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Biology

Análisis de estrés oxidativo en embriones de pez cebra

Published: July 7, 2014 doi: 10.3791/51328
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Molecular Biotechnology and Health Science, University of Torino, 2Laboratory of Endothelial Molecular Biology, Vesalius Research Center, VIB

Abstract

Los altos niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) pueden causar un cambio de estado redox celular hacia condiciones de estrés oxidativo. Esta situación provoca la oxidación de moléculas (lípidos, ADN, proteínas) y conduce a la muerte celular. El estrés oxidativo también afecta a la progresión de varias condiciones patológicas tales como la diabetes, retinopatías, la neurodegeneración, y el cáncer. Por lo tanto, es importante definir herramientas para investigar las condiciones de estrés oxidativo no sólo a nivel de células individuales, sino también en el contexto de organismos enteros. En este sentido, consideramos que el embrión de pez cebra como un útil sistema vivo en llevar a cabo este tipo de estudios y presentar un protocolo para medir in vivo de estrés oxidativo. Aprovechando fluorescentes sondas ROS y líneas fluorescentes transgénicos de pez cebra, se desarrollan dos métodos diferentes de medir el estrés oxidativo in vivo: i) un "todo embrión método ROS-detección" para la medición cualitativa de estrés oxidativo y ii) una "una sola célula método de detección de ROS "para mediciones cuantitativas de estrés oxidativo. En este documento, se demuestra la eficacia de estos procedimientos, aumentando el estrés oxidativo en los tejidos por agentes oxidantes y métodos fisiológicos o genéticos. Este protocolo se presta para pantallas adelante genéticos y ayudará relaciones dirección de causa-efecto de ROS en modelos animales de patologías relacionadas con el estrés oxidativo, tales como trastornos neurológicos y cáncer.

Introduction

El estrés oxidativo se define específicamente como una condición que resulta de un estado redox celular desequilibrada. Las complejas reacciones redox que ocurren de manera rutinaria dentro de las células determinan el estado redox celular. Las reacciones redox consisten en todas las reacciones químicas que consisten en la transferencia de electrones entre los átomos de las moléculas biológicas que producen la reducción y la oxidación de moléculas (es decir, reacciones redox). Estas reacciones son catalizadas por especies electrónicamente activadas (es decir, especies pro-oxidantes), que se caracterizan por una inestabilidad estructural extrema y la activación espontánea de electrones desequilibradas que intercambian con biomoléculas vecinos. Estas reacciones irregulares resultan en daño en el ADN, carboxilación de proteínas, y la oxidación de lípidos, y finalmente conducen a la muerte celular 1. Aumento de los niveles de estrés oxidativo se han asociado con el envejecimiento y la progresión de diversos estados patológicos 2. El estrés oxidativo tieneha informado que es responsable de alteraciones vasculares en la diabetes y enfermedades cardiovasculares 3,4. También juega un papel crítico en la degeneración neuronal en la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson 5. Además, el estrés oxidativo se ha demostrado como un factor crítico en el gobierno de la progresión del cáncer y los acontecimientos metastásicos 6,7. Además, las respuestas inmunes y la inflamación pueden provocar y el estrés oxidativo más apoyo 8.

En las células vivas, las especies pro-oxidativos derivan de oxígeno (ROS, especies reactivas de oxígeno) o nitrógeno (RNS, especies reactivas de nitrógeno). ROS incluyen el radical hidroxilo, el anión superóxido (OH). (O 2 -) y el peróxido de hidrógeno (H 2 O 2). El principal RNS es el óxido nitroso (NO.). Una serie de especies reactivas secundarias puede ser generada por interacciones espontáneas between de ROS y RNS o metales libres iones 9. Por ejemplo, el anión superóxido reacciona con el óxido nitroso para formar peroxinitrato (ONOO -), mientras que H 2 O 2 reaccionar con Fe 2 + genera radicales hidroxilo. ROS y RNS, debido a su capacidad para reaccionar con varios biomoléculas, se consideran una amenaza peligrosa para el mantenimiento del estado redox fisiológica 10. Para mantener las células estado redox están equipadas con una serie de desintoxicación de moléculas anti-oxidantes y enzimas. La superóxido dismutasa (SOD), catalasa, glutatión peroxidasa y peroxirredoxinas constituye esencialmente el antioxidante enzimático-arsenal que proporciona protección celular a partir de especies pro-oxidantes incluyendo H 2 O 2, OH y OONO -. 11. También moléculas antioxidantes como la vitamina C y E, polifenoles y CoenzymeQ10 (CoQ10) son de importancia crítica para saciar ROS y su peligrosa derivatives 12,13. Sin embargo, una producción excesiva de ROS y RNS, o una disfunción en el sistema anti-oxidante, cambia el estado redox celular hacia el estrés oxidativo 14.

Además de su connotación negativa, ROS puede desempeñar diversas funciones fisiológicas en células de origen diferente. Las células normalmente producen ROS como moléculas de señalización para mediar acontecimientos biológicos normales, tales como la defensa del huésped y la reparación de heridas 15-17. Normalmente las especies reactivas se producen en las células por las enzimas intracelulares tales como NOx (NADPH oxidasa) y XO (xantina oxidasa) en respuesta a factores de señalización, factores de crecimiento, y las fluctuaciones de los niveles de calcio intracelulares de 18,19. Se ha informado de que las ROS puede diferencialmente modular la actividad de los factores nucleares importantes tales como p53 o componentes celulares, tales como la ATM-quinasa, un regulador maestro de la respuesta al daño del ADN 20. Análogamente ROS influyen fuertemente en la señalización celular por mediación ªe oxidación e inactivación de proteína tirosina fosfatasas (PTP), que se establecen como reguladores críticos de la transducción de la señal 21. Por otra parte, las metodologías proteómicas basadas demuestran que RNS también son responsables de modificaciones y alteraciones de señalización molecular de proteínas específicas. RNS reaccionan con los grupos tiol de cisteína modificadores de ellos en S-nitrothiols (SNO) y desencadenantes vías moleculares concomitantes con estados patológicos tales como enfermedades inflamatorias y autoinmunes 22,23.

