplicidade de factores que actuam in vivo, é de grande interesse para realizar estudos de redox em modelos animais 24,25. Para conseguir isso, o peixe-zebra foi considerada um modelo animal vertebrado adequado para estudar a dinâmica de estresse oxidativo 26. O peixe-zebra é um novo modelo de sistema que concede várias vantagens para estudar eventos celulares e genéticas durante vertebrados devolvimento e doenças. Grandes aglomerados de embriões pode ser gerada e está disponível semanal para as necessidades experimentais. Além disso, a claridade óptica extraordinária de embriões de peixes-zebra, bem como o seu tamanho pequeno, permite que imagens de células única e rastreio dinâmico em organismos inteiro 27. Na última década, um número considerável de mutantes peixe-zebra foram gerados para modelar condições patológicas humanas, como câncer e doenças genéticas 28-31. Mais importante ainda, uma infinidade de linhagens transgênicas foi produzido para permitir grandes oportunidades de manipulações genéticas e biológicas 32. Por exemplo, linhas de peixes-zebra transgénicos específicos de tecido são regularmente utilizados para estudos in vivo. Estas linhas de expressar uma proteína fluorescente, sob o controlo de um promotor seleccionado, oferecendo a possibilidade de identificar uma única célula in vivo, bem como com a estrutura anatómica eles compreendem.

Vários estudos toxicológicos já usou tele peixe-zebra para avaliar o efeito in vivo de produtos químicos na homeostase redox, sugerindo a adequação deste vertebrado como um modelo animal para o campo da descoberta de drogas e de stress oxidativo 33-35. Mesmo que algumas sondas fluorescentes foram testados para monitorar o estresse oxidativo em larvas do peixe 36,37, não há ensaios estabelecidos para detectar e medir os níveis de estresse oxidativo nos tecidos de peixes-zebra e células vivas. Aqui nós descrevemos um procedimento para a quantificação in vivo do estresse oxidativo em células de embriões de peixes-zebra viva. Ferramentas de imagem, separação FACS, sondas fluorescentes e condições pró-oxidantes são combinados para gerar um ensaio simples para a detecção e quantificação de espécies oxidativas em embriões de peixe-zebra e tecidos.

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Protocol

1. Preparação de instrumentos e soluções de trabalho

  1. Preparar a solução de água de peixe. Faça uma solução estoque, dissolvendo 2 g de "Instant Ocean 'sais do mar em 50 ml de água destilada. Adicionar 1,5 ml de caldo de peixe de água para 1 L de água destilada para preparar pronto para usar água de peixe (sais do mar de 60 mcg / mL concentração final). Autoclave o pronto para usar água de peixe antes do uso. Esta solução é utilizada como meio de embriões de peixe-zebra.
  2. Prepare metilcelulose para montagem embrião. Dissolve-se 1,5 g de metilcelulose em 50 ml de água estéril peixe. Facilitar a dissolução por meio de um ímã em uma placa de agitação. A dissolução completa do pó pode requerer várias horas. Verifique a solução para maior clareza e alíquota em pequenos tubos. Armazenar a -20 ° C durante meses e descongelar alíquotas a utilização. Centrifugar a metilcelulose a 950 xg por 5 min antes de usar. Evite ciclos de congelamento e descongelamento de alíquotas.
  3. Preparar 50 ml de tricaina / acetato de 3-aminobenzoato msal etanossulfonato (solução mãe) por dissolução de 200 mg de tricaina em 100 ml de água e ajustar o pH para 7,0 utilizando Tris-HCl 1 M (pH 9). Guarde este estoque a 4 ° C por não mais do que 30 dias. CUIDADO: tricaina é tóxico. Use de acordo com as diretrizes de manejo adequadas.
  4. Indução de estresse oxidativo em embriões de peixe-zebra
    1. Prepare uma solução oxidante para a indução do estresse oxidativo genérico: Faça 50 ml de solução oxidante adicionando H 2 O 2 solução estoque (peróxido de hidrogénio; 100 mM) de água de peixe. Use H 2 O 2 de uma concentração final entre 2 mM e 100 mM. Preparar esta solução pouco antes do uso. A solução oxidante pode ser aplicada a de detecção de ROS tanto todo monte e unicelulares métodos de detecção de ROS. Não guarde esta solução. CUIDADO: H 2 O 2 é perigoso e nocivo por inalação e ingestão. O contato com material combustível pode provocar incêndio. Manipular sob um exaustor e desgaste pers apropriadasequipamentos de proteção onal.
    2. Prepara-se uma solução oxidante para a indução de stress oxidativo derivado de mitocôndrias: Preparar uma solução de estoque de oxidante (5 mM), por dissolução de 3,9 mg de rotenona em 2 ml de dimetilsulfóxido (DMSO). Manter esta solução à temperatura ambiente no escuro.
      1. Dissolva solução estoque rotenone a 10 ml de água de peixe para fazer uma solução pronta a usar. Use rotenona a uma concentração entre 5-50 uM. Não utilizar rotenona em concentrações superiores a 100 uM. Com concentrações adequadas, esta solução oxidante pode ser aplicado para a detecção de ROS tanto conjunto de montagem e de uma única célula de métodos de detecção de ROS. ATENÇÃO: A rotenona é tóxico e perigoso. Manuseie de acordo com declarações de precaução apropriadas.
    3. Induzir o estresse oxidativo por gene knock-down: Knock-down expressão do gene em embriões de peixe-zebra nrf2a por morfolino microinjeção como previamente relatado por Timme-Laragy A. et al, 2012 38..
    4. Induzir o óxidoative o estresse após dano tecidual: gerar uma margem ferida na barbatana caudal de embriões de peixes-zebra em 72 hpf como previamente descrito por Niethammer et al, 2009 39..
  5. Prepare 5 ml de solução de detecção de ROS para uma única célula método de detecção de ROS:
    1. Solução para a detecção de ROS geral: Dissolve-se a sonda molecular ROS-sensível genérico em HBSS (Solução Salina Equilibrada de Hanks) a fim de preparar uma solução de trabalho (intervalo de concentração: 2,5-10 uM). Esta solução deve ser preparada logo antes do uso.
    2. Solução para a detecção específica ROS induzida pela mitocôndria: Pouco antes de usar, dissolver uma sonda ROS-sensível mitocondrial com DMSO fazer uma solução estoque 5 mM. Dissolve-se uma solução estoque em HBSS a fim de preparar uma solução de trabalho (intervalo de concentração: 2,5-10 uM).
      NOTA: Evite a luz e oxigênio exposição de soluções de trabalho de detecção de ROS e suas respectivas soluções estoque. Proteger o tubo de luz usandouma folha de alumínio. Não guarde ou reutilização sondas dissolvidos em HBSS. Armazenar as soluções de reserva, a -20 ° C durante um mês.
      CUIDADO: Manuseie sondas moleculares e DMSO sob um exaustor de acordo com as orientações adequadas.
  6. Prepare 5 ml de solução de detecção de ROS para todo o método de detecção de ROS montagem: Dissolve-se a solução estoque sonda ROS-sensível genérico (estabilizado em DMSO) em HBSS a fim de preparar uma solução de trabalho (intervalo de concentração: 2,5-5 uM). Evite luz e exposição ao oxigênio. Proteger o tubo da luz. Preparar esta solução antes da utilização. Não guarde ou re-utilizar esta solução. CUIDADO: Manuseie sondas moleculares sob um exaustor de acordo com as orientações adequadas.
  7. Adicione 25 mL de solução de paragem através da adição de 10 ml de soro fetal de bovino a 15 ml de PBS 1x. Mantenha solução estéril. Conserva-se a solução a 4 ° C. Esta solução é necessária apenas para única célula - método de detecção de ROS.
  8. Defina a incubadora de ar zebrafish a 28 e# 176; C.
  9. Definir a centrífuga a 4 ° C durante a célula único método de detecção de ROS.

