Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Analys av oxidativ stress i Zebrafish embryon

Published: July 7, 2014 doi: 10.3791/51328

Abstract

Höga nivåer av reaktiva syreradikaler (ROS) kan orsaka en förändring av cellulär redoxtillstånd mot oxidativ stress skick. Denna situation orsakar oxidation av molekyler (lipid, DNA, protein) och leder till celldöd. Oxidativ stress påverkar också utvecklingen av ett flertal sjukdomstillstånd som diabetes, retinopatier, neurodegeneration, och cancer. Således är det viktigt att definiera verktyg för att undersöka oxidativa stressbetingelser inte endast på nivån för enskilda celler, utan även i samband med hela organismer. Här anser vi den zebrafisk embryot som ett användbart in vivo-system för att utföra sådana undersökningar och presentera ett protokoll för att mäta in vivo oxidativ stress. Med utnyttjande av fluorescerande ROS sonder och zebrafisk transgena fluorescerande linjer, utvecklar vi två olika metoder för att mäta oxidativ stress in vivo: i) en "hel embryo ROS-detekteringsmetod" för kvalitativ mätning av oxidativ stress och ii) en "encelliga ROS detekteringsmetod "för kvantitativa mätningar av oxidativ stress. Häri visar vi effekten av dessa förfaranden genom att öka oxidativ stress i vävnader med oxiderande agenter och fysiologiska eller genetiska metoder. Detta protokoll är mottaglig för framåt genetiska skärmar och det kommer att hjälpa till orsakssamband av ROS i djurmodeller av oxidativa stressrelaterade sjukdomar såsom neurologiska sjukdomar och cancer.

Introduction

Oxidativ stress är specifikt definierad som ett tillstånd som är resultatet av en obalanserad cellulära redox staten. De komplexa redoxreaktioner som rutinmässigt förekommer inuti cellerna bestämma den cellulära redox-tillstånd. Redoxreaktioner består av alla kemiska reaktioner, som består i överföring av elektroner mellan atomer av biologiska molekyler som producerar reduktion och oxidation av molekyler (dvs. redoxreaktioner). Dessa reaktioner katalyseras av elektroniskt aktiverade ämnen (dvs. prooxidativa arter), som kännetecknas av en extrem strukturell instabilitet och spontan aktivering av obalanserade elektroner som utbyter med grann biomolekyler. Dessa oregelbundna reaktioner resulterar i DNA-skada, protein karboxylering och lipidoxidation, och så småningom leda till celldöd 1. Ökade nivåer av oxidativ stress har förknippats med åldrande och progressionen av olika patologiska tillstånd 2. Oxidativ stress harrapporterats vara ansvarig för vaskulära förändringar i diabetes och hjärt-och kärlsjukdomar 3,4. Den spelar också en avgörande roll i neuronal degenerering vid Alzheimers sjukdom och Parkinsons sjukdom 5. Dessutom har oxidativ stress visats som en kritisk faktor som styr cancerprogression och metastaserande händelser 6,7. Dessutom kan inflammation och immunsvar framkalla och ytterligare stöd oxidativ stress 8.

I levande celler, är pro-oxidativa arter härstammar från syre (ROS, reaktiva syreradikaler) eller kväve (RNS, reaktiva kvävearter). ROS inkluderar hydroxylradikalen, superoxidanjonen (OH.) (O 2 -) och väteperoxid (H 2 O 2). Den primära RNS är kväveoxid (NO.). En serie av sekundära reaktiva species kan genereras genom spontana interaktioner mellan ROS och RNS eller fria metaller joner 9. Exempelvis reagerar superoxidanjonen med dikväveoxid för bildning peroxynitrate (ONOO -), medan H 2 O 2 att reagera med Fe 2 + genererar hydroxylradikaler. ROS och RNS, på grund av deras förmåga att reagera med olika biomolekyler, betraktas som ett farligt hot för underhåll av den fysiologiska redox staten 10. För att bibehålla redoxtillståndet celler är utrustade med en serie av avgifta antioxidant molekyler och enzymer. Den superoxiddismutas (SOD), katalas, glutation-peroxidas och Peroxiredoxins utgöra väsentligen antioxidant enzymatisk-arsenal som ger cellulär skydd mot pro-oxidativa species inklusive H 2 O 2, OH och OONO -. 11. Även antioxidant molekyler som vitamin C och E, polyfenoler och CoenzymeQ10 (Q10) är av avgörande betydelse för att släcka ROS och deras farliga dederivat 12,13. Men en överdriven produktion av ROS och RNS, eller en dysfunktion i antioxidant-system, skiftar den cellulära redox-tillstånd mot oxidativ stress 14.