Desde los experimentos de cultivo de células se reproducen sólo parcialmente la multitud de factores que actúan in vivo, es de gran interés para llevar a cabo estudios redox en modelos animales 24,25. Para lograr esto, el pez cebra se ha considerado un modelo animal vertebrado adecuado para estudiar la dinámica de estrés oxidativo 26. El pez cebra es un nuevo modelo de sistema que otorga una serie de ventajas para el estudio de los eventos celulares y genéticos durante dev vertebradoselopment y la enfermedad. Grandes agrupaciones de embriones pueden ser generados y disponibles semanal para las necesidades experimentales. Además, la claridad óptica extraordinaria de embriones de pez cebra, así como su pequeño tamaño, permite imágenes de células única y el seguimiento dinámico en toda una organismos 27. En la última década, un número considerable de pez cebra mutantes se han generado para modelar las condiciones patológicas humanas, tales como el cáncer y enfermedades genéticas 28-31. Lo más importante, una multitud de líneas transgénicas ha sido producido para permitir amplias posibilidades de manipulaciones genéticas y biológicas 32. Por ejemplo, las líneas de pez cebra en tejidos específicos de transgénicos son utilizados regularmente por los estudios in vivo. Estas líneas expresan una proteína fluorescente bajo el control de un promotor seleccionado, ofreciendo la capacidad de identificar células individuales in vivo, así como la estructura anatómica que comprenden.

Varios estudios toxicológicos ya han utilizado tque el pez cebra para evaluar el efecto in vivo de los productos químicos sobre la homeostasis redox, lo que sugiere la idoneidad de este vertebrado como un modelo animal para el campo del descubrimiento de fármacos y el estrés oxidativo 33-35. A pesar de que algunas sondas fluorescentes se han probado para controlar el estrés oxidativo en larvas de pez cebra 36,37, no hay ensayos establecidos para detectar y medir los niveles de estrés oxidativo en los tejidos del pez cebra y las células vivas. Aquí se describe un procedimiento para la cuantificación in vivo de estrés oxidativo en las células de embriones de pez cebra que viven. Herramientas de diagnóstico por imágenes, la separación FACS, sondas fluorescentes y las condiciones pro-oxidativos se combinan para generar un simple ensayo para la detección y cuantificación de especies oxidativas en los embriones y tejidos de pez cebra.

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Protocol

1. Preparación de Instrumentos y Working Solutions

  1. Preparar la solución de agua los peces. Hacer una solución madre disolviendo 2 g de sales marinas 'Instantánea Océano' en 50 ml de agua destilada. Añadir 1,5 ml de existencias de peces de agua a 1 l de agua destilada para preparar listo para utilizar peces de agua (sales marinas 60 microgramos / ml concentración final). Autoclave listo para el uso del agua de pescado antes de su uso. Esta solución se utiliza como medio de embrión de pez cebra.
  2. Preparar metilcelulosa para montaje embrión. Disolver 1,5 g de metilcelulosa en 50 ml de agua estéril peces. Facilitar la disolución mediante el uso de un imán en una placa de agitación. La disolución completa del polvo puede requerir varias horas. Revise la solución para la claridad y la alícuota en pequeños tubos. Almacenar a -20 ° C durante meses y descongelar alícuotas a su uso. Centrifugar la metilcelulosa a 950 xg durante 5 min antes de usar. Evite los ciclos de congelación y descongelación de alícuotas.
  3. Preparar 50 ml de tricaína / acetato de 3-aminobenzoato msal de etanosulfonato (solución madre) por disolución de 200 mg de tricaína en 100 ml de agua y ajustar el pH a 7,0 usando Tris-HCl 1 M (pH 9). Guarde esta población a 4 º C durante no más de 30 días. PRECAUCIÓN: tricaína es tóxico. Use de acuerdo con las pautas de manejo apropiadas.
  4. La inducción de estrés oxidativo en embriones de pez cebra
    1. Preparar una solución oxidante por medicamentos genéricos de inducción de estrés oxidativo: Hacer 50 ml de solución oxidante mediante la adición de H 2 O 2 solución madre (peróxido de hidrógeno; 100 mM) al agua los peces. Utilice H 2 O 2 de una concentración final entre 2 mM y 100 mM. Preparar esta solución poco antes de su uso. La solución oxidante se puede aplicar tanto a todo el montaje de ROS-detección y una sola célula de métodos de detección de ROS. No guarde esta solución. PRECAUCIÓN: H 2 O 2 es peligroso y nocivo por inhalación y por ingestión. El contacto con material combustible puede causar fuego. Manipular bajo una campana de humos y desgaste pers apropiadasequipo de protección onal.
    2. Preparar una solución oxidante para las mitocondrias derivadas del estrés oxidativo por inducción: Haga una solución de oxidante (5 mM) por disolución de 3,9 mg de rotenona en 2 ml de dimetilsulfóxido (DMSO). Conservar esta solución a temperatura ambiente en la oscuridad.
      1. Disolver la rotenona solución madre a 10 ml de agua de pescado para hacer una solución lista para usar. Utilice rotenona a una concentración entre 5-50 mM. No utilice rotenona a concentraciones superiores a 100 mM. A concentraciones apropiadas, esta solución oxidante se puede aplicar tanto a todo el montaje de ROS-detección y una sola célula de métodos de detección de ROS. PRECAUCIÓN: La rotenona es tóxico y peligroso. Proceder conforme consejos de prudencia apropiados.
    3. Inducir el estrés oxidativo al gen knock-down: Knock-down expresión génica nrf2a en embriones de pez cebra mediante microinyección morfolino como se informó anteriormente por Timme-Laragy A. et al, 2012 38..
    4. Inducir oxidAtive estrés después de daño tisular: generar un margen de la herida en la aleta de la cola de embriones de pez cebra a las 72 HPF como se ha descrito previamente por Niethammer et al, 2009 39..
  5. Preparar 5 ml de solución de ROS-detección de una sola célula método ROS-detección:
    1. Solución para la detección de ROS en general: Disolver la sonda molecular de ROS-sensible genérico en HBSS (solución salina equilibrada de Hanks) con el fin de preparar una solución de trabajo (intervalo de concentración: 2,5-10 mM). Esta solución debe prepararse poco antes de su uso.
    2. Solución para la detección específica de ROS inducida por las mitocondrias: Poco antes de su utilización, se disuelven una sonda ROS-sensible mitocondrial con DMSO hacer una solución madre 5 mM. Disolver solución madre en HBSS con el fin de preparar una solución de trabajo (intervalo de concentración: 2,5-10 mM).
      NOTA: Evite la luz y el oxígeno de la exposición de las soluciones de trabajo ROS-detección y sus respectivas soluciones madre. Evite que el tubo de la luz mediante el uso deuna lámina de aluminio. No almacene o reutilización sondas disueltos en HBSS. Guarde las soluciones madre a -20 ° C durante un mes.
      PRECAUCIÓN: manipule sondas moleculares y DMSO bajo una campana de humos de acuerdo con las directrices pertinentes.
  6. Preparar 5 ml de solución de ROS-detección para la totalidad del método de montaje de ROS-detección: Disolver la solución de la sonda de stock de ROS-sensible genérico (estabilizado en DMSO) en HBSS con el fin de preparar una solución de trabajo (intervalo de concentración: 2,5-5 M). Evite la luz y la exposición al oxígeno. Evite que el tubo de la luz. Preparar esta solución antes de su uso. No almacene o volver a utilizar esta solución. PRECAUCIÓN: manipule sondas moleculares bajo una campana de extracción de acuerdo con las directrices pertinentes.
  7. Hacer 25 ml de solución de parada mediante la adición de 10 ml de suero fetal bovino a 15 ml de PBS 1x. Mantenga solución estéril. Almacenar esta solución a 4 ° C. Se requiere esta solución sólo para una sola célula - método de detección de ROS.
  8. Ajustar la incubadora de aire de pez cebra a 28 y# 176; C.
  9. Establecer la centrífuga a 4 ° C para el método de ROS-detección de una sola célula.