2. Acasalamento de peixes adultos e Seleção de embriões Zebrafish

  1. Defina-se peixes-zebra adultos par atravessa de acordo com protocolos padrão 40. Selecione a linha transgênica adequado, de acordo com as necessidades específicas experimental.
  2. Recolher os ovos e coloque-os em um prato de 90 mm, com média de água de peixe / embrião. Mantenha os ovos a 28 ° C até que os embriões irão desenvolver e crescer até o estágio desejado de desenvolvimento (por exemplo, 48 hpf, 72 hpf; hpf: horas após a fecundação).
  3. Tela para o desenvolvimento de embriões. Excluir todos os ovos não fertilizados ou embriões subdesenvolvidos.
  4. Anestesiar embriões, adicionando 1 ml de tricaina (solução estoque) em 50 ml de água de peixe.
  5. Selecione embriões fluorescentes Tg sob microscópio estereoscópico.

3. Tratamento de embriões com agente oxidante

  1. Use pelo menos 30 embriões entre 48 hPF e 72 HPF por condição diferente. Lave embriões duas vezes com água de peixe fresco, a fim de remover tricaina.
  2. Dividir embriões fluorescentes em três pratos. Coloque no máximo 30 embriões / prato.
  3. Remover a solução de lavagem e adicionar 10 ml da solução de oxidante ou 10 ml de água de peixe como solução de controlo.
  4. Incubar os embriões durante 10 min para 1 hora a 28 ° C. O período de incubação depende do nível do stress oxidativo para ser induzida em tecidos específicos. Períodos curtos são a melhor como as células afetadas pelo estresse oxidativo submeter progressivamente a morte celular.
  5. Transferência de embriões em um novo prato contendo HBSS e embriões de lavagem por agitação. HBSS pré-quente a 28 ° C.

4. Whole Método de Detecção Monte ROS

  1. Coletar embriões após o tratamento oxidante e colocar não mais de 10 embriões em um pequeno tubo. Lavar com HBSS, tanto quanto possível. Proteger o tubo de luz usando papel alumínio.
  2. Adicionar 1 ml de solução de detecção de ROScada tubo.
  3. Incubar os embriões no escuro durante 15 min a 28 ° C para evitar a exposição à luz.
  4. Durante o tempo de incubação preparar uma lâmina de vidro para análise embrião todo. Coloque 300 ml de metilcelulose em uma "depressão" lâmina de vidro e espalhe-o sobre a superfície de vidro com uma ponteira. Evite bolhas ao liberar a metilcelulose.
  5. No final do tempo de incubação, retirar imediatamente a solução de detecção de ROS e lavagem por duas vezes com 2 ml de HBSS. Lavar embriões invertendo o tubo várias vezes. Não pipeta ou vortex.
  6. Embriões Aspirar para cima em uma pipeta de Pasteur de vidro. Embriões posição perto da abertura da pipeta e suavemente ejetamos em metilcelulose. Orientar os embriões de forma adequada com uma linha de nylon fina.
  7. Comparar a fluorescência de embriões de controlo, com os embriões tratados. Alternativamente, fixar parâmetros do microscópio estereoscópico fluorescência ou microscópio confocal para que todos os embriões são fotografadas usando o mesmoconfigurações de imagem.

5. Single Cell Método de detecção de ROS

  1. Comece a partir do passo: 3.5. Certifique-se de ter pelo menos 35 embriões para cada condição.
  2. Transferência de embriões em um novo prato. Retire a água de peixe, tanto quanto possível. Adicionar 10 ml de PBS gelado 1x e 400 l de Inibidores da Protease Cocktail. Dechorionate manualmente embriões com uma pinça e retire o saco vitelino com uma agulha fina. Nota: A remoção saco vitelino garante amostras limpas para a seguinte análise FACS. Esta etapa pode ser evitada de acordo com instrumento FACS.
  3. Transferência yolked-de embriões em uma placa de 24 poços com vários poços (15 embriões / poço) e retire toda a água dos peixes.
  4. Adicionar 300 uL de HBSS, 30 ul de colagenase P, 50 ul de Tripsina-EDTA em cada poço.
  5. Homogeneizar embriões cuidado pipetando para cima e para baixo com uma ponteira apertado (1.000 mL).
  6. Incubar a 28 ° C durante 20 min e homogeneizar por pipetagem de amostras a cada 5 min.
  7. Verifique DISR tecidouption, observando-se uma alíquota de homogeneizado no microscópio composto. Facilitar a suspensão única célula por pipetagem. Não incubar os embriões por mais de 30 min.
  8. Parar a reacção adicionando 200 mL de solução de paragem. Misture com cuidado pipetando.
  9. Transferir a suspensão de células para um tubo de pré-refrigerada com fundo apertado. Mantenha o tubo em gelo e evitar a exposição à luz.
  10. Centrifugar durante 5 minutos a 250 xg, a 4 ° C.
  11. Retire a fase superior e re-suspender as células com gelo frio HBSS com cuidado pipetando.
  12. Contagem de células e certifique-se de ter o mesmo número de células em todas as suas amostras. Não use menos de 2 x 10 6 células.
  13. Centrifugar células durante 5 min a 250 xg a 4 ° C.
  14. Remover o sobrenadante e suspender a pelete com 1 ml de gelo gelou HBSS contendo a sonda ROS-sensível.
  15. Incubar o tubo à temperatura ambiente durante 3 min, no escuro. Tempo de incubação variam de acordo com o nível de stress oxidativo e à tele sensibilidade da sonda.
  16. Transferir as células para um tubo de FACS. Manter tubos em gelo e evitar a exposição à luz antes da análise FACS.
  17. Classificar células com um classificador de células ativadas por fluorescência (FACS). Conjunto de comprimentos de onda, de acordo com a fluorescência da Tg do tecido (por exemplo, GFP) e os espectros de excitação / emissão de sonda molecular utilizado para a detecção de ROS (por exemplo, sondas de ROS mitocondrial sensíveis específicos, sondas ROS sensíveis genéricos).
  18. Para cada condição, medir todas as amostras na mesma sessão experimental, aplicando as mesmas configurações de FACS. Calcula-se a percentagem de células fluorescentes como a média das diferentes réplicas biológicas. Analisar, pelo menos, duas réplicas para cada condição.

