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Biology

Analyse du stress oxydatif dans embryons de poissons zèbres

Published: July 7, 2014 doi: 10.3791/51328
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Molecular Biotechnology and Health Science, University of Torino, 2Laboratory of Endothelial Molecular Biology, Vesalius Research Center, VIB

Abstract

Des niveaux élevés d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) peuvent entraîner une modification de l'état redox cellulaire vers l'état de stress oxydatif. Cette situation provoque l'oxydation de molécules (lipides, ADN, protéines) et conduit à la mort cellulaire. Le stress oxydatif a également un impact sur la progression de plusieurs pathologies telles que le diabète, les rétinopathies, la neurodégénérescence, et le cancer. Ainsi, il est important de définir des outils pour étudier les conditions de stress oxydatif, non seulement au niveau des cellules individuelles, mais aussi dans le contexte des organismes entiers. Ici, nous considérons l'embryon de poisson zèbre comme un utile système in vivo pour effectuer des études et présenter un protocole pour mesurer le stress oxydatif in vivo. Profitant de sondes fluorescentes ROS et des lignes fluorescentes de poisson zèbre transgénique, nous développons deux méthodes différentes pour mesurer le stress oxydatif in vivo: i) un "embryon toute méthode ROS-détection" pour la mesure qualitative du stress oxydatif et ii) un "unicellulaire ROS méthode de détection "pour des mesures quantitatives de stress oxydatif. Ici, nous démontrons l'efficacité de ces procédés, en augmentant le stress oxydatif dans les tissus par des agents oxydants et des méthodes physiologiques ou génétiques. Ce protocole est prête pour les écrans génétiques avant et il aidera relations adresse de cause à effet de ROS dans des modèles animaux de pathologies liées au stress oxydatif, comme les troubles neurologiques et le cancer.

Introduction

Le stress oxydatif est spécifiquement définie comme un état qui résulte d'un état redox cellulaire asymétrique. Les réactions d'oxydoréduction complexes qui se produisent régulièrement dans les cellules déterminent l'état redox cellulaire. Les réactions d'oxydoréduction sont constitués de toutes les réactions chimiques qui se composent dans le transfert d'électrons entre les atomes des molécules biologiques produisant la réduction et l'oxydation de molécules (à savoir les réactions d'oxydo-réduction). Ces réactions sont catalysées par des espèces activées électroniquement (par exemple des espèces pro-oxydantes), qui se caractérisent par une extrême instabilité structurelle et activation spontanée d'électrons asymétriques qui échangent avec les biomolécules voisins. Ces réactions résultent en irréguliers dommages à l'ADN, des protéines carboxylation, et l'oxydation des lipides, et peuvent conduire à une mort cellulaire 1. Des niveaux accrus de stress oxydatif ont été associées avec le vieillissement et la progression de différents états pathologiques 2. Le stress oxydatif aété signalé comme étant responsable de modifications vasculaires dans le diabète et les maladies cardio-vasculaires 3,4. Il joue également un rôle critique dans la dégénérescence neuronale dans la maladie d'Alzheimer et la maladie de Parkinson 5. En outre, le stress oxydatif a été démontré comme un facteur essentiel dans la gouvernance progression du cancer et les événements métastatiques 6,7. En outre, les réponses inflammatoires et immunitaires peuvent susciter et à soutenir davantage le stress oxydatif 8.

Dans les cellules vivantes, les espèces pro-oxydantes sont dérivées de l'oxygène (ROS, les espèces réactives de l'oxygène) ou de l'azote (RNS; espèces réactives de l'azote). ROS comprennent le radical hydroxyle, l'anion superoxyde (OH.) (O 2 -), et le peroxyde d'hydrogène (H 2 O 2). Le principal RNS est l'oxyde nitreux (NO).. Une série d'espèces réactives secondaires peut être généré par des interactions spontanées entrn ROS et RNS ou les ions métaux libres 9. Par exemple, l'anion superoxyde réagit avec l'oxyde nitreux pour former peroxynitrate (ONOO -), tandis que H 2 O 2 avec la réaction Fe 2 + génère des radicaux hydroxyle. ROS et RNS, en raison de leur capacité à réagir avec plusieurs biomolécules, sont considérés comme une menace dangereuse pour le maintien de l'état redox physiologiques 10. Pour maintenir les cellules de l'état d'oxydo-réduction sont équipées d'une série de détoxification de molécules anti-oxydantes et les enzymes. La superoxyde dismutase (SOD), catalase, glutathion peroxydase et peroxyrédoxines constitue essentiellement l'anti-oxydant enzymatique-arsenal qui fournit une protection cellulaire à partir d'espèces pro-oxydantes, y compris H 2 O 2, OH et OONO -. 11. Également des molécules anti-oxydantes comme la vitamine C et E, polyphénols et CoenzymeQ10 (CoQ10) sont d'une importance critique pour étancher ROS et leur dangereux derivatives 12,13. Cependant, une production excessive des ROS et RNS ou un dysfonctionnement dans le système anti-oxydant, déplace l'état redox cellulaire vers stress oxydatif 14.

Outre leur connotation négative, ROS peut jouer différents rôles physiologiques dans les cellules d'origine différente. Les cellules produisent normalement ROS comme molécules de signalisation de la médiation des événements biologiques normaux tels que la défense de l'hôte et la réparation des plaies 15-17. Les espèces réactives sont normalement produites dans les cellules par des enzymes intracellulaires telles que NOx (NADPH oxydase) et XO (xantine oxydase) en réponse à des facteurs de signalisation, des facteurs de croissance, et des fluctuations de niveaux intracellulaires de calcium 18,19. Il a été rapporté que les ROS peut différentiellement moduler l'activité des facteurs nucléaires importantes telles que p53 ou des composants cellulaires tels que l'ATM-kinase, un régulateur maître de la réponse aux dommages de l'ADN 20. Analogue ROS influencent fortement la signalisation cellulaire par la médiation eoxydation de e et l'inactivation des protéines tyrosine phosphatases (PTP), qui sont établis en tant que régulateurs critiques de la transduction du signal 21. En outre, la protéomique basée méthodologies démontrent que RNS sont également responsables de modifications et altérations de la signalisation moléculaire de protéines spécifiques. RNS réagissent avec les groupements thiols de cystéine en les modifiant en S-nitrothiols (SNO) et de déclenchement voies moléculaires concomitantes avec des états pathologiques tels que les maladies inflammatoires et auto-immunes 22,23.