Vid sidan av sin negativa klang, kan ROS spela olika fysiologiska roller i celler av olika ursprung. Celler producerar normalt ROS som signalmolekyler för att medla normala biologiska händelser såsom värdförsvar och sårläkning 15-17. Reaktiva arter normalt produceras i celler av intracellulära enzymer såsom NOX (NADPH-oxidas) och XO (Xantine Oxidas) som svar på signalerings faktorer, tillväxtfaktorer och intracellulära fluktuationerna av kalciumnivåer 18,19. Det har rapporterats att ROS differentiellt kan modulera aktiviteten av viktiga nukleära faktorer såsom p53 eller cellulära komponenter, såsom ATM-kinas, en huvudregulator av svaret på DNA-skada 20. Analogt ROS starkt påverka cellulär signalering genom att förmedla ee oxidation och inaktivering av protein tyrosinfosfataser (PTP), som är etablerade som kritiska regulatorer av signaltransduktion 21. Dessutom, proteomik baserade metoder visar att RNS är också ansvariga för specifika protein modifieringar och ändringar av molekylär signalering. RNS reagerar med de cysteintiolgrupper modifierar dem till S-nitrothiols (SNO) och utlöser molekylära vägar samtidigt med patologiska tillstånd, såsom inflammatoriska och autoimmuna sjukdomar 22,23.

Eftersom cellkulturexperiment endast delvis återge de många faktorer som verkar in vivo, är det av stort intresse att utföra redox studier i djurmodeller 24,25. För att uppnå detta har zebrafisk ansetts vara en lämplig ryggradsdjur modell för att studera oxidativ stress dynamik 26. Den zebrafisk är ett nytt modellsystem som ger flera fördelar för att studera cellulära och genetiska händelser under ryggradsdjur deveckling och sjukdom. Kan genereras och tillgängliga Stora kluster av embryon i veckan för experimentella behov. Dessutom den extra optiska klarheten av zebrafiskembryon, samt sin ringa storlek, möjliggör enskild cell imaging och dynamisk spårning i ett helt organismer 27. Under det senaste decenniet, har ett betydande antal zebrafisk mutanter tagits fram för att modellera mänskliga patologiska tillstånd som cancer och genetiska sjukdomar 28-31. Viktigast har en mångfald av transgena linjer tagits fram för att möjliggöra omfattande möjligheter för genetiska och biologiska manipulationer 32. Till exempel är transgena vävnadsspecifika zebrafisklinjer regelbundet utnyttjas för in vivo-studier. Dessa linjer uttrycka ett fluorescerande protein under kontroll av en utvald promotor, och ger förmåga att identifiera enstaka celler in vivo, såväl som den anatomiska strukturen de utgör.