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Representative Results

Ao aplicar o método aqui descrito, podemos facilmente medir e detectar o estresse oxidativo (e níveis de ROS) em tecidos embrionários peixe-zebra. Depois de atravessar adulto zebrafish, os ovos são coletados e autorizados a desenvolver a 28 ° C a 72 horas pós-fecundação (hpf). Para induzir o estresse oxidativo, propomos duas abordagens diferentes: 1) o tratamento de embriões com fortes reagentes pró-oxidantes ou 2) promover a formação de ROS após a lesão de tecidos.

Na primeira abordagem, foram empregados dois reagentes diferentes de acordo com as necessidades específicas: peróxido de hidrogênio (H 2 O 2), como o agente de formação de ROS celular genérico, e rotenona, como o driver específico ROS mitocondrial. Rotenona é um inibidor do complexo I da ETC, que desregulamentações são causador do estresse oxidativo 41.

Na segunda abordagem, que induziu acumulação de ROS, criando uma ferida na barbatana da cauda de um embrião do peixe-zebra39. Alternativamente, as condições de estresse oxidativo pode ser promovido em tecidos de peixes-zebra por derrubar com injeção morfolino o caminho da resposta antioxidante Nrf2 que é a defesa celular primária contra os efeitos citotóxicos do estresse oxidativo 38.

Uma vez que o estresse oxidativo é induzido em embriões de peixe-zebra, o acúmulo de espécies reativas de oxigênio (ROS) pode ser medido por meio de sondas de ROS-sensíveis específicos ou genéricos mitocondriais, que se tornam fluorescentes após a ativação (oxidação).

Embriões tratados podem ser analisados ​​utilizando-se todo o método de detecção de ROS montagem ou por aplicação do método simples de detecção de células ROS, como resumido na Figura 1. A selecção entre os métodos baseia-se na necessidade de fazer a medição quantitativa ou qualitativa do estresse oxidativo. Os resultados representativos de ambos os métodos estão representados na Figura 2 Figura 3.

Todo o método de detecção de ROS Monte

A Figura 2 mostra a aplicação de todo o método de detecção de ROS montagem para imagiologia in vivo do estresse oxidativo. Em particular, este método tem sido aplicado para seguir o stress oxidativo "forte" gerados pelos tratamentos pró-oxidantes exógenos, bem como o stress oxidativo "baixo" gerado por mais condições fisiológicas, tais como lesões de feridas ou deleção do gene.

Níveis fisiológicos de espécies oxidativas são induzidas por gerar uma lesão no micro ou uma grande ferida na barbatana caudal de um embrião de peixe-zebra ao vivo em 72 hpf. Demonstrou-se que após a lesão, H 2 O 2 se acumula na ferida margem de 20 minutos após o ferimento 39. A fim de visualizar a acumulação do stress oxidativo na margem da ferida, os embriões foram incubados com um genéricoSonda ROS-sensível e fotografada a 20 min após o ferimento 39. Ao comparar as barbatanas da cauda intactas com caudas de feridas, é possível distinguir uma acumulação da sonda fluorescente na margem da ferida (Figura 2A). Sinal não específica fluorescência fraca é detectada em todo o tecido da cauda fin em ambas as condições.

A fim de validar a acumulação específica da sonda ROS-sensível na margem da ferida, o H 2 O 2 em níveis da ferida ter sido reduzido por uma abordagem farmacológica. Uma vez que foi demonstrado que a margem da ferida de H 2 O 2 a acumulação é extremamente sensível ao inibidor VAS2870 DUOX-39, os embriões foram pré-tratadas com este inibidor antes de o ferimento. A comparação da fluorescência da sonda ROS-sensível, de VAS embriões pré-tratados e os respectivos controlos, indica que o sinal é dependente da acumulação de ROS (isto é, H 2 O 2) (Figura 2B).

Além disso, geramos altos níveis de espécies oxidativas nos tecidos zebrafish tratando embriões de peixe-zebra com rotenona. Os embriões e os controlos tratados com rotenona foram incubadas com uma sonda de ROS-sensível genérico para detectar especificamente espécies de ROS. Em seguida, a sonda foi lavada e os embriões foram fotografadas em um microscópio de fluorescência estéreo. A tensão oxidativa foi detectada em todo o corpo dos embriões (Figura 2C). As imagens de alta ampliação mostram regiões anatômicas onde a sonda é metabolizada com sucesso (Figura 2D). Imagens de campo claro (painéis superiores) distinguir estruturas anatômicas, enquanto imagens de fluorescência (painéis inferiores) indicam células ROS-positivos. Como mostrado pelas imagens fluorescentes, os resultados são essencialmente um relatório qualitativa de detecção de stress oxidativo, o que é conseguido por meio da comparação com o controlo de embriões tratados.

Single CellROS Método de Detecção

A Figura 3 relatórios FACS representativos parcelas e quantificação de estresse oxidativo através da aplicação do método de detecção de ROS única célula. Este método foi adaptado para medir os níveis de estresse oxidativo em células de peixe-zebra, que foram submetidos a condições de pró-oxidantes como relatado no protocolo e detalhadas em legendas de figuras. Como descrito, o stress oxidativo tem sido medida através da incubação de tecidos de peixes-zebra dissociadas em células individuais com uma sonda molecular ROS-sensível. Uma vez que o processo de dissociação e a própria FACS podem causar danos celulares, a análise de amostras que requer apenas a "células vivos" são considerados para a quantificação de stress oxidativo. Deste modo, as células dissociadas são analisadas por selecção da fracção de células que mostram "célula viva" parâmetros físicos (Figura 3A) e por exclusão de células mortas (Figura 3B). Assim, as amostras são quantificadas paraos níveis de stress oxidativo de acordo com a fluorescência da sonda ROS-sensível e para exibir uma fluorescência endógena, tais como positividade para a GFP (Figura 3C). A amostra de controlo negativo para a sonda ROS-sensíveis devem ser incluídos, a fim de avaliar o estresse oxidativo induzido pelo manuseio e procedimentos técnicos (Figura 3C; painel: Controle -). Relativa FACS trama quantificação demonstrada em histogramas que mostram as medições das diferentes réplicas biológicas (Figura 3D-E).