Etant donné que des expériences de culture cellulaire ne se reproduisent que partiellement la multitude de facteurs qui agissent in vivo, il est d'un grand intérêt de réaliser des études d'oxydo-réduction dans les modèles animaux 24,25. Pour ce faire, le poisson-zèbre a été considéré comme un modèle animal vertébré approprié pour étudier la dynamique de stress oxydatif 26. Le poisson zèbre est un nouveau système de modèle qui accorde plusieurs avantages pour étudier les événements cellulaires et génétiques au cours des vertébrés developpement et la maladie. Grands groupes d'embryons hebdomadaire peuvent être générées et disponibles pour des besoins expérimentaux. En outre, la clarté optique extraordinaire embryons de poisson zèbre, ainsi que leur petite taille, permet l'imagerie cellulaire unique et le suivi dynamique dans toute une organismes 27. Dans la dernière décennie, un nombre considérable de mutants de poisson zèbre a été générée pour modéliser des conditions pathologiques comme le cancer et les maladies génétiques 28-31. Plus important encore, une multitude de lignées transgéniques ont été produites pour permettre de nombreuses possibilités de manipulations génétiques et biologiques 32. Par exemple, des lignées spécifiques de tissus de poisson-zèbre transgénique sont régulièrement utilisés pour des études in vivo. Ces lignées expriment une protéine fluorescente sous le contrôle d'un promoteur choisi, en offrant la possibilité d'identifier des cellules individuelles in vivo, ainsi que la structure anatomique qu'elles comprennent.

Plusieurs études toxicologiques ont déjà utilisé til de poisson zèbre pour évaluer l'effet in vivo de produits chimiques sur homéostasie redox, suggérant la pertinence de ce vertébré comme un modèle animal pour le domaine de la découverte de médicaments et le stress oxydatif 33-35. Même si certains des sondes fluorescentes ont été testés pour surveiller le stress oxydatif chez les larves de poisson zèbre 36,37, il n'y a pas de tests mis en place pour détecter et mesurer les niveaux de stress oxydatif dans les tissus de poisson zèbre et les cellules vivantes. Ici, nous décrivons un procédé pour la quantification in vivo du stress oxydatif dans les cellules d'embryons de poisson zèbre vivant. Les outils d'imagerie, tri FACS, des sondes fluorescentes et les conditions pro-oxydantes sont combinés pour générer simple test pour la détection et la quantification des espèces oxydantes dans des embryons et des tissus de poisson zèbre.

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Protocol

1. Préparation des instruments et solutions de travail

  1. Préparer la solution de l'eau des poissons. Préparez une solution en dissolvant 2 g de sel de mer de l'océan instantanée 'dans 50 ml d'eau distillée. Ajouter 1,5 ml de stocker l'eau de poissons à 1 L d'eau distillée pour préparer prêt à utiliser de l'eau de poisson (60 pg / ml sels de mer de concentration finale). Autoclave le prêt à utiliser l'eau du poisson avant l'utilisation. Cette solution est utilisée en tant que support d'embryon de poisson zèbre.
  2. Préparer la méthylcellulose pour le montage de l'embryon. Dissoudre 1,5 g de méthylcellulose dans 50 ml d'eau stérile de poisson. Faciliter la dissolution à l'aide d'un aimant sur une plaque d'agitation. La dissolution complète de la poudre peut nécessiter plusieurs heures. Vérifiez la solution pour plus de clarté et aliquote en petits tubes. Conserver à -20 ° C pendant des mois et dégeler aliquotes à usage. Centrifuger la méthylcellulose à 950 g pendant 5 min avant de l'utiliser. Éviter les cycles de gel-dégel de aliquotes.
  3. Préparer 50 ml de tricaine / acétate d'éthyle-3 benzoate msel éthanesulfonate (solution mère) en dissolvant 200 mg de tricaine dans 100 ml d'eau et ajuster le pH à 7,0 à l'aide de Tris-HCl 1 M (pH 9). Conservez ce stock à 4 ° C pendant au plus 30 jours. ATTENTION: tricaine est toxique. Utilisez conformément aux lignes directrices de traitement appropriées.
  4. Induisant un stress oxydatif dans les embryons de poisson zèbre
    1. Préparer une solution oxydante pour générique stress oxydatif induction: Faire 50 ml de solution d'oxydant par addition de H 2 O 2 stock solution (de peroxyde d'hydrogène; 100 mM) à l'eau du poisson. Utilisation de H 2 O 2 à une concentration finale comprise entre 2 mM et 100 pM. Préparer cette solution juste avant l'utilisation. La solution oxydante peut être appliqué à la fois toute la montagne ROS-détection et unicellulaires méthodes ROS-détection. Ne rangez pas cette solution. ATTENTION: H 2 O 2 est dangereux, et nocif par inhalation et par ingestion. Contact avec une matière combustible peut provoquer un incendie. Manipuler sous une hotte de laboratoire et porter pers appropriéeséquipement de protection onal.
    2. Préparer une solution oxydante pour mitochondries dérivés stress oxydatif induction: Faire une solution mère d'oxydant (5 mM) en dissolvant 3,9 mg de la roténone dans 2 ml de diméthylsulfoxyde (DMSO). Conserver cette solution à la température ambiante dans l'obscurité.
      1. Dissoudre la roténone solution stock à 10 ml d'eau de poissons pour faire une solution prête à utiliser. Utiliser la roténone à une concentration comprise entre 5 à 50 uM. Ne pas utiliser la roténone à des concentrations supérieures à 100 um. À des concentrations appropriées, cette solution oxydante peut être appliquée à la fois à l'ensemble de montage ROS-détection et monocellulaires méthodes de détection des ROS. ATTENTION: La roténone est toxique et dangereux. Manipuler selon les conseils de prudence appropriés.
    3. Induire un stress oxydatif par le gène knock-down: knock-down de l'expression du gène nrf2a dans embryons de poisson zèbre par micro-injection morpholino comme indiqué précédemment par Timme-Laragy A. et al, 2012 38..
    4. Provoquer oxidAtive stress après des lésions tissulaires: générer une marge de blessure à la nageoire caudale des embryons de poisson zèbre à 72 HPF comme décrit précédemment par Niethammer et al, 2009 39..
  5. Préparer 5 ml de solution ROS-détection pour cellule unique méthode ROS-détection:
    1. Solution pour la détection de ROS général: Dissoudre la sonde moléculaire ROS-sensible générique dans HBSS (solution saline équilibrée de Hanks) afin de préparer une solution de travail (gamme de concentration: 2,5-10 M). Cette solution doit être préparée peu avant utilisation.
    2. Solution pour la détection spécifique de ROS induite par les mitochondries: Peu de temps avant l'utilisation, dissoudre une sonde mitochondriale de ROS-sensible avec du DMSO faire une solution mère de 5 mM. Dissoudre solution mère dans du HBSS afin de préparer une solution de travail (gamme de concentration: 2,5-10 M).
      REMARQUE: Évitez la lumière et l'oxygène exposition de solutions de travail ROS-détection et leurs solutions mères respectives. Protéger le tube de la lumière à l'aideune feuille d'aluminium. Ne pas entreposer ou sondes réutilisation dissous dans du HBSS. Conserver les solutions mères à -20 ° C pendant un mois.
      ATTENTION: Manipuler sondes moléculaires et DMSO sous une hotte en conformité avec les lignes directrices appropriées.
  6. Préparer 5 ml de solution ROS-détection pour la méthode de montage ROS-détection: Dissoudre la solution sonde boursier ROS-sensible générique (stabilisé dans le DMSO) dans HBSS afin de préparer une solution de travail (gamme de concentration: 2,5-5 M). Evitez la lumière et de l'exposition à l'oxygène. Protéger le tube de la lumière. Préparer cette solution avant de l'utiliser. Ne pas stocker ou réutiliser cette solution. ATTENTION: Manipuler sondes moléculaires sous une hotte en conformité avec les lignes directrices appropriées.
  7. Ajoutez 25 ml de solution d'arrêt par addition de 10 ml de sérum bovin fœtal à 15 ml de PBS 1x. Conserver la solution stérile. Conserver cette solution à 4 ° C. Cette solution n'est nécessaire que pour une seule cellule - méthode de détection ROS.
  8. Régler l'incubateur de l'air de poisson zèbre à 28 ans &# 176; C.
  9. Régler la centrifugeuse à 4 ° C pour le procédé de détection de ROS cellulaire unique.