2. El apareamiento de peces adultos y selección de embriones de pez cebra

  1. Set-up de adultos par pez cebra cruza acuerdo con protocolos estándar 40. Seleccione la línea transgénica apropiada de acuerdo con las necesidades experimentales específicas.
  2. Recoger los huevos y colocarlos en un plato de 90 mm con medio de los peces de agua / embrión. Mantenga los huevos a 28 ° C hasta que los embriones se desarrollan y crecen a la etapa deseada del desarrollo (por ejemplo, 48 HPF, 72 HPF; HPF: horas después de la fecundación).
  3. Pantalla para el desarrollo de los embriones. Excluir todos los óvulos no fertilizados o embriones subdesarrollados.
  4. Anestesie embriones mediante la adición de 1 ml de tricaína (solución madre) en 50 ml de agua los peces.
  5. Seleccionar embriones fluorescentes Tg bajo un microscopio estereoscópico.

3. Tratamiento de los embriones con el agente oxidante

  1. Utilice por lo menos 30 embriones entre las 48 hpf y 72 HPF por diferentes condiciones. Lavar dos veces con embriones de peces de agua dulce para eliminar tricaína.
  2. Dividir embriones fluorescentes en tres platos. No coloque más de 30 embriones / plato.
  3. Retire la solución de lavado y añadir 10 ml de la solución oxidante o 10 ml de agua de pescado como solución de control.
  4. Incubar los embriones durante 10 min a 1 hora a 28 ° C. El período de incubación depende por el nivel de estrés oxidativo a ser inducida en tejidos específicos. Los períodos cortos son los mejores como las células afectadas por el estrés oxidativo sufren progresivamente la muerte celular.
  5. Transferencia de embriones en un nuevo plato que contiene HBSS y embriones de lavado por agitación. Pre-HBSS caliente a 28 ° C.

4. Toda Método de detección de Mount ROS

  1. Recoger los embriones después del tratamiento oxidante y poner no más de 10 embriones en un pequeño tubo. Enjuague con HBSS tanto como sea posible. Evite que el tubo de la luz utilizando papel de aluminio.
  2. Añadir 1 ml de solución de ROS-detección paracada tubo.
  3. Incubar los embriones en la oscuridad durante 15 min a 28 ° C para evitar la exposición a la luz.
  4. Durante el tiempo de incubación preparar un portaobjetos de vidrio para el análisis de embriones conjunto. Ponga 300 l de metilcelulosa en una "depresión" portaobjetos de vidrio y lo extendió sobre la superficie de cristal con una punta de pipeta. Evitar burbujas mientras que la liberación de la metilcelulosa.
  5. Al final del tiempo de incubación, retirar inmediatamente la solución de ROS-detección y lavar dos veces con 2 ml de HBSS. Lavar embriones invirtiendo el tubo varias veces. No pipetear o vórtice.
  6. Embriones Aspirar hasta en una pipeta Pasteur de vidrio. Posición embriones cerca de la abertura de la pipeta y suavemente les expulsan a la metilcelulosa. Orientar los embriones apropiadamente con una línea de nylon fino.
  7. Comparar la fluorescencia del control de los embriones con embriones tratados. Alternativamente, fijar los parámetros del microscopio estereoscópico de fluorescencia o un microscopio confocal de modo que todos los embriones son imágenes utilizando el mismola configuración de imagen.