Além oxidativo quantificação nível de estresse sobre os tratamentos de peróxido de hidrogênio, este método foi aplicado para quantificar os níveis de estresse oxidativo dentro de condições fisiológicas tais nós em morphants nrf2a e os respectivos controles (Figura 3F).

Além disso, através da combinação do método de detecção de uma única célula de ROS com sondas específicas ROS-sensíveis tais nós mitocondrial ROSondas sensíveis-S, mas também é possível medir o stress oxidativo no contexto de tratamentos pró-oxidantes segmentada por mitocôndrias específicas (Figura 3G).

Figura 1

Figura 1. Figura esquemática do método para medir os níveis de ROS em embriões de peixe-zebra. Adultos Zebrafish são atravessadas nos tanques de criação adequadas. Ovos fertilizados são então recolhidos em placas e armazenadas a 28 ° C para permitir o embrião desenvolver plenamente. Indução do stress oxidativo pode ser conseguido de diferentes maneiras, ou por tratamentos farmacêuticos ou por insultos genéticas ou físicas. Em alternativa, no caso de um mutante genético é analisado, é possível pular esta incubação e avançar. Neste ponto, é possível efectuar segundo dois métodos diferentes. Acordo com o "todo montante ROS método de detecção de "(esquerda) e de embriões de peixes-zebra são imediatamente incubadas com uma sonda fluorescente de ROS-sensível (1) e, em seguida, analisadas por fluorescência ou um microscópio confocal (2). No "célula única ROS-detecção" método (direita), embriões de peixe-zebra são dissociadas em células individuais (1), incubadas com uma sonda fluorescente de ROS-sensível (2) e analisadas por FACS para a detecção e quantificação de fluorescência (3). Enquanto o método "todo mount-ROS detecção" permite a detecção do estresse oxidativo em embriões vivos, principalmente como um teste qualitativo, "com base de uma única célula" método subsídios qualitativos e medições quantitativas dos níveis de estresse oxidativo.

Figura 2
Figura 2. Resultados representativos de todo o método de detecção de ROS montagem. A) Os embriões Zebrafish em 72 hpf foram submetidaspara ferindo como anteriormente descrito por Niethammer et al, 2009 39.. imagens confocais representativos mostram espécies pró-oxidantes (ROS) de acumulação (ponta de seta) na margem da ferida do caudal ferido. Espécies oxidativas foram detectados com a sonda genérica de ROS (CellROX, 2,5 uM) 20 min após a ferida ter sido feito. Barra de escala de 20 mM. B) imagens confocal Representante mostrando margem ferida de embriões de peixe-zebra a 72 hpf. Os embriões foram tratados previamente com VAS2870 (20 uM) ou DMSO durante 90 min antes de o ferimento ter sido feita. ROS foram detectadas com uma sonda genérica ROS-sensível (CellROX, 2,5 uM) 20 min após a ferida. Barra de escala de 20 mM. C) imagem de corpo inteiro mostrando o estresse oxidativo induzido por rotenona em embriões de peixe-zebra. O stress oxidativo está fortemente detectado na região caudal dos embriões, como mostrado no painel D). Rotenona é um potente inibidor da ETC mitocondrial afetando principalmente skelcélulas musculares etal em peixe-zebra. Barra de escala, 180 mM.

Figura 3
Figura 3. Resultados representativos de células individuais do método de detecção de ROS. D) representativas FACS gráfico que mostra um exemplo típico de embriões de peixes-zebra dissociado em células individuais. Células vivas são fechadas na região R1 de acordo com os parâmetros FSC-H e SSC-H. SSC-H: 539 (tensão), 1.0 (AmpGain), Modo: linear; FSC-H:. E00 (tensão), 2,1 (AmpGain) B) Representante FACS enredo mostrando uma amostra típica de embriões de peixes-zebra dissociada de células individuais. Antes da análise por FACS, a amostra foi incubada com iodeto de propídio (PI; de 1 ug / ml) durante 5 min. As células mortas são fechadas na região R2 de acordo com PI fluorescência (canal FL2-H). FSC-H: E00 (tensão), 2,1 (AmpGain), Modo: linear, SSC-H: 539 (tensão), 1.0 (AmpGain), Modo: lipróximo. Canais de tensão: FL-2:. Log 613 C) FACS representativos parcelas mostrando dissociados de embriões de peixes-zebra submetidos a tratamento pró-oxidante (H 2 O 2) e os respectivos controlos. As células endoteliais são visualizados através do canal GFP. Parcelas FACS representar todas as células afetadas pelo estresse oxidativo (ROS) em UL e UR. As células negativas são plotados em quadrantes inferiores (LL e LR). Tg (Kdrl: GFP) de embriões de peixes-zebra s843 em 48hpf foram incubadas com H 2 O 2 (2 mM) ou H 2 O como controlo, durante 10 min. Antes da análise de FACS, os embriões são processados ​​como descrito no protocolo. Células afectadas pelo stress oxidativo são detectados utilizando uma sonda genérica ROS-sensível fluorescente (CellROX, 2,5 fiM). Uma amostra não incubada com a sonda de ROS-sensíveis foi incluído como controle negativo. Comparando a amostra submetida a tratamento pró-oxidante com o respectivo controlo, o número de células traçados em quadrantes superiores (UL + UR) é mais elevada. FACS acervoconfigurações ition foram os seguintes: canais Tensão: FL-1: 582 Log; FL-4:. 410 D Log) Histograma mostrando a porcentagem de células (UL + UR) afetados pelo estresse oxidativo em H 2 O 2 embriões tratados e respectivo controle. As medições estão relacionados com as amostras apresentadas no C. Células afectadas pelo stress oxidativo são detectados utilizando uma sonda genérica ROS-sensível fluorescente (CellROX, 2,5 fiM). Os resultados são a média de n = 2 réplicas biológicas diferentes ± DP. E) Histograma mostrando a percentagem de células endoteliais (GFP +) afectados pelo stress oxidativo (+ ROS) em H 2 O embriões tratados 2 e respectivo controlo. As medições estão relacionados com as amostras apresentadas no C. Os resultados são a média de n = 2 réplicas biológicas diferentes ± SD. F) Histograma mostrando a porcentagem de células afetadas pelo estresse oxidativo (ROS +) em morphants nrf2a (nrf2a MO) e respectivos controles(Ctrl MO) em 24 hpf. Os resultados são a média de n = 2 réplicas biológicas diferentes ± DP L) Histograma mostrando a percentagem de células afectadas pelo stress oxidativo mitocondrial em embriões tratados (rotenona;. De 10 uM) e respectivos controlos (Ctrl; DMSO) a 72 hpf. Após dissociação de embriões em células individuais, o stress oxidativo mitocondrial (ROS mitocondrial +) foi medida com uma sonda específica mitocondrial (MitoSOX; 5 uM). Os resultados são a média de n = 3 réplicas biológicas diferentes ± DP.