2. L'accouplement des poissons adultes et la sélection des embryons de poissons zèbres

  1. Mise en place adulte paire poisson zèbre traverse selon des protocoles standard 40. Sélectionnez la ligne transgénique approprié en fonction des besoins expérimentaux spécifiques.
  2. Ramassez les œufs et les placer dans un plat de 90 mm avec le milieu de l'eau du poisson / de l'embryon. Conserver les œufs à 28 ° C jusqu'à ce que les embryons vont se développer et croître jusqu'au stade désiré de développement (par exemple, 48 HPF, 72 HPF; HPF: heures après la fécondation).
  3. Écran pour le développement des embryons. Exclure tous les œufs non fécondés ou d'embryons sous-développés.
  4. Anesthésier embryons en ajoutant 1 ml de tricaïne (solution mère) dans 50 ml d'eau de poissons.
  5. Sélectionnez Tg embryons fluorescentes sous une loupe binoculaire.

3. Traitement des embryons avec l'agent oxydant

  1. Utilisez au moins 30 embryons entre 48 hpf et 72 HPF par des conditions différentes. Laver embryons fois à l'eau du poisson frais pour éliminer tricaine.
  2. Diviser embryons fluorescentes en trois plats. Ne pas placer plus de 30 embryons / plat.
  3. Retirer la solution de lavage et ajouter 10 ml de la solution d'oxydant ou de 10 ml d'eau du poisson comme solution de contrôle.
  4. Incuber les embryons pour 10 min à 1 h à 28 ° C. La période d'incubation dépend du niveau de stress oxydatif d'être induite dans des tissus spécifiques. De courtes périodes sont les meilleurs que les cellules touchées par le stress oxydatif subissent progressivement la mort cellulaire.
  5. embryons de transfert dans un nouveau plat contenant HBSS et embryons de lavage en remuant. Pré-HBSS chaud à 28 ° C.

4. Méthode de détection Mont ROS entier

  1. Recueillir des embryons après traitement oxydant et mettre pas plus de 10 embryons dans un petit tube. Rincer avec de l'HBSS autant que possible. Protéger le tube de la lumière en utilisant une feuille d'aluminium.
  2. Ajouter 1 ml de solution de détection pour ROSchaque tube.
  3. Incuber les embryons dans l'obscurité pendant 15 min à 28 ° C pour éviter l'exposition de la lumière.
  4. Pendant la durée d'incubation préparer une lame de verre pour l'analyse de l'embryon entier. Mettez 300 pi de méthylcellulose sur une "dépression" lame de verre et l'étaler sur la surface du verre avec une pointe de pipette. Éviter les bulles tout en libérant la méthylcellulose.
  5. A la fin de la période d'incubation, retirer immédiatement la solution ROS-détection et laver deux fois avec 2 ml de HBSS. Laver les embryons en renversant le tube plusieurs fois. Ne pas pipeter ou vortex.
  6. embryons en une pipette Pasteur en verre de Aspirer. embryons de position près de l'ouverture de la pipette et en douceur les éjectent dans la méthylcellulose. Orienter les embryons de manière appropriée avec un fil de nylon fin.
  7. Comparer la fluorescence des embryons de contrôle avec des embryons traités. Alternativement, fixer les paramètres de la loupe binoculaire ou microscope confocal fluorescence de sorte que tous les embryons sont imagées par la mêmeparamètres d'imagerie.