5. Single Cell Método de detección de ROS

  1. Comience desde el paso: 3.5. Asegúrese de tener al menos 35 embriones para cada condición.
  2. Transferencia de embriones en un nuevo plato. Eliminar el agua los peces tanto como sea posible. Añadir 10 ml de helado de PBS 1x y 400 l de inhibidores de la proteasa Cocktail. Dechorionate manualmente embriones con unas pinzas y quite el saco vitelino con una aguja fina. Nota: Al eliminar el saco vitelino asegura muestras limpias para el siguiente análisis FACS. Este paso se puede evitar de acuerdo con instrumento de FACS.
  3. Transferencia de embriones de-yema en un 24 y placa de múltiples pocillos (15 embriones / pocillo) y retire toda el agua los peces.
  4. Añadir 300 l de HBSS, 30 l colagenasa P, 50 l de tripsina-EDTA en cada pocillo.
  5. Homogeneizar embriones pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de punta estrecha (1.000 l).
  6. Incubar a 28 ° C durante 20 min y homogeneizar las muestras mediante pipeteo cada 5 min.
  7. Compruebe DISR tejidouption observando una alícuota del homogeneizado en el microscopio compuesto. Facilitar la suspensión de células individuales con la pipeta. No incubar embriones durante más de 30 min.
  8. Detener la reacción añadiendo 200 l de solución de parada. Mezclar suavemente con la pipeta.
  9. Transferir la suspensión celular en un tubo de pre-refrigerada con la parte inferior apretado. Mantener el tubo en hielo y evitar exposición a la luz.
  10. Se centrifuga durante 5 minutos a 250 xga 4 º C.
  11. Retire la fase superior y volver a suspender las células con el hielo frío HBSS pipeteando suavemente.
  12. Contar las células y asegúrese de que tiene el mismo número de células en cada una de sus muestras. No utilice a menos de 2 x 10 6 células.
  13. Centrifugar las células durante 5 min a 250 x g a 4 ° C.
  14. Extraer el sobrenadante y suspender el sedimento con 1 ml de hielo enfriado HBSS que contenía la sonda de ROS-sensible.
  15. Incubar el tubo a temperatura ambiente durante 3 min en la oscuridad. Variar tiempo de incubación de acuerdo con el nivel de estrés oxidativo y para tque la sensibilidad de la sonda.
  16. Transferir las células a un tubo de FACS. Mantener los tubos en hielo y evitar exposición a la luz antes del análisis FACS.
  17. Clasificar células con un clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS). Longitudes de onda fijada de conformidad con Tg fluorescencia tejido (por ejemplo, las buenas prácticas agrarias) y los espectros de excitación / emisión de la sonda molecular utilizada para la detección de ROS (por ejemplo, las sondas de ROS mitocondriales sensibles específicos, sondas ROS-sensibles genéricos).
  18. Para cada condición, medir todas las muestras dentro de la misma sesión de análisis, aplicando los mismos parámetros de FACS. Calcular el porcentaje de células fluorescentes como la media de los diferentes biológicos repeticiones. Analizar al menos dos réplicas para cada condición.

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Representative Results

Al aplicar el método aquí descrito, se puede medir fácilmente y detectar el estrés oxidativo (y los niveles de ROS) en tejidos de embriones de pez cebra. Después de cruzar el pez cebra adultos, se recogen los huevos y se dejan desarrollar a 28 ° C a 72 h después de la fertilización (HPF). Con el fin de inducir el estrés oxidativo, se proponen dos enfoques diferentes: 1) el tratamiento de los embriones con fuertes reactivos pro-oxidantes o 2) la promoción de la formación de ROS después de la lesión tisular.

En el primer enfoque, se emplearon dos reactivos diferentes, de acuerdo a las necesidades específicas: el peróxido de hidrógeno (H 2 O 2), como el agente de formación de ROS celular genérico, y rotenona, como el controlador específico ROS mitocondrial. Rotenona es un inhibidor del complejo I de la ETC, que desregulaciones son causante de estrés oxidativo 41.

En el segundo enfoque, se indujo la acumulación de ROS mediante la creación de una herida en la aleta de la cola de un embrión de pez cebra39. Alternativamente, las condiciones de estrés oxidativo pueden ser promovidos en los tejidos de pez cebra por derribando con inyección morfolino la vía de respuesta antioxidante Nrf2 que es la defensa celular primaria contra los efectos citotóxicos de estrés oxidativo 38.

Una vez que el estrés oxidativo es inducida en embriones de pez cebra, la acumulación de especies reactivas de oxígeno (ROS) se puede medir mediante el uso de sondas de ROS-sensibles específicos genéricos o mitocondrial, que se convierten fluorescente tras la activación (es decir la oxidación).

Embriones tratados se pueden analizar mediante el uso de todo el método de montaje de ROS-detección o mediante la aplicación del método de detección sola célula-ROS tal como se resume en la Figura 1. La selección entre los métodos se basa en la necesidad de realizar una medición cualitativa o cuantitativa de estrés oxidativo. Los resultados representativos de ambos métodos están representados en la Figura 2 la Figura 3.

Todo el Método Monte ROS-detección

La figura 2 muestra la aplicación de todo el método de montaje de ROS-detección para formación de imágenes in vivo de estrés oxidativo. En particular, este método se ha aplicado a seguir tanto el estrés "fuerte" oxidativo generado por los tratamientos pro-oxidantes exógenos así como el estrés "bajo" oxidativo generado por más condiciones fisiológicas, tales como lesiones de la herida o deleción del gen.

Niveles fisiológicos de especies oxidativas son inducidos mediante la generación de una lesión en el micro o una gran herida en la aleta de la cola de un embrión de pez cebra en vivo a las 72 HPF. Se ha demostrado que después de la lesión, H 2 O 2 se acumula en la herida margen de 20 min después de la herida 39. Con el fin de visualizar la acumulación de estrés oxidativo en el margen de la herida, los embriones se incubaron con un genéricoSonda ROS-sensible y fotografiado a los 20 min después de la herida 39. Mediante la comparación de las aletas de cola intactas con colas de heridas, es posible distinguir una acumulación de la sonda fluorescente en el borde de la herida (Figura 2A). Se detecta la señal no específica de fluorescencia débil en todo el tejido de aleta de la cola en ambas condiciones.

Con el fin de validar la acumulación específica de la sonda de ROS-sensible en el borde de la herida, el H 2 O 2 niveles en la herida se han rebajado en un enfoque farmacológico. Puesto que se ha demostrado que el margen de la herida H 2 O 2 acumulación es extremadamente sensible a la VAS2870 DUOX-inhibidor 39, los embriones fueron pre-tratados con este inhibidor antes de la herida. La comparación de la fluorescencia de la sonda de ROS-sensible, desde Vas embriones de pre-tratados y controles respectivos, indica que la señal es dependiente de la acumulación de ROS (es decir, H 2 O 2) (Figura 2B).

Además, hemos generado altos niveles de especies oxidativas en los tejidos de pez cebra mediante el tratamiento de embriones de pez cebra con rotenona. Embriones y controles rotenona tratados se incubaron con una sonda de ROS-sensible genérico para detectar específicamente especies ROS. Después, la sonda se lavó a cabo y los embriones fueron imágenes bajo un microscopio de fluorescencia de estéreo. El estrés oxidativo se detectó en todo el cuerpo de los embriones (Figura 2C). Las imágenes de alta magnificación muestran regiones anatómicas donde la sonda se metaboliza correctamente (Figura 2D). Imágenes de campo brillante (paneles superiores) distinguen las estructuras anatómicas, mientras que las imágenes de fluorescencia (paneles inferiores) indican células ROS-positivos. Como se muestra por las imágenes fluorescentes los resultados son principalmente un informe cualitativa de detección de estrés oxidativo, que se logra mediante la comparación de control con los embriones tratados.