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Discussion

Etapas críticas

O procedimento para a detecção de stress oxidativo em embriões de peixe-zebra aqui descritos compreende dois métodos diferentes. O método de detecção de ROS montagem inteira é principalmente um teste qualitativo para a detecção de ROS, enquanto a célula único método de detecção de ROS permite medições quantitativas mais específicas (Figura 1). Ambos os métodos oferecem uma maneira rápida e fácil de avaliar a detecção de ROS-in vivo em embriões de peixe-zebra. No entanto, ambos apresentam algumas etapas críticas.

Passos críticos relacionados ao Método I

O primeiro método para a detecção-de ROS conjunto de montagem tem a grande vantagem de detectar facilmente o estresse oxidativo em todos os tecidos de embriões vivos (Figura 2). No entanto, há três aspectos críticos importantes que devem ser considerados e podem influenciar o resultado do ensaio: 1) a permeabilidade da sonda de tecidos embrionários, 2) a toxicidade de sonda e 3) the sensibilidade sonda a baixa concentração de ROS.

O primeiro aspecto está especificamente relacionada com a aplicação in vivo de do método 42. A propriedade "cell-permeabilidade" da sonda ROS-sensível é uma característica essencial para a realização deste ensaio. O ideal é que todos os produtos químicos solúveis em água são ideais para entrega em embriões de peixe-zebra vivos; no entanto a maioria dos reagentes para a detecção de stress oxidativo, são insolúveis em água. Assim, é normalmente recomendada a utilização de sondas que são solúveis em DMSO (dimetil-sulfóxido).

Há possíveis efeitos tóxicos sobre os embriões ligados à concentração da sonda de ROS. Os efeitos secundários são normalmente representado por danos nos tecidos (por exemplo, necrose) ou metabolismo acelerado da sonda. Incubações longas (dias) de embriões de peixes-zebra com a morte do embrião, causa sonda hidroetidina enquanto doses elevadas de 5 - (e-6)-carboxi-2 ', 7'-diclorofluoresceína resultados diacetato de nacumulação não específica da fluorescência no intestino (dados não publicados). Para superar esse problema, é importante monitorar os embriões durante a incubação com a sonda. Ensaios de várias concentrações e tempos de incubação com a mesma sonda seria benéfico bem. O tempo de incubação ideal permite a entrega e a oxidação da sonda molecular, sem danificar os tecidos superficiais. Os tempos de incubação utilizando sondas químicas (0,5-10 uM) podem ser geralmente fixada no intervalo de 10-30 minutos e não deve ser superior a 1 hora. Esta condição pode ser bastante complicado para configurar, especialmente quando a quantidade de espécies oxidativas está perto de níveis fisiológicos ou quando é restrita a tecidos embrionários internos. De fato, quando um organismo inteiro é incubada com uma sonda de detecção químico-ROS, os tecidos mais superficiais (isto é, a pele, olhos e coração) são o lugar onde a sonda é principalmente oxidado e se torna fluorescente. Mais tarde, a sonda é progressivamente entregue aos órgãos internos, fígado ou vessels. Como consequência, o momento apropriado para a incubação de embriões de peixes-zebra com a sonda de detecção de ROS é crítico para detectar o stress oxidativo em todos os tecidos.

Finalmente, quando se utiliza este método, é importante considerar a sensibilidade da sonda para o nível de stress oxidativo expresso por tecidos. A maioria das sondas não estão disponíveis comercialmente finamente caracterizado pela sua sensibilidade, e isso significa que a sonda ideal para aplicações específicas, deve ser determinada empiricamente. Todas as sondas ROS-sensíveis geralmente detectar altos níveis de estresse oxidativo, mas a maioria deles não são sensíveis a mudanças mínimas de níveis de estresse oxidativo 43.

De forma a limitar este inconveniente e permitir uma análise mais pormenorizada e precisa, é sugerida a aplicação do segundo método de detecção com base em células individuais de estresse oxidativo.

Passos críticos relacionados ao Método II

A single-cell método de detecção de ROS apresenta algumas etapas críticas. Eles são determinados principalmente por 1) a eficiência de dissociação de células embrionárias e por 2) o tipo de sonda de ROS-sensível associada ao ensaio.

A dissociação de embriões em células isoladas foi adaptado a partir de protocolos anteriores para análise de células por meio de citometria de fluxo de peixe-zebra e 44 apresenta dois aspectos críticos que influenciam fortemente o resultado de todo o procedimento. O primeiro aspecto que diz respeito ao método utilizado para dissociar os embriões, enquanto o segundo se refere à recuperação de células dissociadas.

A dissociação de embriões em células individuais é controlada principalmente pela concentração de reagentes de dissociação (por exemplo, colagenase P e de tripsina). No entanto, deve considerar-se que a eficiência de dissociação do tecido está dependente do número de embriões incubados e a sua fase de desenvolvimento. Embriões Zebrafish em estágios de desenvolvimento anteriores (24 hpf-48 hpf) são mais sensíveis a reagentes de dissociação de larvas (96 hpf-120 hpf) por causa de tecidos progressivos de crescimento 45. Assim, ajustes no processo de dissociação são necessárias quando se trabalha com embriões de peixe-zebra em diferentes estágios de desenvolvimento de 72 hpf. Incubação com reagentes excessiva provoca a morte celular, enquanto que a concentração reduzida de reagentes dissocia apenas parcialmente os embriões. Como é importante desagregar corretamente tecidos, é igualmente importante para coletar e preservar as células individuais. Uma consideração importante é a temperatura à qual as células são recuperadas após a divisão do tecido. É importante para manter as células em gelo ou a 4 ° C, durante a centrifugação, de modo a limitar o stress oxidativo secundária a perturbação mecânica de tecidos ou processos de manipulação.