Flera toxikologiska studier har redan använt than zebrafisk att utvärdera effekten in vivo av kemikalier på redox homeostas, vilket tyder på lämpligheten av detta ryggradsdjur som en djurmodell för området läkemedelsutveckling och oxidativ stress 33-35. Även om vissa fluorescerande prober har testats för att övervaka oxidativ stress i zebrafisk larver 36,37, det finns inga etablerade analyser för att upptäcka och mäta nivåerna av oxidativ stress i zebrafisk vävnader och levande celler. Här beskriver vi ett förfarande för in vivo kvantifiering av oxidativ stress i levande celler i zebrafisk embryon. Bildframställning, FACS sortering, fluorescerande prober och pro-oxidativa förhållanden är alla kombineras för att skapa en enkel analys för detektion och kvantifiering av oxidativa arter i zebrafisk embryon och vävnader.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Beredning av instrument och arbetslösningar

  1. Förbered fisk vattenlösning med. Gör en stamlösning genom att lösa 2 g havssalt Instant Ocean "i 50 ml destillerat vatten. Lägg till 1,5 ml lager fisk vatten till 1 liter destillerat vatten för att förbereda redo att använda fisk vatten (60 mikrogram / ml havssalt slutlig koncentration). Autoklav den färdig att använda fisk vatten före användning. Denna lösning används som zebrafisk embryo medium.
  2. Förbered metylcellulosa för embryo montering. Lös upp 1,5 g metylcellulosa i 50 ml sterilt fisk vatten. Underlätta upplösningen med hjälp av en magnet på en uppståndelse tallrik. Den fullständiga upplösningen av pulvret kan kräva flera timmar. Kontrollera lösningen för klarhet och delprov i små tuber. Lagra vid -20 ° C i flera månader och tina upp alikvoter vid användning. Centrifugera metylcellulosa vid 950 xg under 5 minuter innan den används. Undvik frys-tö-cykler av alikvoter.
  3. Bered 50 ml av tricaine / etyl-3-aminobensoat metansulfonat salt (stamlösning) genom att lösa 200 mg tricaine i 100 ml vatten och justera pH till 7,0 med användning av Tris-HCl, 1 M (pH 9). Förvara detta lager vid 4 ° C i högst 30 dagar. VARNING: tricaine är giftig. Användning i enlighet med lämpliga riktlinjer hantering.
  4. Induktion oxidativ stress i zebrafisk embryon
    1. Förbered ett oxidationsmedel lösning för generisk oxidativ stress induktion: Gör 50 ml oxidationsmedel lösning genom att tillsätta H 2 O 2 stamlösning (väteperoxid, 100 mM) till fisk vatten. Använd H 2 O 2 i en slutlig koncentration mellan 2 mM och 100 ^. Bered denna lösning strax före användning. Oxidationsmedelslösningen kan appliceras på både hela berget ROS-detektion och encelliga metoder ROS-upptäckt. Förvara inte denna lösning. VARNING: H 2 O 2 är farligt och farligt vid inandning och förtäring. Kontakt med brännbart material kan orsaka brand. Handtag under en huv och bära lämpliga personal skyddsutrustning.
    2. Bered en oxidant lösning för mitokondrier härledda oxidativ stress induktion: Gör en oxidant stamlösning (5 mM) genom upplösning av 3,9 mg av rotenon i 2 ml dimetylsulfoxid (DMSO). Förvara lösningen vid rumstemperatur i mörker.
      1. Lös rotenon stamlösning till 10 ml av fisk vatten för att göra en färdig att använda-lösning. Använd rotenon i en koncentration mellan 5-50 mikroM. Använd inte rotenon i koncentrationer högre än 100 iM. Vid lämpliga koncentrationer, kan detta oxidationsmedel lösning appliceras på både hela berget ROS-detektion och encelliga metoder ROS-upptäckt. VARNING: Rotenon är giftigt och farligt. Handtag enligt lämpliga skyddsangivelser.
    3. Framkalla oxidativ stress genom gen knock-down: Knock-down nrf2a genuttryck i zebrafisk embryon genom morfolino mikroinjektion som tidigare rapporterats av Timme-Laragy A. et al, 2012 38..
    4. Inducera oxidtiva stress efter vävnadsskada: generera ett sår marginal på stjärtfenan av zebrafisk embryon vid 72 HPF som tidigare beskrivits av Niethammer et al, 2009 39..
  5. Förbered 5 ml ROS-upptäckt lösning för enskild cell ROS-detekteringsmetod:
    1. Lösning för allmän ROS detektion: Lös upp den generiska ROS känsliga molekylär sond i HBSS (Hanks balanserade saltlösning) för att framställa en arbetslösning (koncentrationsintervall: 2,5-10 pM). Denna lösning måste beredas strax före användning.
    2. Lösning för specifik detektion ROS inducerad av mitokondrier: Strax före användningen löses en mitokondriell ROS-känsliga sond med DMSO gör en 5 mM stamlösning. Lös stamlösning i HBSS, för att förbereda en arbetslösning (koncentrationsintervall: 2,5-10 pM).
      OBS: Undvik ljus och syre exponering ROS-detektionsarbetslösningar och deras motsvarande lagerlösningar. Skydda röret från ljus genom att användaen aluminiumfolie. Förvara eller återanvändning sonder lösta i HBSS. Förvara stamlösningar vid -20 ° C under en månad.
      VARNING: Hantera molekylära sonder och DMSO under en huv i enlighet med lämpliga riktlinjer.
  6. Bered 5 ml av ROS-detekteringslösning för hela montera ROS-detekteringsmetod: Lös den generiska ROS känsliga sondstamlösning (stabiliserad i DMSO) i HBSS för att förbereda en arbetslösning (koncentrationsintervall: från 2,5 till 5 ^ M). Undvik ljus och syrgasexponeringen. Skydda slangen från ljus. Bered denna lösning före användning. Förvara eller återanvända denna lösning. VARNING: Hantera molekylära sonder under en huv i enlighet med lämpliga riktlinjer.
  7. Gör 25 ml stopplösning genom att tillsätta 10 ml fetalt bovint serum till 15 ml PBS 1x. Förvara lösningen steril. Lagra denna lösning vid 4 ° C. Denna lösning krävs endast för enskild cell - ROS detekteringsmetod.
  8. Ställ in zebrafisk luft inkubator vid 28 &# 176; C.
  9. Ställ centrifugen vid 4 ° C för enskild cell ROS-detekteringsmetod.