5. Single Cell méthode ROS-détection

  1. Commencez à l'étape: 3.5. Assurez-vous d'avoir au moins 35 embryons pour chaque condition.
  2. Transfert d'embryons dans un nouveau plat. Enlever l'eau des poissons autant que possible. Ajouter 10 ml de PBS glacé 1x et 400 pi de inhibiteurs de la protéase cocktail. Dechorionate manuellement embryons avec une pince et retirer le sac du jaune d'oeuf avec une aiguille fine. Remarque: la suppression jaune sac assure échantillons propres pour l'analyse FACS suivant. Cette étape peut être évité selon l'instrument FACS.
  3. Transfert de-vitellins embryons dans une plaque de 24 puits à puits multiples (15 embryons / puits) et supprimer toute l'eau du poisson.
  4. Ajouter 300 ul de HBSS, 30 pl de la collagénase P, 50 ul de trypsine-EDTA dans chaque puits.
  5. Homogénéiser embryons par un léger pipetage de haut en bas avec une pointe de pipette serré (1000 pi).
  6. Incuber à 28 ° C pendant 20 min et l'homogénéiser les échantillons par pipetage toutes les 5 min.
  7. Vérifiez DISR tissuuption en observant une aliquote de homogénat au microscope composé. Faciliter la suspension de cellules individuelles par pipetage. Ne pas incuber les embryons pendant plus de 30 min.
  8. Arrêter la réaction en ajoutant 200 ul de solution d'arrêt. Mélanger à la pipette doucement.
  9. Transférer la suspension cellulaire dans un tube pré-réfrigérés avec fond étanche. Gardez le tube sur la glace et éviter l'exposition de la lumière.
  10. Centrifuger pendant 5 minutes à 250 g à 4 ° C.
  11. Retirez la phase supérieure et les cellules re-suspension avec de la glace froide HBSS par pipetage.
  12. Compter les cellules et assurez-vous que vous avez le même nombre de cellules dans l'ensemble de vos échantillons. Ne pas utiliser moins de 2 x 10 6 cellules.
  13. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 250 xg à 4 ° C.
  14. Retirer le surnageant et suspendre le culot avec 1 ml de glace réfrigéré HBSS contenant la sonde ROS-sensible.
  15. Incuber le tube à la température ambiante pendant 3 minutes dans l'obscurité. Varier la durée d'incubation en fonction du niveau de stress oxydatif et à til sensibilité de la sonde.
  16. Transférer les cellules dans un tube FACS. Garder les tubes sur la glace et éviter l'exposition de lumière avant l'analyse FACS.
  17. Trier les cellules avec un trieur de cellules activé par fluorescence (FACS). Longueurs d'onde réglée conformément à fluorescence Tg de tissu (par exemple, la GFP) et les spectres d'excitation / émission de la sonde moléculaire utilisée pour la détection ROS (par exemple, les sondes ROS-sensibles mitochondriales spécifiques, sondes ROS-sensibles génériques).
  18. Pour chaque condition, mesurer tous les échantillons dans la même séance expérimentale en appliquant les mêmes paramètres FACS. Calculer le pourcentage de cellules fluorescentes comme la moyenne des différentes répétitions biologiques. Analyser au moins deux répétitions pour chaque condition.

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Representative Results

En appliquant la méthode décrite ici, nous pouvons facilement mesurer et détecter le stress oxydatif (et niveaux de ROS) dans les tissus embryonnaires de poisson zèbre. Après avoir traversé le poisson zèbre adulte, les oeufs sont recueillis et ont permis de développer à 28 ° C à 72 heures après la fécondation (HPF). Pour induire un stress oxydatif, nous proposons deux approches différentes: 1) le traitement des embryons avec de fortes réactifs pro-oxydants ou 2) la promotion de la formation de ROS après une lésion tissulaire.

Dans la première approche, nous avons utilisé deux réactifs différents en fonction des besoins spécifiques: le peroxyde d'hydrogène (H 2 O 2), que l'agent générique cellulaire ROS former, et la roténone, que le pilote spécifique ROS mitochondriale. La roténone est un inhibiteur de complexe I de la CET, qui dérégulations sont causal du stress oxydatif 41.

Dans la seconde approche, nous avons induit l'accumulation de ROS par la création d'une blessure à la nageoire caudale d'un embryon de poisson zèbre39. Par ailleurs, les conditions de stress oxydatif peuvent être promus dans les tissus de poisson zèbre en abattant avec injection de morpholino la voie de réponse antioxydant Nrf2 qui est la défense cellulaire primaire contre les effets cytotoxiques du stress oxydatif 38.

Une fois que le stress oxydatif est induit dans les embryons de poisson zèbre, l'accumulation d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) peut être mesurée en utilisant des sondes spécifiques ROS-sensibles générique ou mitochondriales, qui deviennent fluorescentes lors de l'activation (par exemple l'oxydation).

Embryons traités peuvent être analysés en utilisant la méthode de l'ensemble support-ROS détection ou par application de la méthode de détection de cellules ROS unique comme résumé dans la figure 1. La sélection entre les modes se fonde sur la nécessité d'effectuer une mesure qualitative ou quantitative d'un stress oxydatif. Les résultats représentatifs de ces deux méthodes sont représentés sur la figure 2 la figure 3.

Tout le mont Méthode ROS-détection

La figure 2 montre l'application de l'ensemble du procédé de montage ROS-détection pour l'imagerie in vivo du stress oxydatif. En particulier, cette méthode a été appliquée pour suivre à la fois le stress "forte" oxydant généré par des traitements pro-oxydants exogènes, ainsi que le stress "bas" à l'oxydation produite par des conditions plus physiologiques telles que des plaies ou des blessures délétion du gène.

Niveaux physiologiques des espèces oxydantes sont induites par la génération d'un micro blessure ou une plaie large à la nageoire caudale d'un embryon de poisson zèbre en direct à 72 HPF. Il a été démontré que, après blessure, H 2 O 2 s'accumule à la plaie marge de 20 min après la blessure 39. Afin de visualiser l'accumulation du stress oxydatif sur le bord de la plaie, les embryons ont été incubés avec un génériqueSonde ROS-sensible et imagée à 20 min après avoir blessé 39. En comparant intactes ailerons de queue avec des queues blessés, il est possible de distinguer une accumulation de la sonde fluorescente à la marge de la plaie (Figure 2A). Faible signal non spécifique de fluorescence est détectée à travers le tissu queue de fin dans les deux conditions.

Afin de valider l'accumulation spécifique de la sonde ROS sensible à la marge de la plaie, le H 2 O 2 au niveau de la plaie ont été abaissés par une approche pharmacologique. Comme il a été démontré que la marge de la plaie H 2 O 2 accumulation est extrêmement sensible à la VAS2870 DUOX inhibiteur 39, les embryons ont été pré-traitées avec cet inhibiteur avant blessant. La comparaison de la fluorescence de la sonde sensible à la ROS, de l'EVA embryons pré-traitées et les témoins respectifs, indique que le signal est fonction de l'accumulation des ROS (c.-H 2 O 2) (Figure 2B).

En outre, nous avons généré des niveaux élevés d'espèces oxydantes dans les tissus de poisson zèbre en traitant embryons de poisson zèbre à la roténone. Embryons et les contrôles roténone traités ont été incubées avec une sonde ROS-sensible générique de détecter spécifiquement les espèces ROS. Ensuite, la sonde a été emporté et les embryons ont été imagée sous un microscope de fluorescence stéréo. Le stress oxydatif a été détectée dans l'ensemble du corps de l'embryon (figure 2C). Images à fort grossissement montrent régions anatomiques où la sonde est métabolisé succès (figure 2D). Images de champ lumineux (panneaux supérieurs) distinguent les structures anatomiques, tandis que les images de fluorescence (panneaux inférieurs) indiquent les cellules ROS-positifs. Comme le montrent les images fluorescentes, les résultats sont essentiellement un rapport qualitatif de détection d'un stress oxydatif, qui est obtenue en comparant le contrôle avec des embryons traités.