Single Cell-ROS Método de detección

Figura 3 informes de FACS representativos parcelas y cuantificación del estrés oxidativo mediante la aplicación del método de detección de ROS celular única. Este método ha sido adaptado para medir los niveles de estrés oxidativo en las células de pez cebra que fueron sometidos a condiciones de pro-oxidantes como se informa en el protocolo y detallados en leyendas de las figuras. Como se ha descrito, el estrés oxidativo se ha medido mediante la incubación de los tejidos de pez cebra disocia en células individuales con una sonda molecular de ROS-sensible. Dado que el procedimiento de disociación y la propia FACS pueden causar daño celular, el análisis de muestras requiere que sólo los "células vivas" se consideran para la cuantificación del estrés oxidativo. En consecuencia, las células disociadas se analizan mediante la selección de la fracción de células que muestran los parámetros físicos "célula viva" (Figura 3A) y mediante la exclusión de células muertas (Figura 3B). Por lo tanto, las muestras se cuantifican paralos niveles de estrés oxidativo de acuerdo con la fluorescencia de la sonda de ROS-sensible y por mostrar una fluorescencia endógena tales como la positividad para la GFP (Figura 3C). Una muestra de control negativo para la sonda de ROS-sensible debe ser incluido con el fin de evaluar el estrés oxidativo inducido por la manipulación y procedimientos técnicos (Figura 3C, panel de: control -). Relativa cuantificación parcela FACS demostró en los histogramas que muestran mediciones de diferentes biológicos repeticiones (Figura 3D-E).

Además el nivel de estrés oxidativo cuantificación sobre los tratamientos de peróxido de hidrógeno, este método ha sido aplicado para cuantificar los niveles de estrés oxidativo dentro de las condiciones fisiológicas tales nosotros en morphants nrf2a y controles respectivos (Figura 3F).

Por otra parte, mediante la combinación del método de detección de ROS de una sola célula con sondas ROS-sensibles específicos tales nosotros mitocondrial ROSondas S-sensible, también es posible medir el estrés oxidativo en el contexto de tratamientos pro-oxidantes mitocondrias específicas concretas (Figura 3G).

Figura 1

Figura 1. Figura esquemática del método para medir los niveles de ROS en embriones de pez cebra. Adultos de pez cebra se cruzan en los tanques de cría apropiadas. Los huevos fertilizados se recogen entonces en placas y se almacenaron a 28 ° C para permitir que el embrión se desarrolle completamente. Inducción de estrés oxidativo se puede lograr de diferentes maneras, ya sea por tratamientos farmacéuticos o por insultos genéticos o físicos. Alternativamente, en caso de que se analizó un mutante genético, es posible omitir esta incubación y moverse hacia adelante. En este punto, es posible proceder a dos métodos diferentes. Según el "todo mount método ROS-detección "(izquierda), los embriones de pez cebra se incuban inmediatamente con una sonda fluorescente (1) y luego analizados con fluorescencia o un microscopio confocal (2) ROS-sensible. En el método de "una sola célula de ROS-detección" (derecha), embriones de pez cebra se disocian en células individuales (1), se incubaron con una sonda de ROS-sensible fluorescente (2) y se analizaron por FACS para la detección y cuantificación de fluorescencia (3). Mientras que el método de "todo el montaje-ROS detección" permite la detección de estrés oxidativo en embriones vivos principalmente como un ensayo cualitativo, método de subvenciones "en base de una sola célula" cualitativos y mediciones cuantitativas de los niveles de estrés oxidativo.

Figura 2
Figura 2. Los resultados representativos de todo el método de montaje ROS-detección. A) Embriones de pez cebra en 72 HPF fueron sometidosa heridas como se describe anteriormente por Niethammer et al., 2009 39. confocal de imágenes representativas muestran las especies pro-oxidantes (ROS) de acumulación (punta de flecha) en el borde de la herida de la aleta caudal heridos. Especies oxidativas se han detectado con la sonda ROS genérico (CellROX; 2,5 M) 20 minutos después de que la herida se ha hecho. La barra de escala 20 micras. B) confocal de imágenes representativas que muestran borde de la herida de embriones de pez cebra en 72 HPF. Los embriones se trataron previamente con VAS2870 (20 mM) o DMSO durante 90 min antes se ha hecho la herida. ROS se han detectado con una sonda genérica ROS-sensible (CellROX; 2,5 M) 20 minutos después de la herida. La barra de escala 20 micras. C) imagen de cuerpo entero mostrando el estrés oxidativo inducido por rotenona en embriones de pez cebra. El estrés oxidativo se detecta fuertemente en la región caudal de los embriones como se muestra en el panel D). La rotenona es un potente inhibidor de la CTE mitocondrial afecta principalmente skelcélulas musculares etal en el pez cebra. La barra de escala, 180 m.