O segundo passo essencial no que respeita à sonda associada está ligada à análise em tecidos específicos de interesse. A maneira mais fácil de detectar uma célula populção no peixe-zebra é oferecido pela grande variedade de linhagens transgênicas que foram estabelecidas durante as últimas décadas 46,47. No entanto, a fluorescência da linha transgénica seleccionado deve ser compatível com a sonda de detecção de ROS. É crucial para evitar cross-talk entre fundo tecido fluorescência eo baixo, mas sinal específico, fluorescência emitida pela sonda.

Aplicações deste Protocolo

Considerando os dois métodos oferecem um ensaio fácil e de custo eficaz para medir o estresse oxidativo in vivo, é possível aplicar este protocolo a várias condições:

Medidas de estresse oxidativo em diferentes genéticas (por exemplo, patológicos) Condições

Oxidante e genes antioxidantes pode ser facilmente modulada em embriões de peixe-zebra pela injeção de morpholinos (perda de função) ou mRNA (ganho de função). Recentemente experimentos relatados de gene knock-down e microinstruçãoinjeção de mRNA tampado em embriões de peixe-zebra estabeleceu papéis diferentes para os genes antioxidantes Nrf2a e Nrf2b na proteção das células do estresse oxidativo durante o desenvolvimento. Abordagens de expressão gênica modulação avaliou um eixo conservada evolutiva entre mamíferos e peixes-zebra para resposta a hipóxia e estresse oxidativo em células neuronais 38,48. Além disso, uma grande oportunidade para estudar o estresse oxidativo é oferecido por várias linhas mutantes peixe-zebra. Por exemplo, o ducttrip peixe-zebra (DTP) mutante representa um exemplo interessante para a caracterização do stress oxidativo em relação a uma condição patológica. O mutante dtp transporta uma deficiência para a hidrolase de S-adenosilhomocisteína (ahcy) do gene e a sua caracterização revelou que a perda de actividade Ahcy provoca degeneração do fígado por influenciar os níveis de ROS 49. De forma equivalente, o fh318 Nrf2 mutante peixe-zebra, transportando uma functio perda den mutação do gene fator de transcrição Nrf2, tem sido considerada com bastante interesse para investigar o papel protetor desse gene antioxidante em vertebrados inferiores 50.

Medidas do Estado Redox Provocado por compostos farmacêuticos

O tratamento de embriões de peixes-zebra com pequenos fármacos podem inibir ou activar o stress oxidativo. Recentemente, demonstram que o tratamento com estatina de embriões de peixes-zebra induzidas estresse oxidativo que pode ser recuperado por tratamento CoQ10 51. Alternativamente, a análise de estresse oxidativo no modelo animal peixe-zebra para miopatias relacionadas com RYR1 humanos realçado o papel do fármaco antioxidante NAC (N-acetilcisteína) como uma aproximação terapêutica potencial para a doença muscular 52.

Triagem de Grande Escala de pequenas moléculas e medicamentos para caracterizar suas propriedades oxidativas

O peixe-zebra é um mod de animais bem estabelecidael para grande triagem química. Um recente de rastreio de pequenas moléculas químicas realizadas em peixes-zebra antioxidantes identificados como moduladores de neurónios dopaminérgicos de sobrevivência, que é gravemente afectado em doenças neurodegenerativas de mamíferos, tais como a doença de Parkinson 53. Este método pode ser usado para o rastreio de novas moléculas pro-ou anti-oxidante in vivo.

Importância e Limitações

A proeminência de ambos "toda montagem" e aos métodos de detecção de ROS "unicelulares" baseia-se na capacidade de executar em medições in vivo do estresse oxidativo, utilizando técnicas laboratoriais simples e equipamentos básicos. A aplicação do peixe-zebra como um modelo animal em combinação com sondas ROS-detecção permite não apenas a mera revelação de estresse oxidativo, mas também a sua detecção no contexto de um organismo vivo e a quantificação do nível de tecidos individuais. Mais importante, estes ensaios podem serrealizada com instrumentos disponíveis comercialmente e não requerem conhecimento específico a ser realizado. Além disso, ambos os métodos não são processos demorados e pode ser aplicado com tempo adequado para grandes conjuntos de amostras. Todos juntos essas vantagens práticas tornam estes métodos de particular importância para melhorar a análise do estresse oxidativo in vivo.

No entanto, estes ensaios mostram também algumas limitações. Em geral, a maioria das sondas ROS-sensíveis agora disponíveis no mercado não são valorizados para a análise qualitativa e quantitativa multa de níveis de estresse oxidativo em células vivas. O hidroetidina comumente utilizado e sondas MitoSOX foram concebidos para a detecção do superóxido (O2 -.), Mas, recentemente, as preocupações sobre a sua especificidade foram levantadas, especialmente quando utilizando ensaios baseados em fluorescência 54. Analogamente alguns relatórios avançados dúvidas sobre a diacetate diclorofluoresceína (DCFH-DA) para H exclusivo 2 2 detecção 55,56. Além disso, estes sondas fluorescentes redox-ativo são caracterizados por ativação não específica parcial (ou seja, tecido auto-fluorescência) e não são reversíveis após a oxidação. Uma vez que a sonda fluorescente é oxidado pelo ROS não pode voltar ao seu estado reduzido não fluorescente. Por conseguinte, a detecção de variações de ROS com resolução temporal é limitado pela aplicação de tais sondas químicas 43.

Uma limitação considerável deste campo é representado pela falta de sondas para a detecção exclusiva de RNS. Recentemente, as metodologias baseadas proteomic demonstrado que RNS induzir modificações de proteínas que são considerados como biomarcadores do stress nitroso-activa e pode ser avaliada por meio de ensaios de imuno-mancha, utilizando anticorpos específicos para a proteína de oxidação / nitração (por exemplo, anti-SNO-cisteína, anti-3- nitrotirosina) 22,23. No entanto, todos estes ensaios são apenas medidas indiretas de stre oxidativoss desencadeada por RNS e na maioria dos casos que requerem extractos celulares, o que significa que eles não são aplicáveis ​​para as células vivas ou embriões de peixe-zebra vivos.