2. Parning av sex Fiskar och Val av Zebrafish embryon

  1. Set-up vuxna zebrafisk par korsar enligt standardprotokoll 40. Välj lämplig transgen linje i enlighet med särskilda experimentella behov.
  2. Samla ägg och placera dem i en 90-mm maträtt med fisk vatten / embryo medium. Håll ägg vid 28 ° C tills embryon utvecklas och växa till den önskade utvecklingsstadiet (t.ex. 48 HPF, 72 HPF; HPF: h efter befruktning).
  3. Screening med avseende på utveckling av embryon. Uteslut alla obefruktade ägg eller underutvecklade embryon.
  4. Bedöva embryon genom att tillsätta 1 ml tricaine (stamlösning) i 50 ml fisk vatten.
  5. Välj Tg fluorescerande embryon under ett stereomikroskop.

3. Behandling av embryon med Oxidant Agent

  1. Använd minst 30 embryon mellan 48 hpf och 72 HPF per olika tillstånd. Tvätta embryon två gånger med färsk fisk vatten för att avlägsna tricaine.
  2. Dela fluorescerande embryon i tre rätter. Placera inte mer än 30 embryon / fat.
  3. Avlägsna tvättlösningen och tillsätt 10 ml av oxidationsmedelslösningen eller 10 ml av fisk vatten som kontrollösning.
  4. Inkubera embryon för 10 min till 1 timme vid 28 ° C. Inkubationstiden beror av den nivå av oxidativ stress att induceras i specifika vävnader. Korta perioder är det bästa som celler som påverkas av oxidativ stress genomgår successivt celldöd.
  5. Överför embryon till en ny maträtt som innehåller HBSS och tvätta embryon genom att snurra. Pre-varm HBSS vid 28 ° C.