Figura 3
Figura 3. Los resultados representativos de las células individuales del método de detección de ROS. A) un representante FACS gráfico que muestra una muestra típica de embriones de pez cebra disociado a las células individuales. Las células vivas están cerradas en la región R1 de acuerdo con los parámetros de FSC-H y SSC-H. SSC-H: 539 (Voltaje), 1,0 (AmpGain), Modo: lineal; FSC-H:. E00 (de voltaje), 2,1 (AmpGain) B) gráfico representativo de FACS que muestra una muestra típica de embriones de pez cebra disociado a las células individuales. Antes del análisis FACS, la muestra se ha incubado con yoduro de propidio (PI; 1 g / ml) durante 5 min. Las células muertas son cerrada en la región R2 de acuerdo con fluorescencia PI (canal FL2-H). FSC-H: E00 (Voltaje), 2,1 (AmpGain), Modo: lineal, SSC-H: 539 (Voltaje), 1,0 (AmpGain), Modo: licerca. Canales Voltaje: FL-2:. 613 Log C) FACS representativos gráficas que muestran disociadas embriones de pez cebra sometidos a tratamiento pro-oxidante (H 2 O 2) y los controles respectivos. Las células endoteliales se visualizan por el canal de GFP. Parcelas FACS representan todas las células afectadas por el estrés oxidativo (ROS) en UL y UR. Células negativos se representan en los cuadrantes inferiores (LL y LR). Tg (Kdrl: GFP) en embriones de pez cebra s843 48hpf fueron incubadas con H 2 O 2 (2 mM) o H 2 O como control durante 10 min. Antes del análisis de FACS, los embriones se procesaron como se describe en el protocolo. Las células afectadas por el estrés oxidativo se detectan mediante el uso de una sonda genérica de ROS-sensible fluorescente (CellROX; 2,5 M). Una muestra no incubada con la sonda ROS-sensible se ha incluido como control negativo. La comparación de la muestra sometida a tratamiento pro-oxidante con el control respectivo, el número de células representa en cuadrantes superiores (UL + UR) es mayor. FACS acervoajustes ition fueron los siguientes: canales Voltaje: FL-1: 582 Registro; FL-4:. 410 Log D) Histograma que muestra el porcentaje de células (UL + UR) afectados por el estrés oxidativo en H 2 O 2 embriones tratados y control respectivo. Las mediciones se relacionan con muestras mostradas en C. Las células afectadas por el estrés oxidativo se detectan mediante el uso de una sonda genérica de ROS-sensible fluorescente (CellROX; 2,5 M). Los resultados son la media de n = 2 réplicas biológicas diferentes ± SD. E) Histograma que muestra el porcentaje de células endoteliales (GFP +) afectado por el estrés oxidativo (ROS +) en H 2 O 2 embriones tratados-y de control respectivo. Las mediciones se relacionan con muestras mostradas en C. Los resultados son la media de n = 2 réplicas biológicas diferentes ± SD. F) Histograma que muestra el porcentaje de células afectadas por el estrés oxidativo (ROS +) en morphants nrf2a (nrf2a MO) y los controles respectivos(Ctrl MO) a las 24 HPF. Los resultados son la media de n = 2 réplicas biológicas diferentes ± SD G) Histograma que muestra el porcentaje de células afectadas por el estrés oxidativo mitocondrial en embriones tratados (rotenona;. 10 M) y los controles respectivos (Ctrl; DMSO) a 72 HPF. Después de la disociación de los embriones en células individuales, el estrés oxidativo mitocondrial (ROS mitocondrial +) se midió con una sonda específica mitocondrial (MitoSOX; 5 M). Los resultados son la media de n = 3 réplicas biológicas diferentes ± SD.

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Discussion

Pasos críticos

El procedimiento para la detección de estrés oxidativo en embriones de pez cebra en el presente documento se describen comprende dos métodos diferentes. Todo el método de montaje de ROS-detección es principalmente un ensayo cualitativo para la detección de ROS-, mientras que el método de detección de ROS celular única permite mediciones cuantitativas más específicos (Figura 1). Ambos métodos ofrecen una forma rápida y fácil de evaluar vivo ROS-detección en embriones de pez cebra. Sin embargo, ambos se presentan algunos pasos críticos.

Pasos críticos relacionados con el Método I

El primer método para el montaje de ROS de detección de conjunto tiene la gran ventaja de detectar fácilmente el estrés oxidativo en todos los tejidos de embriones vivos (Figura 2). Sin embargo, hay tres aspectos críticos importantes que deben ser considerados y pueden influir en el resultado del ensayo: 1) la permeabilidad de la sonda a los tejidos de embriones, 2) la toxicidad de la sonda y 3) the sonda sensibilidad a baja concentración de ROS.

El primer aspecto está específicamente relacionado con la aplicación in vivo del método 42. La propiedad "célula permeabilidad" de la sonda ROS-sensible es una característica esencial para el logro de este ensayo. Idealmente, todos los productos químicos solubles en agua son óptimos para la entrega en embriones de pez cebra en vivo; Sin embargo la mayoría de los reactivos para la detección de estrés oxidativo son insolubles en agua. Por lo tanto, se suele recomendar el uso de sondas que son solubles en DMSO (dimetilsulfóxido).

Hay posibles efectos tóxicos en los embriones vinculados a la concentración de la sonda de ROS. Los efectos secundarios son normalmente representados por daños en los tejidos (es decir, necrosis) o el metabolismo acelerado de la sonda. Incubaciones largas (días) de embriones de pez cebra con la sonda de hidroetidina causa la muerte de embriones, mientras que dosis altas de 5 - (y-6)-carboxi-2 ', 7'-diclorofluoresceína resultados de diacetato de Nla acumulación en-específica de la fluorescencia en el intestino (datos no publicados). Para superar este problema es importante para controlar los embriones durante la incubación con la sonda. Análisis de varias concentraciones y tiempos de incubación con la misma sonda sería beneficioso también. El tiempo óptimo de incubación permite la entrega y la oxidación de la sonda molecular y sin dañar los tejidos superficiales. Los tiempos de incubación utilizando sondas químicas (0,5-10 micras) se pueden fijar generalmente en el intervalo de 10-30 min y no deben exceder de 1 hr. Esta condición puede ser muy difícil de establecer, especialmente cuando la cantidad de especies oxidativas está cerca de los niveles fisiológicos o cuando está restringido a tejidos embrionarios internos. De hecho, cuando un organismo completo se incuba con una sonda química ROS-detección, los tejidos más superficiales (es decir, piel, ojos, y corazón) son donde la sonda se oxida principalmente y se vuelve fluorescente. Más tarde, la sonda se entrega progresivamente a los órganos internos, el hígado o hanssels. Como consecuencia, un tiempo apropiado para la incubación de embriones de pez cebra con la sonda de detección de ROS es crítica para detectar el estrés oxidativo en todos los tejidos.

Finalmente, cuando se utiliza este método, es importante tener en cuenta la sensibilidad de la sonda con el nivel de estrés oxidativo expresado por los tejidos. La mayoría de las sondas disponibles comercialmente no se caracterizan finamente por su sensibilidad y esto significa que la sonda óptima para aplicaciones específicas debe ser determinada empíricamente. Todas las sondas ROS-sensibles generalmente detectan altos niveles de estrés oxidativo, pero la mayoría de ellos no son sensibles a los cambios mínimos de los niveles de estrés oxidativo 43.