Single CellMéthode de détection-ROS

Figure 3 rapports FACS représentatifs des parcelles et la quantification du stress oxydatif par application de la méthode de détection ROS d'une seule cellule. Cette méthode a été adaptée pour mesurer les niveaux de stress oxydatif dans les cellules de poisson zèbre qui ont été soumis à des conditions pro-oxydantes comme indiqué dans le protocole et détaillées dans les légendes des figures. Comme décrit, le stress oxydatif a été mesurée par incubation de tissus de poisson zèbre dissociées en cellules individuelles avec une sonde moléculaire ROS-sensible. Depuis la procédure de dissociation et la FACS lui-même peut causer des dommages aux cellules, l'analyse des échantillons exige que seuls les «cellules vivantes» sont pris en compte pour le stress oxydatif quantification. En conséquence, les cellules dissociées sont analysés en sélectionnant la fraction de cellules présentant des paramètres physiques de la cellule "en direct" (figure 3A) et en excluant les cellules mortes (figure 3B). Ainsi, les échantillons sont quantifiés pourle niveau de stress oxydatif selon la fluorescence de la sonde sensible à la ROS et pour montrer une fluorescence endogène tel que la positivité pour la GFP (Figure 3C). Un échantillon de contrôle négatif de la sonde ROS-sensible doit être inclus afin d'évaluer le stress oxydatif induit par la manipulation et les procédures techniques (figure 3C; panneau: Contrôle -). Relative FACS terrain quantification a démontré dans des histogrammes montrant mesures de différentes répétitions biologiques (figure 3D-E).

Outre le niveau de stress oxydatif sur la quantification des traitements de peroxyde d'hydrogène, cette méthode a été appliquée pour quantifier les niveaux de stress oxydatif dans des conditions physiologiques telles nous en morphants nrf2a et contrôles respectifs (figure 3F).

De plus, en combinant la méthode de détection de ROS unicellulaire avec des sondes spécifiques ROS-sensibles tels nous mitochondrial ROsondes de S-sensible, il est également possible de mesurer le stress oxydatif dans le cadre de pro-oxydants traitements de mitochondries ciblées spécifiques (figure 3G).

Figure 1

Figure 1. Figure schématique de la méthode pour mesurer les niveaux de ROS dans les embryons de poisson zèbre. Adultes de poisson zèbre sont croisés dans les bassins d'élevage appropriées. Les œufs fécondés sont ensuite collectés dans des boîtes et stockées à 28 ° C pour permettre à l'embryon de se développer pleinement. Induction de stress oxydatif peut être réalisé de différentes manières, soit par des traitements pharmaceutiques ou par injurieux génétiques ou physiques. Alternativement, dans le cas d'un mutant génétique est analysé, il est possible de sauter cette incubation et aller de l'avant. À ce stade, il est possible de procéder selon deux méthodes différentes. Selon le «tout montant méthode ROS-détection "(à gauche), embryons de poisson zèbre sont immédiatement mis à incuber avec un fluorescent sonde (1) puis analysés par fluorescence ou microscope confocal (2) ROS-sensible. Dans le procédé "à une seule cellule ROS-détection" (à droite), les embryons de poisson zèbre sont dissociés en des cellules uniques (1), mis en incubation avec un fluorescent sonde ROS-sensible (2) et analysées par FACS pour la détection de la fluorescence et de quantification (3). Bien que la méthode "toute la montagne-ROS détection" permet la détection du stress oxydatif dans les embryons vivants principalement comme un test qualitatif, "sur la base de cellule unique" méthode des subventions à la fois qualitatifs et quantitatifs de mesures des niveaux de stress oxydatif.

Figure 2
Figure 2. Des résultats représentatifs de l'ensemble du procédé de montage ROS-détection. A) embryons de poisson zèbre à 72 HPF ont été soumisà blesser comme décrit précédemment par Niethammer et al, 2009 39.. images confocales représentatives montrent espèces pro-oxydantes (ROS) accumulation (pointe de flèche) à la marge de la nageoire caudale blessés de la plaie. espèces oxydantes ont été détectés avec la sonde générique ROS (CellROX; 2,5 M) 20 min après la blessure a été faite. La barre d'échelle 20 um. B) images confocales représentatives montrant marge enroulée embryons de poisson zèbre à 72 HPF. Les embryons ont été prétraitées avec VAS2870 (20 uM) ou du DMSO pendant 90 min avant de la plaie a été faite. ROS ont été détectés avec une sonde générique ROS-sensible (CellROX; 2,5 M) 20 min après blessure. La barre d'échelle 20 um. C) l'image du corps entier montrant le stress oxydatif induit par la roténone dans embryons de poissons zèbres. Le stress oxydatif est fortement détectée dans la région caudale de l'embryon, comme indiqué dans le panneau D). La roténone est un inhibiteur puissant de ETC mitochondrial affectant principalement skelcellules musculaires etal chez le poisson zèbre. La barre d'échelle, 180 um.