Uma alternativa válida para sondas convencionais é representada por proteínas fluorescentes sensíveis redox geneticamente codificados. Os principais constituintes deste grupo são: roGFP, derivado de proteínas fluorescentes verdes, rxYFP e cpYFP, ​​ambos derivados da proteína fluorescente amarela ea sonda hiper, um H 2 O específico sonda fluorescente 2-sensível 57. Todas estas sondas redox engenharia criados por proteínas fluorescentes permitir quantificações de medida proporcional à base de fluorescência e permitem maior resolução temporal (de segundos a minutos) do que as sondas químicas 58. Aplicação in vivo destes biosensores também é possível, como demonstrado pela linha transgénico de peixe-zebra que expressa hiper para a detecção em tempo real da H 2 O 2 endógeno níveis 39,59. Eumplementing o peixe-zebra com sensores codificados geneticamente oferece um sistema ideal para investigar o estresse oxidativo, mas exige a criação de uma linha de animal transgênico e ferramentas de imagem apropriados. O procedimento para a detecção de stress oxidativo em peixes-zebra aqui apresentados é menos precisa do que os métodos genéticos, mas é rápida e fornece um ensaio primário para a detecção in vivo de níveis elevados de espécies pró-oxidativas. A medição precisa de oxigênio reativo individual e / ou espécies de nitrogênio é atualmente um limite deste campo de pesquisa. No futuro, as próximas sensores redox em nanoescala pode ajudar a resolver este problema. A aplicação bem sucedida de sensores de nanopartículas e nanotubos de redox base foi testado em vários estudos in vitro, mas não está disponível como ensaios in vivo até agora 60.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hydrogen peroxide solution SIGMA 516813 DO NOT STORE DILUITIONS
Hank's Balanced Salt Solution 1x GIBCO 14025
Methyl cellulose SIGMA M0387
Instant Ocean Aquarium Sea Salt Mixture INSTANT OCEAN SS15-10
Tricaine SIGMA A5040
Cgeneric ROS-sensitive probe: CellROX Deep Red Reagent INVITROGEN C10422
Mitochondria specific ROS-sensitive probe: MitoSOX  INVITROGEN M36008 dissolve one vial with 13 μl of DMSO
Hydroethidine INVITROGEN D23107
Rotenone SIGMA R8875 Prepare 5 mM stock solution in DMSO. 
Dimethyl sulfoxide SIGMA D2650
VAS2870; 3-Benzyl-7-(2-benzoxazolyl)thio-1,2,3-triazolo(4,5-d)pyrimidine EnzoLifeScience BML-EI395 dissolve the powder in DMSO; diluite in fish water
Propidium Iodide  Molecular probes
(Life Technologies)
P3566
7-aminoactinomycin D (7-AAD)  Molecular probes
(Life Technologies)
A1310
Nrf2a Morpholino GeneTools 5'-CATTTCAATCTCCAT
CATGTCTCAG-3'
Ref: Timme-LaLaragy et al.; 2012 (PMID: 22174413); Kobayashi et al.; 2002 (PMID:12167159)
Collagenase P ROCHE 11213857001 Dissolve the powder at 100 mg/ml in sterile HBSS. Store aliquots at -20 °C
Phosphate-Buffered Saline (PBS) GIBCO 10010-056
Fetal Bovine Serum  GIBCO 10082-147
Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets ROCHE Dissolve one tablet in 1 ml of water
0.5% Trypsin-EDTA (10x), no phenol red GIBCO 15400-054 Prepare 1x working solution before usage
Compound microscope  ZEISS
Stereo microscope with fluorescent illumination Nikon AZ100
Camera ZEISS AxioCamMRm
software for fluorescence image acquisition ZEISS ZEN 2011
Fluorescence-activated cell sorter BD FACSCalibur
Centrifuge  Eppendorf 5417R
FACS tubes  BD 342065
Multiwell Plate  BD Falcon 353047
Sterilized, non treated Petri dishes 90 mm VWR 391-1915
Confocal microscope Leica Leica SP5