4. Hela Mount ROS Detection Metod

  1. Samla embryon efter oxidant behandling och sätta högst 10 embryon i ett litet rör. Skölj med HBSS så mycket som möjligt. Skydda röret från ljus med hjälp av aluminiumfolie.
  2. Tillsätt 1 ml ROS-upptäckt lösning förvarje rör.
  3. Inkubera embryon i mörker under 15 min vid 28 ° C för att undvika exponering för ljus.
  4. Under inkubationstiden förbereda en glasskiva för hela embryo-analys. Sätt 300 pl metylcellulosa på en "depression" glasskiva och sprida det på glasytan med en pipett. Undvik bubblor samtidigt släppa metylcellulosa.
  5. Vid slutet av inkubationstiden, omedelbart ta bort ROS-upptäckt lösning och tvätta två gånger med 2 ml HBSS. Tvätta embryon genom att vända röret flera gånger. Inte pipett eller virvel.
  6. Aspirera embryon upp i ett glas Pasteur pipett. Positions embryon nära öppningen av pipetten och försiktigt mata ut dem i metylcellulosa. Orientera embryon lämpligt med en fin nylonlina.
  7. Jämför fluorescensen av kontrollembryon med behandlade embryon. Alternativt fixa parametrar av fluorescens stereomikroskop eller konfokalmikroskop så att alla embryon avbildas med sammaimaging inställningar.

5. Single Cell ROS-detekteringsmetod

  1. Starta från steg: 3.5. Se till att ha minst 35 embryon för varje tillstånd.
  2. Överför embryon i en ny skål. Avlägsna fisk vatten så mycket som möjligt. Tillsätt 10 ml iskall PBS 1x och 400 | il av proteasinhibitorer Cocktail. Dechorionate manuellt embryon med pincett och ta bort äggulan säcken med en fin nål. OBS: Ta bort gulesäck ger rena prover för följande FACS-analys. Detta steg kan undvikas enligt FACS-instrument.
  3. Överför de-yolked embryon till en 24-väl multibrunnsplatta (15 embryon / brunn) och avlägsna all fisk vatten.
  4. Lägg till 300 l av HBSS, 30 pl kollagenas P, 50 ^ trypsin-EDTA i varje brunn.
  5. Homogenisera embryon genom att försiktigt pipettera upp och ned med en snäv pipettspets (1000 pl).
  6. Inkubera vid 28 ° C under 20 min och homogenisera prover genom att pipettera varje 5 min.
  7. Kontrollera vävnad DISRuption genom att observera en alikvot av homogenatet vid sammansatt mikroskop. Underlätta enda cellsuspension genom att pipettera. Inte inkubera embryon i mer än 30 minuter.
  8. Stoppa reaktionen genom att tillsätta 200 pl av stopplösning. Blanda genom att pipettera försiktigt.
  9. Överför cellsuspensionen i en pre-kylda rör med tät botten. Håll röret på is och undvika ljusexponering.
  10. Centrifugera under 5 minuter vid 250 xg vid 4 ° C.
  11. Ta bort den övre fasen och slamma cellerna med iskall HBSS genom att försiktigt pipettera.
  12. Räkna celler och se till att du har samma antal celler i alla dina prover. Använd inte mindre än 2 x 10 6 celler.
  13. Centrifugera cellerna under fem minuter vid 250 x g vid 4 ° C.
  14. Avlägsna supernatanten och suspendera pelleten med 1 ml is kylda HBSS innehåller ROS känsliga sond.
  15. Inkubera röret vid rumstemperatur under 3 minuter i mörker. Variera inkubationstid beroende på graden av oxidativ stress och till than känsligheten hos sonden.
  16. Överför celler till ett FACS-rör. Håll rören på is och undvika ljusexponering före FACS-analys.
  17. Sortera celler med en fluorescensaktiverad cellsorterare (FACS). Set våglängder i enlighet med Tg vävnad fluorescens (t.ex. GFP) och excitation / emissionsspektra av den molekylära proben används för ROS upptäckt (t.ex. specifika mitokondriella ROS-känsliga sonder, generiska ROS-känsliga sonder).
  18. För varje tillstånd, mäta alla prover inom samma försökssession med stöd av samma FACS inställningar. Beräkna den procentuella andelen fluorescerande celler som medelvärdet av olika biologiska replikat. Analysera minst två replikat för varje tillstånd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Genom att tillämpa den metod som beskrivs här, kan vi enkelt mäta och påvisa oxidativ stress (och ROS nivåer) i zebrafisk embryonala vävnader. Efter att ha korsat vuxna zebrafisk, är äggen uppsamlades och tilläts utvecklas vid 28 ° C till 72 h efter befruktning (HPF). För att framkalla oxidativ stress, föreslår vi två olika metoder: 1) i behandling av embryon med starka prooxidativa reagenser eller 2) att främja ROS bildning efter vävnadsskada.