Con el fin de limitar este inconveniente y permitir un análisis más detallado y preciso se sugiere para aplicar el segundo método basado en la detección de células individuales de estrés oxidativo.

Pasos críticos relacionados con el Método II

El sde células ingle método ROS-detección presenta algunos pasos críticos. Ellos están determinadas principalmente por 1) la eficacia de disociación de células embrionarias y por 2) el tipo de sonda de ROS-sensible asociado con el ensayo.

La disociación de los embriones en células individuales ha sido adaptado de los protocolos anteriores para el análisis de células de pez cebra mediante citometría de flujo 44 y presenta dos aspectos críticos que influyen fuertemente en el resultado de todo el procedimiento. El primer aspecto se refiere al método utilizado para disociar los embriones, mientras que la segunda está relacionada con la recuperación de células disociadas.

La disociación de los embriones en células individuales es controlada principalmente por la concentración de reactivos de disociación (es decir, colagenasa P y tripsina). Sin embargo, debe tenerse en cuenta que la eficiencia de disociación de tejidos es dependiente del número de embriones incubados y su etapa de desarrollo. Embriones de pez cebra en las etapas anteriores del desarrollo (24 HPF-48 HPF) son más sensibles a los reactivos de disociación de las larvas (96 HPF-120 HPF) a causa de los tejidos progresivos de crecimiento 45. Por lo tanto, se requieren ajustes en el procedimiento de disociación cuando se trabaja con embriones de pez cebra en diferentes etapas de desarrollo de 72 HPF. Incubación excesiva con reactivos causa la muerte celular, mientras que la concentración reducida de los reactivos se disocia sólo parcialmente los embriones. Como es importante desglosar correctamente los tejidos, es igualmente importante recopilar y preservar las células individuales. Una consideración importante es la temperatura a la que las células se recuperan después de la división del tejido. Es importante para mantener las células en hielo oa 4 ° C durante la centrifugación con el fin de limitar el estrés oxidativo secundaria a la ruptura mecánica de los tejidos o los procedimientos de manipulación.

El segundo paso crítico en relación con la sonda asociada está relacionada con el análisis en un tejido específico de interés. La forma más fácil de detectar un popul celularción en el pez cebra es ofrecido por la amplia gama de líneas transgénicas que se han establecido en las últimas décadas 46,47. Sin embargo, la fluorescencia de la línea transgénica seleccionada debe ser compatible con la sonda de detección de ROS. Es crucial para evitar interferencia entre la fluorescencia de fondo del tejido y el bajo, pero la señal específica, la fluorescencia emitida por la sonda.

Las aplicaciones de este Protocolo

Considerando ambos métodos ofrecen un ensayo fácil y económica para medir el estrés oxidativo in vivo, es posible aplicar este protocolo a varias condiciones:

Las mediciones del estrés oxidativo en diferentes genéticos (por ejemplo, los patológicos) Condiciones

Oxidante y los genes antioxidantes pueden ser fácilmente modulada en embriones de pez cebra mediante la inyección de morfolinos (pérdida de la función) o ARNm (ganancia de función). Experimentos recientemente denunciados de genes knock-down y microsegurosproyección de tope mRNA en embriones de pez cebra estableció diferentes roles para los genes antioxidantes Nrf2a y Nrf2b en la protección de las células del estrés oxidativo durante el desarrollo. Enfoques de la modulación de la expresión de genes evaluados un eje conservada evolutiva entre los mamíferos y el pez cebra para respuesta a la hipoxia y el estrés oxidativo en las células neuronales 38,48. Además, una gran oportunidad para estudiar el estrés oxidativo es ofrecido por varias líneas mutantes de pez cebra. Por ejemplo, el pez cebra ducttrip (DTP) mutante representa un ejemplo interesante para la caracterización de estrés oxidativo en relación con una condición patológica. El mutante DTP lleva a una deficiencia de la hidrolasa S-adenosil (AHCY) gen y su caracterización reveló que la pérdida de actividad AHCY causa la degeneración del hígado al influir en los niveles de ROS 49. De manera equivalente, el fh318 nrf2 pez cebra mutante, llevando un funcio pérdida den mutación del gen de factor de transcripción Nrf2, ha sido considerado con considerable interés para investigar el papel de protección de este gen antioxidante en los vertebrados inferiores 50.

Las mediciones de Redox Estado disparadas por los Compuestos Farmacéuticos

El tratamiento de los embriones de pez cebra con drogas pequeños puede inhibir o activar el estrés oxidativo. Recientemente demostramos que el tratamiento con estatinas de embriones de pez cebra inducida por el estrés oxidativo, que puede ser recuperada por CoQ10 tratamiento 51. Alternativamente, el análisis del estrés oxidativo en el modelo animal de pez cebra para miopatías relacionadas RYR1-humanos pone de relieve el papel de la NAC fármaco antioxidante (N-acetil cisteína) como un enfoque terapéutico potencial para la enfermedad muscular 52.

A gran escala de detección de pequeñas moléculas y medicamentos para caracterizar sus propiedades oxidativas

El pez cebra es un mod de animales bien establecidaEL para el cribado de química grande. Un cribado químico reciente de moléculas pequeñas realizadas en el pez cebra antioxidantes identificados como moduladores de la supervivencia de neuronas dopaminérgicas, que se ve muy afectado en las enfermedades neurodegenerativas de mamífero tales como la enfermedad de Parkinson 53. Este método se puede utilizar para la detección de nuevas moléculas pro-o anti-oxidantes en vivo.

Importancia y limitaciones

La prominencia tanto de "todo el montaje" y métodos de ROS de detección de "célula única" se basa en la capacidad de realizar mediciones in vivo de estrés oxidativo mediante el uso de técnicas de laboratorio simples y equipo básico. La aplicación del pez cebra como modelo animal en combinación con sondas de detección de ROS permite no sólo la mera revelación de estrés oxidativo, sino también su detección en el contexto de un organismo vivo y la cuantificación en el nivel de los tejidos individuales. Es importante destacar que, estos ensayos pueden serrealizado con las herramientas disponibles en el mercado y no requieren conocimientos específicos a realizar. Además, ambos métodos no son mucho tiempo procedimientos y se pueden aplicar con tiempo apropiado para grandes conjuntos de muestras. En conjunto estas ventajas prácticas hacen que estos métodos de particular importancia para mejorar el análisis del estrés oxidativo in vivo.