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References

  1. Alfadda, A. A., Sallam, R. M. Reactive oxygen species in health and disease. J Biomed Biotechnol. 2012, (2012).
  2. Lu, T., Finkel, T. Free radicals and senescence. Exp Cell Res. 314, 1918-1922 (2008).
  3. Chen, A. F., et al. Free radical biology of the cardiovascular system. Clin Sci (Lond. 123, 73-91 (2012).
  4. Selvaraju, V., et al. Diabetes, oxidative stress, molecular mechanism, and cardiovascular disease--an overview. Toxicol Mech Methods. 22, 330-335 (2012).
  5. Gandhi, S., Abramov, A. Y. Mechanism of oxidative stress in neurodegeneration. Oxid Med Cell Longev. 2012, (2012).
  6. Shi, X., Zhang, Y., Zheng, J., Pan, J. Reactive oxygen species in cancer stem cells. Antioxid Redox Signal. 16, 1215-1228 (2012).
  7. Cui, X. Reactive oxygen species: the achilles' heel of cancer cells. Antioxid Redox Signal. 16, 1212-1214 (2012).
  8. Park, H., Bourla, A. B., Kastner, D. L., Colbert, R. A., Siegel, R. M. Lighting the fires within: the cell biology of autoinflammatory diseases. Nat Rev Immunol. 12, 570-580 (2012).
  9. Nathan, C., Ding, A. SnapShot: Reactive Oxygen Intermediates (ROI). Cell. 140, 951-951 (2010).
  10. Brown, G. C., Borutaite, V. Interactions between nitric oxide, oxygen, reactive oxygen species and reactive nitrogen species. Biochem Soc Trans. 34, 953-956 (2006).
  11. Brieger, K., Schiavone, S., Miller, F. J., Krause, K. H. Reactive oxygen species: from health to disease. Swiss Med Wkly. 142, (2012).
  12. Littarru, G. P., Tiano, L., Belardinelli, R., Watts, G. F. Coenzyme Q(10), endothelial function, and cardiovascular disease. Biofactors. 37, 366-373 (2011).
  13. Landete, J. M. Dietary intake of natural antioxidants: vitamins and polyphenols. Crit Rev Food Sci Nutr. 53, 706-721 (2013).
  14. Finkel, T. Oxidant signals and oxidative stress. Curr Opin Cell Biol. 15, 247-254 (2003).
  15. Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417, 1-13 (2009).
  16. Sarsour, E. H., Kumar, M. G., Chaudhuri, L., Kalen, A. L., Goswami, P. C. Redox control of the cell cycle in health and disease. Antioxid Redox Signal. 11, 2985-3011 (2009).
  17. Nathan, C., Shiloh, M. U. Reactive oxygen and nitrogen intermediates in the relationship between mammalian hosts and microbial pathogens. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 8841-8848 (2000).
  18. Finkel, T. Signal transduction by reactive oxygen species. J Cell Biol. 194, 7-15 (2011).
  19. Autreaux, B., Toledano, M. B. ROS as signalling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 813-824 (2007).
  20. Maryanovich, M., Gross, A. A ROS rheostat for cell fate regulation. Trends Cell Biol. 23, 129-134 (2013).
  21. Tonks, N. K. Redox redux: revisiting PTPs and the control of cell signaling. Cell. 121, 667-670 (2005).
  22. Antelmann, H., Helmann, J. D. Thiol-based redox switches and gene regulation. Antioxid Redox Signal. 14, 1049-1063 (2011).
  23. Foster, M. W., Hess, D. T., Stamler, J. S. Protein S-nitrosylation in health and disease: a current perspective. Trends Mol Med. 15, 391-404 (2009).
  24. Albrecht, S. C., Barata, A. G., Grosshans, J., Teleman, A. A., Dick, T. P. In vivo mapping of hydrogen peroxide and oxidized glutathione reveals chemical and regional specificity of redox homeostasis. Cell Metab. 14, 819-829 (2011).
  25. Knoefler, D., et al. Quantitative in vivo redox sensors uncover oxidative stress as an early event in life. Mol Cell. 47, 767-776 (2012).
  26. Fang, L., Miller, Y. I. Emerging applications for zebrafish as a model organism to study oxidative mechanisms and their roles in inflammation and vascular accumulation of oxidized lipids. Free Radic Biol Med. 53, 1411-1420 (2012).
  27. White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
  28. Amatruda, J. F., Patton, E. E. Genetic models of cancer in zebrafish. Int Rev Cell Mol Biol. 271, 1-34 (2008).
  29. Jing, L., Zon, L. I. Zebrafish as a model for normal and malignant hematopoiesis. Dis Model Mech. 4, 433-438 (2011).
  30. Shin, J. T., Fishman, M. C. From Zebrafish to human: modular medical models. Annu Rev Genomics Hum Genet. 3, 311-340 (2002).
  31. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
  32. Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Dev Cell. 21, 48-64 (2011).
  33. Duan, J., Yu, Y., Li, Y., Sun, Z. Cardiovascular toxicity evaluation of silica nanoparticles in endothelial cells and zebrafish model. Biomaterials. 34, 5853-5862 (2013).
  34. Sobrino-Figueroa, A. S. Evaluation of oxidative stress and genetic damage caused by detergents in the zebrafish Danio rerio (Cyprinidae). Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 165, 528-532 (2013).
  35. Xu, H., et al. Oxidative stress and immune related gene expression following exposure to di-n-butyl phthalate and diethyl phthalate in zebrafish embryos. Ecotoxicol Environ Saf. 93, 39-44 (2013).
  36. Hermann, A. C., Millard, P. J., Blake, S. L., Kim, C. H. Development of a respiratory burst assay using zebrafish kidneys and embryos. J Immunol Methods. 292, 119-129 (2004).
  37. Rieger, S., Sagasti, A. Hydrogen peroxide promotes injury-induced peripheral sensory axon regeneration in the zebrafish skin. PLoS Biol. 9, (2011).
  38. Timme-Laragy, A. R., et al. Nrf2b, novel zebrafish paralog of oxidant-responsive transcription factor NF-E2-related factor 2 (NRF2). J Biol Chem. 287, 4609-4627 (2012).
  39. Niethammer, P., Grabher, C., Look, A. T., Mitchison, T. J. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459, 996-999 (2009).
  40. Murphy, M. P., et al. Perspective. Cell Metabolism. 13 (4), 361-366 (2011).
  41. Li, N., et al. Mitochondrial complex I inhibitor rotenone induces apoptosis through enhancing mitochondrial reactive oxygen species production. J Biol Chem. 278, 8516-8525 (2003).
  42. Rhee, S. G., Chang, T. S., Jeong, W., Kang, D. Methods for detection and measurement of hydrogen peroxide inside and outside of cells. Mol Cells. 29, 539-549 (2010).
  43. Murphy, M. P., et al. Unraveling the biological roles of reactive oxygen species. Cell Metab. 13, 361-366 (2011).
  44. Covassin, L., et al. Global analysis of hematopoietic and vascular endothelial gene expression by tissue specific microarray profiling in zebrafish. Dev Biol. 299, 551-562 (2006).
  45. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
  46. Beis, D., Stainier, D. Y. In vivo cell biology: following the zebrafish trend. Trends Cell Biol. 16, 105-112 (2006).
  47. Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140, 2835-2846 (2013).
  48. Moussavi Nik, S. H., et al. The BACE1-PSEN-AbetaPP regulatory axis has an ancient role in response to low oxygen/oxidative stress. J Alzheimers Dis. 28, 515-530 (2012).
  49. Matthews, R. P., et al. TNFalpha-dependent hepatic steatosis and liver degeneration caused by mutation of zebrafish S-adenosylhomocysteine hydrolase. Development. 136, 865-875 (2009).
  50. Mukaigasa, K., et al. Genetic evidence of an evolutionarily conserved role for Nrf2 in the protection against oxidative stress. Mol Cell Biol. 32, 4455-4461 (2012).
  51. Mugoni, V., et al. Ubiad1 is an antioxidant enzyme that regulates eNOS activity by CoQ10 synthesis. Cell. 152, 504-518 (2013).
  52. Dowling, J. J., et al. Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy. Brain. 135, 1115-1127 (2012).
  53. Sun, Y., Dong, Z., Khodabakhsh, H., Chatterjee, S., Guo, S. Zebrafish chemical screening reveals the impairment of dopaminergic neuronal survival by cardiac glycosides. PLoS One. 7, (2012).
  54. Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radic Biol Med. 48, 983-1001 (2010).
  55. Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy. Free Radic Res. 44, 587-604 (2010).
  56. Karlsson, M., Kurz, T., Brunk, U. T., Nilsson, S. E., Frennesson, C. I. What does the commonly used DCF test for oxidative stress really show. Biochem J. 428, 183-190 (2010).
  57. Belousov, V. V., et al. Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nat Methods. 3, 281-286 (2006).
  58. Bjornberg, O., Ostergaard, H., Winther, J. R. Measuring intracellular redox conditions using GFP-based sensors. Antioxid Redox Signal. 8, 354-361 (2006).
  59. Yoo, S. K., Starnes, T. W., Deng, Q., Huttenlocher, A. Lyn is a redox sensor that mediates leukocyte wound attraction in vivo. Nature. 480, 109-112 (2011).
  60. Uusitalo, L. M., Hempel, N. Recent Advances in Intracellular and In Vivo ROS Sensing: Focus on Nanoparticle and Nanotube Applications. Int J Mol Sci. 13, 10660-10679 (2012).

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Biologia do Desenvolvimento edição 89, Os embriões de peixe-zebra células endoteliais a análise do estado redox detecção de estresse oxidativo, FACS (fluorescência ativada classificador de células) sondas moleculares
Análise do estresse oxidativo em embriões Zebrafish
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Mugoni, V., Camporeale, A., Santoro, More

Mugoni, V., Camporeale, A., Santoro, M. M. Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (89), e51328, doi:10.3791/51328 (2014).

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