I den första metoden, använde vi två olika reagens i enlighet med de specifika behov: väteperoxid (H 2 O 2), som den generiska cellulära ROS bildande medel, och rotenon, som den specifika mitokondriella ROS drivrutin. Rotenon är en hämmare av komplex I i ETC, som avregleringar är orsakande av oxidativ stress 41.

I den andra metoden, framkallade vi ansamling av ROS genom att skapa ett sår vid stjärtfenan på en zebrafisk embryo39. Alternativt kan oxidativa stressförhållanden främjas i zebrafisk vävnader genom att knacka ner med morpholino injektion Nrf2 antioxidant svaret väg som är den främsta cellulära försvaret mot de cytotoxiska effekterna av oxidativ stress 38.

När oxidativ stress induceras i zebrafisk embryon, kan ansamling av reaktiva syreradikaler (ROS) mätas med hjälp av generiska eller mitokondriella specifika ROS-känsliga sonder, som blir fluorescerande vid aktivering (t.ex. oxidering).

Behandlade embryon kan analyseras med hjälp av hela berget ROS-detekteringsmetod eller genom att tillämpa den enda cell-ROS detekteringsmetod som sammanfattas i figur 1. Valet mellan metoderna bygger på behovet av att genomföra kvalitativa eller kvantitativa mått på oxidativ stress. Representativa resultat av båda metoderna visas i figur 2 Figur 3.

Hela Mount ROS-detekteringsmetod

Fig. 2 visar tillämpningen av hela montera ROS-detekteringsmetod för in vivo-avbildning av oxidativ stress. I synnerhet har denna metod tillämpats för att följa både "stark" oxidativ stress genererad av exogena prooxidativa behandlingar samt "lågt" oxidativ stress genererad av mera fysiologiska tillstånd såsom sår skador eller gendeletion.

Fysiologiska nivåer av oxidativa arter induceras genom att generera en mikroskada eller ett stort sår på stjärtfenan på en levande zebrafisk embryo vid 72 HPF. Det har visats att efter skada, H 2 O 2 ansamlas vid såret marginal 20 min efter såret 39. För att visualisera den ansamling av oxidativ stress vid såret marginalen var embryon inkuberas med en generiskROS-känsliga sond och röntgas 20 min efter att såra 39. Genom att jämföra intakta stjärtfenor med skadade svansar, är det möjligt att skilja en ansamling av det fluorescerande sond på såret marginalen (Figur 2A). Ospecifik svag fluorescenssignal upptäcks runt stjärtfenan vävnad i båda villkoren.