Figure 3
Figure 3. Des résultats représentatifs des cellules individuelles de la méthode ROS-détection. A) représentant FACS graphique montrant un échantillon typique de embryons de poisson zèbre dissociée de cellules individuelles. Les cellules vivantes sont déclenchés dans la région R1 selon des paramètres FSC-H et SSC-H. SSC-H: 539 (tension), 1.0 (AmpGain), mode: linéaire; FSC-H:. E00 (Tension), 2.1 (AmpGain) B) représentant FACS graphique montrant un échantillon typique de embryons de poisson zèbre dissociée de cellules individuelles. Avant l'analyse FACS, l'échantillon a été incubé avec l'iodure de propidium (PI; 1 ug / ml) pendant 5 min. Les cellules mortes sont déclenchés sur la région R2 selon une fluorescence PI (FL2-H canal). FSC-H: E00 (tension), 2.1 (AmpGain), mode: linéaire, SSC-H: 539 (tension), 1.0 (AmpGain), Mode: liprès. Tension Chaînes: FL-2:. 613 Connexion C) FACS représentatifs des graphiques représentant dissociés embryons de poisson zèbre soumis à un traitement pro-oxydant (H 2 O 2) et des contrôles respectifs. Les cellules endothéliales sont visualisés par canal de la GFP. Parcelles FACS représentent toutes les cellules touchées par le stress oxydatif (ROS) sur UL et UR. Cellules négatives sont portées sur quadrants inférieurs (LL et LR). Tg (Kdrl: GFP) dans des embryons de poisson zèbre S843 48hpf ont été incubées avec H 2 O 2 (2 mM) ou de H 2 O en tant que témoin pendant 10 min. Avant l'analyse FACS, les embryons sont traités comme décrit dans le protocole. Les cellules affectées par le stress oxydatif sont détectés en utilisant une sonde générique ROS sensible fluorescent (CellROX; 2,5 uM). Un échantillon non incubées avec la sonde ROS-sensible a été inclus comme contrôle négatif. Comparaison de l'échantillon soumis à des traitements pro-oxydant avec la commande correspondante, le nombre de cellules tracée sur quadrants supérieurs (UL + UR) est plus élevée. FACS acquisparamètres de ition étaient comme suit: les canaux de tension: FL-1: 582 Connexion; FL-4:. 410 Connexion D) Histogramme montrant le pourcentage de cellules (UL + UR) touchés par le stress oxydatif dans H 2 O 2 embryons traités et le contrôle respectif. Les mesures sont liées à des échantillons présentés dans C. Les cellules affectées par le stress oxydatif sont détectés en utilisant une sonde générique ROS sensible fluorescent (CellROX; 2,5 uM). Les résultats sont la moyenne de n = 2 réplicats biologiques différents ± SD. E) histogramme montrant le pourcentage de cellules endothéliales (GFP +) affecté par le stress oxydatif (ROS +) H 2 O dans des embryons de 2-traitées et contrôle respectif. Les mesures sont liées à des échantillons présentés dans C. Les résultats sont la moyenne de n = 2 répétitions biologiques différents ± SD. F) histogramme montrant le pourcentage de cellules touchées par le stress oxydatif (ROS +) dans morphants nrf2a (nrf2a MO) et des contrôles respectifs(Ctrl MO) à 24 HPF. Les résultats sont la moyenne de n = 2 répétitions biologiques différents ± SD G) histogramme montrant le pourcentage de cellules touchées par le stress oxydatif mitochondrial dans les embryons traités (de roténone;. 10 M) et les contrôles respectifs (Ctrl; DMSO) à 72 HPF. Après dissociation des embryons en cellules individuelles, le stress oxydatif mitochondrial (ROS mitochondriale +) a été mesurée avec une sonde spécifique des mitochondries (MitoSOX; 5 uM). Les résultats sont la moyenne de n = 3 répétitions biologiques différents ± SD.

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Discussion

Étapes critiques

La procédure de détection d'un stress oxydatif dans les embryons de poisson zèbre décrits ici comprend deux méthodes différentes. L'ensemble de la méthode de montage ROS-détection est principalement un dosage qualitatif pour ROS-détection, tandis que la méthode de détection de ROS cellulaire unique permet des mesures quantitatives plus précises (figure 1). Les deux méthodes offrent un moyen rapide et facile d'évaluer in vivo ROS-détection sur embryons de poisson zèbre. Cependant, ils ont tous deux présentent des étapes critiques.

Étapes critiques liés à la méthode I

La première méthode pour le montage ROS détection ensemble a le grand avantage de détecter facilement le stress oxydatif dans tous les tissus d'embryons vivants (figure 2). Cependant, il ya trois aspects critiques importants qui doivent être considérés et pourraient influer sur le résultat de l'analyse: 1) la perméabilité de la sonde de tissus d'embryons, 2) la toxicité de la sonde et 3) ee sonde sensibilité à faible concentration de ROS.

Le premier aspect est spécifiquement lié à l'application in vivo de la méthode 42. La "cellule perméabilité" propriété de la sonde ROS-sensible est un élément essentiel pour la réalisation de ce test. Idéalement, tous les produits chimiques solubles dans l'eau sont optimales pour la livraison dans embryons de poissons zèbres vivants; Cependant la plupart des réactifs pour la détection de stress oxydatif sont insolubles dans l'eau. Ainsi, il est généralement recommandé d'utiliser des sondes qui sont solubles dans le DMSO (diméthylsulfoxyde).

Il existe de possibles effets toxiques sur les embryons liées à la concentration de la sonde ROS. Les effets secondaires sont généralement représentés par des dommages aux tissus (par exemple la nécrose) ou le métabolisme accéléré de la sonde. Incubations longues (jours) de embryons de poisson zèbre avec le hydroéthidine cause sonde embryon mort tandis que de fortes doses de 5 - (et 6)-carboxy-2 ', les résultats de diacétate de fluorescéine dans 7'-nsur accumulation spécifique de la fluorescence dans l'intestin (données non publiées). Pour surmonter ce problème, il est important de surveiller les embryons au cours de l'incubation avec la sonde. Tests de plusieurs concentrations et des temps d'incubation avec la même sonde seraient bénéfiques aussi bien. Le temps d'incubation optimal permet la livraison et l'oxydation de la sonde moléculaire sans dommages des tissus superficiels. Des temps d'incubation à l'aide de sondes chimiques (0,5 à 10 uM) peuvent être fixés en général dans la gamme de 10 à 30 min et ne pas dépasser 1 h. Cette condition peut être assez difficile à mettre en place surtout quand la quantité d'espèces oxydantes est proche des niveaux physiologiques ou lorsqu'il est restreinte aux tissus embryonnaires internes. En effet, quand un organisme entier est incubé avec une sonde chimique ROS-détection, les tissus les plus superficielles (par exemple de la peau, les yeux et le coeur) sont où la sonde est principalement oxydé et devient fluorescente. Par la suite, la sonde est progressivement délivrée aux organes internes, le foie ou déjàxelles. En conséquence, une durée appropriée pour l'incubation des embryons de poisson zèbre avec la sonde de détection de ROS est essentiel pour détecter un stress oxydatif dans tous les tissus.

Enfin, quand on utilise ce procédé, il est important de tenir compte de la sensibilité de la sonde pour le niveau de stress oxydatif exprimé par les tissus. La plupart des sondes disponibles dans le commerce ne sont pas finement caractérisé pour leur sensibilité et cela signifie que la sonde optimale pour des applications spécifiques doit être déterminée de façon empirique. Toutes les sondes ROS-sensibles détectent généralement des niveaux élevés de stress oxydatif, mais la plupart d'entre eux ne sont pas sensibles aux variations minimes des niveaux de stress oxydatif 43.