Sin embargo, estos ensayos también muestran algunas limitaciones. En general, la mayoría de las sondas de ROS-sensible ahora disponibles en el mercado no son valorados por fino análisis cualitativo y cuantitativo de los niveles de estrés oxidativo en las células vivas. El hidroetidina de uso común y sondas MitoSOX fue diseñada para la detección de la superóxido (O 2 -.), Pero recientemente su preocupación acerca de su especificidad se han planteado, especialmente al usar ensayos basados ​​en fluorescencia 54. Análogamente algunos informes avanzados dudas sobre el diacetato diclorofluoresceína (DCFH-DA) para H exclusiva 2 2 sintiendo 55,56. Además, estas sondas fluorescentes redox activos se caracterizan por la activación no específica parcial (es decir, el tejido auto-fluorescencia) y no son reversibles después de la oxidación. Una vez que la sonda fluorescente se oxida por ROS no pueda entrar de nuevo a su no fluorescente estado reducido. En consecuencia, la detección de las fluctuaciones de ROS con resolución temporal está limitada por la aplicación de tales sondas químicas 43.

Una limitación considerable de este campo se representa por la falta de sondas para la detección exclusiva RNS. Recientemente, metodologías proteómicas basadas demostraron que RNS inducen modificaciones de la proteína que se consideran como biomarcadores de estrés-nitroso activo y se puede evaluar a través de ensayos de inmunotransferencia utilizando anticuerpos específicos para la oxidación de proteínas / nitración (por ejemplo, anti-SNO-cisteína, anti-3- Nitrotirosina) 22,23. Sin embargo, todos estos ensayos son sólo mediciones indirectas de stre oxidativoSS desencadenada por RNS y en la mayoría de los casos se requiere extractos celulares, lo que significa que no son aplicables a las células vivas o embriones de pez cebra que viven.

Una alternativa válida a las sondas convencionales está representado por las proteínas fluorescentes sensibles redox genéticamente codificados. Los principales componentes de este grupo son: roGFP, derivados de las proteínas fluorescentes verdes, rxYFP y cpYFP, ​​ambos derivados de la proteína fluorescente de color amarillo y la sonda hiper, un H 2 O específica sonda fluorescente 2-sensible 57. Todas estas sondas redox de ingeniería creados por las proteínas fluorescentes permiten cuantificaciones ratiometric basadas en la fluorescencia y activar la resolución temporal más alta (desde segundos a minutos) que las sondas químicas 58. Aplicación in vivo de estos biosensores también es posible como se demuestra por la línea transgénica que expresa el pez cebra Hyper para la detección en tiempo real de H 2 O 2 endógena niveles de 39,59. Yomplementa el pez cebra con sensores codificados genéticamente ofrece un sistema óptimo para investigar el estrés oxidativo, pero requiere de la creación de una línea de animales transgénicos y las herramientas de imágenes apropiadas. El procedimiento para la detección de estrés oxidativo en el pez cebra que se presenta aquí es menos preciso que los métodos genéticos, pero es rápida y proporciona un ensayo para la detección primaria in vivo de los altos niveles de especies pro-oxidantes. Medición precisa de oxígeno reactivo individual y / o especies de nitrógeno es actualmente un límite de este campo de investigación. En el futuro, próximos a nanoescala redox sensores podrían ayudar a resolver este problema. La aplicación exitosa de redox sensores de nanopartículas y nanotubos de base ha sido probado en varios estudios in vitro, pero no está disponible como ensayos in vivo hasta ahora 60.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hydrogen peroxide solution SIGMA 516813 DO NOT STORE DILUITIONS
Hank's Balanced Salt Solution 1x GIBCO 14025
Methyl cellulose SIGMA M0387
Instant Ocean Aquarium Sea Salt Mixture INSTANT OCEAN SS15-10
Tricaine SIGMA A5040
Cgeneric ROS-sensitive probe: CellROX Deep Red Reagent INVITROGEN C10422
Mitochondria specific ROS-sensitive probe: MitoSOX  INVITROGEN M36008 dissolve one vial with 13 μl of DMSO
Hydroethidine INVITROGEN D23107
Rotenone SIGMA R8875 Prepare 5 mM stock solution in DMSO. 
Dimethyl sulfoxide SIGMA D2650
VAS2870; 3-Benzyl-7-(2-benzoxazolyl)thio-1,2,3-triazolo(4,5-d)pyrimidine EnzoLifeScience BML-EI395 dissolve the powder in DMSO; diluite in fish water
Propidium Iodide  Molecular probes
(Life Technologies)		 P3566
7-aminoactinomycin D (7-AAD)  Molecular probes
(Life Technologies)		 A1310
Nrf2a Morpholino GeneTools 5'-CATTTCAATCTCCAT
CATGTCTCAG-3'		 Ref: Timme-LaLaragy et al.; 2012 (PMID: 22174413); Kobayashi et al.; 2002 (PMID:12167159)
Collagenase P ROCHE 11213857001 Dissolve the powder at 100 mg/ml in sterile HBSS. Store aliquots at -20 °C
Phosphate-Buffered Saline (PBS) GIBCO 10010-056
Fetal Bovine Serum  GIBCO 10082-147
Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets ROCHE Dissolve one tablet in 1 ml of water
0.5% Trypsin-EDTA (10x), no phenol red GIBCO 15400-054 Prepare 1x working solution before usage
Compound microscope  ZEISS
Stereo microscope with fluorescent illumination Nikon AZ100
Camera ZEISS AxioCamMRm
software for fluorescence image acquisition ZEISS ZEN 2011
Fluorescence-activated cell sorter BD FACSCalibur
Centrifuge  Eppendorf 5417R
FACS tubes  BD 342065
Multiwell Plate  BD Falcon 353047
Sterilized, non treated Petri dishes 90 mm VWR 391-1915
Confocal microscope Leica Leica SP5

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Análisis de estrés oxidativo en embriones de pez cebra
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Mugoni, V., Camporeale, A., Santoro, … More

Mugoni, V., Camporeale, A., Santoro, M. M. Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (89), e51328, doi:10.3791/51328 (2014).

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