För att validera den specifika ackumuleringen av ROS känsliga sonden vid såret marginal, H 2 O 2 nivåer vid såret har sänkts med en farmakologisk strategi. Eftersom det har visats att såret marginalen H2O 2 ackumulation är extremt känslig för DUOX-hämmaren VAS2870 39, embryon förbehandlade med denna inhibitor innan såra. Jämförelse av fluorescensen hos ROS känslig prob, från VAS förbehandlade embryon och respektive kontroller indikerar att signalen är beroende av ROS ackumulering (dvs. H 2 O 2) (Figur 2B).

Dessutom genererade vi höga nivåer av oxidativa species i zebrafisk vävnader genom behandling av zebrafiskembryon med rotenon. Rotenon-behandlade embryon och kontroller inkuberades med en generisk ROS-känsliga sond för att specifikt upptäcka ROS arter. Efteråt sonden tvättas ut och embryona avbildades under ett fluorescensstereomikroskop. Den oxidativa stressen detekterades i hela kroppen av de embryon (figur 2C). Hög förstoring bilder visar anatomiska regioner där proben framgångsrikt metaboliseras (figur 2D). Ljusa fält bilder (övre paneler) skilja anatomiska strukturer, medan fluorescens bilder (lägre paneler) visar ROS-positiva celler. Såsom visas av de fluorescerande bilderna resultatet är huvudsakligen en kvalitativ rapport av oxidativ stress detektering, vilket uppnås genom att jämföra kontrollen med behandlade embryon.

Single Cell-ROS Detection Metod

Figur 3 redovisar representativa FACS tomter och kvantifiering av oxidativ stress genom att tillämpa den enda cell ROS detekteringsmetod. Metoden har anpassats för att mäta oxidativ stress i zebrafisk celler som utsattes för pro-oxidant förhållanden som redovisas i protokollet och som beskrivs i figur legender. Som beskrivits har oxidativ stress mätts genom inkubation zebrafisk vävnader dissocierade i enskilda celler med en ROS-känslig molekylär sond. Eftersom dissociation förfarandet och FACS själv kan orsaka cellskador, kräver analys av prover som bara "levande celler" anses för oxidativ stress kvantifiering. Således är dissocierade celler analyseras genom att välja den fraktion av celler som visar "live-cell" fysiska parametrar (Figur 3A) och genom att utesluta döda celler (Figur 3B). Sålunda är de prover kvantifieras föroxidativ stress enligt den fluorescens av ROS känsliga sond och för att visa en endogen fluorescens såsom positivitet för GFP (figur 3C). Ett negativt kontrollprov för ROS känsliga sond bör ingå för att utvärdera den oxidativa stress som hantering och tekniska förfaranden (figur 3C, panel: Control -). Relativ FACS plot kvantifiering visats i histogram som visar mätningar av olika biologiska replikat (Figur 3D-E).

Förutom oxidativ stress nivå kvantifiering på väteperoxid behandlingar, har denna metod använts för att kvantifiera oxidativa stress inom fysiologiska förhållanden sådana oss i nrf2a morphants och respektive kontroller (Figur 3F).

Dessutom, genom att kombinera den encelliga ROS detekteringsmetod med specifika ROS-känsliga sonder sådana oss mitokondrie ROS känsliga sonder, är det också möjligt att mäta oxidativ stress i samband med specifika mitokondrier riktade pro-oxidant behandlingar (figur 3G).