Afin de limiter cet inconvénient et permettre une analyse plus détaillée et plus précise, il est suggéré d'appliquer la deuxième méthode basée sur la détection des cellules individuelles du stress oxydatif.

Étapes critiques associés à la méthode II

Le sIngle-cellule méthode ROS détection présente quelques étapes cruciales. Elles sont déterminées essentiellement par: 1) l'efficacité de la dissociation de cellules embryonnaires et par 2) le type de sonde ROS sensible associée à l'essai.

La dissociation des embryons dans des cellules individuelles a été adapté à partir de protocoles antérieurs pour l'analyse cellulaire poisson zèbre par cytométrie de flux 44 et présente deux aspects essentiels qui influent fortement sur ​​l'issue de la procédure. Le premier aspect concerne la méthode utilisée pour dissocier les embryons, alors que la seconde est liée à la récupération des cellules dissociées.

La dissociation d'embryons en cellules individuelles est principalement contrôlée par la concentration des réactifs de dissociation (par exemple la collagénase P et de la trypsine). Cependant, il doit être considéré que l'efficacité de dissociation des tissus dépend du nombre d'embryons couvés et leur stade de développement. Embryons de poisson zèbre à des stades précoces de développement (24 HPF-48 HPF) sont plus sensibles aux réactifs de dissociation que les larves (96 HPF-120 HPF) en raison de tissus progressistes croissance 45. Ainsi, des ajustements à la procédure de dissociation sont requis lorsqu'on travaille avec embryons de poisson zèbre à différents stades de développement de 72 HPF. Incubation avec des réactifs excessive provoque la mort cellulaire, alors que la concentration réduite de réactifs se dissocie partiellement les embryons. Comme il est important de ventiler correctement les tissus, il est tout aussi important de recueillir et de conserver des cellules individuelles. Une considération importante est la température à laquelle les cellules sont récupérées après division de tissu. Il est important de maintenir les cellules sur de la glace ou à 4 ° C pendant la centrifugation afin de limiter le stress oxydatif secondaire à une rupture mécanique des tissus ou des procédures de manipulation.

La deuxième étape critique en ce qui concerne la sonde correspondante est liée à l'analyse d'un tissu spécifique d'intérêt. La meilleure façon de détecter une popul cellulairetion chez le poisson zèbre est offert par le large éventail de lignées transgéniques qui ont été mis en place au cours des dernières décennies 46,47. Toutefois, la fluorescence de la lignée transgénique doit être compatible avec la sonde de détection de ROS. Il est essentiel d'éviter la diaphonie entre la fluorescence de fond de tissu et le bas, mais, signal spécifique de la fluorescence émise par la sonde.

Les applications de ce protocole

Considérant les deux méthodes offrent un dosage facile et efficace et rentable pour mesurer le stress oxydatif in vivo, il est possible d'appliquer ce protocole à plusieurs conditions:

Les mesures de stress oxydatif dans différents génétiques (par exemple, pathologiques) Conditions

Oxydant et gènes antioxydants peuvent être facilement modulés en embryons de poisson zèbre par l'injection de morpholinos (perte de fonction) ou ARNm (gain de fonction). Expériences récemment signalés de gène knock-down et la microinjection de l'ARNm coiffés en embryons de poisson zèbre établi des rôles différents pour les gènes antioxydants Nrf2a et Nrf2b dans la protection des cellules contre le stress oxydatif au cours du développement. Approches de la modulation de l'expression des gènes évalués un axe conservée évolutionnaire entre les mammifères et poisson-zèbre à la réponse à l'hypoxie et le stress oxydatif dans les cellules neuronales 38,48. En outre, une excellente occasion d'étudier le stress oxydatif est offert par plusieurs lignées mutantes de poisson zèbre. Par exemple, le poisson zèbre ducttrip (dtp) du mutant représente un exemple intéressant pour la caractérisation du stress oxydant par rapport à un état ​​pathologique. Le mutant dtp porte une déficience de l'hydrolase de S-adénosylhomocystéine (AHCY) gène et sa caractérisation ont montré que la perte d'activité AHCY provoque une dégénérescence du foie en influençant les niveaux de ROS 49. De manière équivalente, le poisson zèbre mutant fh318 Nrf2, portant une foncti perte d'n mutation du gène Nrf2 de facteur de transcription, a été considéré avec beaucoup d'intérêt d'étudier le rôle de protection de ce gène antioxydant chez les vertébrés inférieurs 50.

Les mesures de Redox État déclenchées par des composés pharmaceutiques

Le traitement des embryons de poisson zèbre avec de petits médicaments peuvent inhiber ou activer le stress oxydatif. Nous démontrons récemment que le traitement par statine de embryons de poisson zèbre stress oxydatif qui peut être récupéré par le traitement CoQ10 51 induites. Sinon, l'analyse du stress oxydatif dans le modèle animal de poisson zèbre pour myopathies liées à RYR1 humains a souligné le rôle de la CNA de médicaments anti-oxydant (N-acétyl-cystéine) comme une approche thérapeutique potentielle pour la maladie du muscle 52.

Le dépistage à grande échelle de petites molécules et de médicaments pour caractériser leurs propriétés oxydatives

Le poisson zèbre est un mod animal bien établiel pour grande criblage chimique. Un criblage chimique de petites molécules récentes effectuées en poisson zèbre antioxydants identifiés comme modulateurs de la survie des neurones dopaminergiques, qui est gravement affectée au cours de maladies neurodégénératives de mammifères telles que la maladie de Parkinson 53. Cette méthode peut être utilisée pour cribler de nouvelles molécules pro-ou anti-oxydants in vivo.

Portée et limites

L'importance des deux "toute la montagne" et les méthodes de détection des ROS "unicellulaires" repose sur la capacité à effectuer des mesures in vivo du stress oxydatif en utilisant des techniques de laboratoire et d'équipements simples de base. L'application du poisson zèbre comme un modèle animal, en combinaison avec des sondes de détection-ROS permet non seulement de la simple révélation du stress oxydatif, mais également sa détection dans le contexte d'un organisme vivant et de quantification au niveau des tissus simples. Fait important, ces dosages peuvent êtreréalisée avec les outils disponibles dans le commerce et ne nécessitent pas d'expertise spécifique à réaliser. En outre, les deux méthodes ne sont pas beaucoup de temps et les procédures peuvent être appliquées en fonction du temps approprié pour de grandes séries d'échantillons. L'ensemble de ces avantages pratiques font de ces méthodes d'une importance particulière pour améliorer oxydatif analyse des contraintes in vivo.

Toutefois, ces analyses montrent aussi certaines limites. En général, la plupart des sondes ROS-sensibles maintenant disponibles dans le commerce ne sont pas évalués pour l'analyse qualitative et quantitative amende de niveaux de stress oxydatif dans les cellules vivantes. Le hydroéthidine couramment utilisé et MitoSOX sondes ont été conçues pour la détection de la superoxyde (O 2 -.), Mais récemment, des préoccupations concernant leur spécificité a été soulevée, en particulier lors de l'utilisation des dosages basés sur la fluorescence 54. Analogue certains rapports avancés des doutes quant à la diacétate de fluorescéine (DCFH-DA) pour H exclusive 2 2 de détection 55,56. En outre, ces sondes fluorescentes redox sont caractérisés par une activation non spécifique partiel (c. tissu auto-fluorescence) et ne sont pas réversibles après l'oxydation. Une fois la sonde fluorescente est oxydé par les ROS, il ne peut pas revenir à son état réduit non fluorescent. Par conséquent, la détection des fluctuations ROS avec une résolution temporelle est limitée par l'application de ces sondes chimiques 43.

Une limitation importante de ce domaine est représenté par l'absence de sondes de détection exclusif RNS. Récemment, la protéomique à base de méthodologies ont démontré que RNS induire des modifications de protéines qui sont considérées comme des biomarqueurs de stress nitroso-actifs et peuvent être évaluées par l'intermédiaire d'essais de immunoblot en utilisant des anticorps spécifiques à l'oxydation des protéines / nitration (par exemple, anti-SNO-cystéine, l'anti-3- Nitrotyrosine) 22,23. Cependant, tous ces dosages ne sont que des mesures indirectes de l'oxydation stress déclenchée par RNS et dans la plupart des cas, ils exigent des extraits cellulaires, ce qui signifie qu'ils ne sont pas applicables à des cellules vivantes ou de vivre des embryons de poisson zèbre de.

Une alternative valable aux sondes classiques est représenté par les protéines fluorescentes codées génétiquement redox sensibles. Les principaux constituants de ce groupe sont: roGFP, dérivé de protéines fluorescentes vertes, rxYFP et cpYFP, ​​deux dérivés de la protéine fluorescente jaune et la sonde hyper, un H 2 O 2 spécifique sensible sonde fluorescente 57. Toutes ces sondes d'oxydo-réduction par génie créés par des protéines fluorescentes permettent quantifications ratiométriques basées sur la fluorescence et permettre une résolution temporelle plus élevée (de quelques secondes à minutes) que les sondes chimiques 58. In vivo application de ces biocapteurs est également possible comme le montre la lignée transgénique poisson zèbre exprimant HyPer pour la détection en temps réel de H 2 O 2 endogène des niveaux 39,59. Jea mise en oeuvre du poisson-zèbre avec des capteurs codés génétiquement propose un système optimal pour enquêter sur le stress oxydatif, mais nécessite la mise en place d'une ligne d'animaux transgéniques et des outils d'imagerie appropriées. La procédure pour la détection du stress oxydatif chez le poisson zèbre présenté ici est moins précis que les méthodes génétiques, mais est rapide et fournit un premier dosage pour la détection in vivo des niveaux élevés d'espèces pro-oxydantes. La mesure précise de l'oxygène réactif individuel et / ou espèces d'azote est actuellement une limite de ce domaine de recherche. Dans l'avenir, venir redox capteurs nanométriques pourraient aider à résoudre ce problème. L'application réussie de redox-capteurs sur la base de nanoparticules et de nanotubes a été testé dans plusieurs études in vitro, mais non disponible en tant que dosages in vivo jusqu'à présent 60.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hydrogen peroxide solution SIGMA 516813 DO NOT STORE DILUITIONS
Hank's Balanced Salt Solution 1x GIBCO 14025
Methyl cellulose SIGMA M0387
Instant Ocean Aquarium Sea Salt Mixture INSTANT OCEAN SS15-10
Tricaine SIGMA A5040
Cgeneric ROS-sensitive probe: CellROX Deep Red Reagent INVITROGEN C10422
Mitochondria specific ROS-sensitive probe: MitoSOX  INVITROGEN M36008 dissolve one vial with 13 μl of DMSO
Hydroethidine INVITROGEN D23107
Rotenone SIGMA R8875 Prepare 5 mM stock solution in DMSO. 
Dimethyl sulfoxide SIGMA D2650
VAS2870; 3-Benzyl-7-(2-benzoxazolyl)thio-1,2,3-triazolo(4,5-d)pyrimidine EnzoLifeScience BML-EI395 dissolve the powder in DMSO; diluite in fish water
Propidium Iodide  Molecular probes
(Life Technologies)		 P3566
7-aminoactinomycin D (7-AAD)  Molecular probes
(Life Technologies)		 A1310
Nrf2a Morpholino GeneTools 5'-CATTTCAATCTCCAT
CATGTCTCAG-3'		 Ref: Timme-LaLaragy et al.; 2012 (PMID: 22174413); Kobayashi et al.; 2002 (PMID:12167159)
Collagenase P ROCHE 11213857001 Dissolve the powder at 100 mg/ml in sterile HBSS. Store aliquots at -20 °C
Phosphate-Buffered Saline (PBS) GIBCO 10010-056
Fetal Bovine Serum  GIBCO 10082-147
Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets ROCHE Dissolve one tablet in 1 ml of water
0.5% Trypsin-EDTA (10x), no phenol red GIBCO 15400-054 Prepare 1x working solution before usage
Compound microscope  ZEISS
Stereo microscope with fluorescent illumination Nikon AZ100
Camera ZEISS AxioCamMRm
software for fluorescence image acquisition ZEISS ZEN 2011
Fluorescence-activated cell sorter BD FACSCalibur
Centrifuge  Eppendorf 5417R
FACS tubes  BD 342065
Multiwell Plate  BD Falcon 353047
Sterilized, non treated Petri dishes 90 mm VWR 391-1915
Confocal microscope Leica Leica SP5

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Biologie du Développement numéro 89, Embryons de poisson zèbre les cellules endothéliales l'analyse de l'état d'oxydoréduction la détection du stress oxydatif, FACS (fluorescence trieur de cellules) des sondes moléculaires
Analyse du stress oxydatif dans embryons de poissons zèbres
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Mugoni, V., Camporeale, A., Santoro, … More

Mugoni, V., Camporeale, A., Santoro, M. M. Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (89), e51328, doi:10.3791/51328 (2014).

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