Figur 1

Figur 1. Schematisk figur av metoden för mätning av ROS nivåer i zebrafiskembryon. Zebrafish vuxna är korsade i lämpliga avelstankar. Befruktade ägg samlas sedan in rätter och förvaras vid 28 ° C för att låta embryot utvecklas till fullo. Induktion av oxidativ stress kan uppnås på olika sätt, antingen genom läkemedelsbehandlingar eller genom genetiska eller fysiska kränkningar. Alternativt, om en genetisk mutant analyseras, är det möjligt att hoppa över denna inkubation och gå framåt. Vid denna punkt, är det möjligt att gå vidare enligt två olika metoder. Enligt "hel mount ROS-detektion "-metoden (till vänster), är zebrafisk embryon omedelbart inkuberas med en fluorescerande ROS känslig prob (1) och sedan analyseras med fluorescens eller konfokalmikroskop (2). I "enkelcells ROS-detektering"-metoden (till höger), är zebrafiskembryon dissocieras till enskilda celler (1), inkuberades med en fluorescerande ROS känsliga sonden (2) och analyserades genom FACS för fluorescensdetektering och kvantifiering (3). Medan den "hela berget-ROS upptäckt" metoden tillåter oxidativ stress upptäckt i levande embryon främst som en kvalitativ analys, "encelliga baserade" metodbidrag både kvalitativa och kvantitativa mätningar av oxidativ stress.

Figur 2
Figur 2. Representativa resultat av hela berget ROS-detekteringsmetod. A) Zebrafish embryon vid 72 HPF utsattesatt sårskada såsom beskrivits tidigare av Niethammer et al., 2009 39. Representativa konfokala bilder visar pro-oxidativa species (ROS) ackumulering (pilspets) på såret marginal av sårade stjärtfenan. Oxidativa arter har upptäckts med den generiska ROS sonden (CellROX, 2,5 M) 20 min efter att såret har gjorts. Skala bar 20 um. B) Representant konfokala bilder visar sår marginal av zebrafisk embryon vid 72 HPF. Embryon förbehandlades med VAS2870 (20 pM) eller DMSO i 90 min innan såret har gjorts. ROS har upptäckts med en generisk ROS-känsliga sond (CellROX, 2,5 M) 20 min efter sår. Skala bar 20 um. C) Hela kroppsuppfattning visar rotenon-inducerad oxidativ stress i zebrafisk embryon. Oxidativ stress är starkt detekteras i den kaudala området för de embryon, som visas i panel D). Rotenon är en potent hämmare av mitokondrie ETC drabbar främst skeletal muskelceller i zebrafisk. Skala bar, 180 nm.

Figur 3
Figur 3. Representativa resultat av de enskilda celler ROS-detekteringsmetod. A) representant FACS diagram som visar ett typiskt urval av zebrafisk embryon dissocierade till enskilda celler. Levande celler är gated i R1-regionen enligt FSC-H och SSC-H-parametrar. SSC-H: 539 (spänning), 1,0 (AmpGain), Mode: linjär; FSC-H:. E00 (spänning), 2,1 (AmpGain) B) Representativa FACS diagram som visar ett typiskt prov av zebrafiskembryon dissocieras till enskilda celler. Före FACS-analys, har provet inkuberats med propidiumjodid (PI; 1 | ig / ml) under 5 min. Döda celler gated på R2-regionen enligt med PI fluorescens (FL2-H-kanal). FSC-H: E00 (spänning), 2,1 (AmpGain), Mode: linjär, SSC-H: 539 (spänning), 1,0 (AmpGain), Mode: linära. Spännings kanaler: FL-2:. 613 Log C) Representativa FACS tomter visar dissocierade zebrafisk embryon som utsatts för pro-oxidant behandling (H 2 O 2) och respektive kontroller. Endotelceller visualiseras genom GFP-kanal. FACS tomter representerar alla celler som påverkas av oxidativ stress (ROS) för UL och UR. Negativa celler ritas på nedre kvadranter (LL och LR). Tg (Kdrl: GFP) s843 zebrafiskembryon vid 48hpf inkuberades med H 2 O 2 (2 mM) eller H 2 O som kontroll för 10 min. Innan FACS-analys, är embryon behandlas som beskrivs i protokollet. Celler som påverkas av oxidativ stress detekteras med hjälp av en generisk ROS känslig fluorescerande sond (CellROX, 2,5 M). Ett prov som inte inkuberas med ROS känsliga sonden har inkluderats som negativ kontroll. Jämföra provet utsattes för pro-oxidant behandling med respektive kontroll, det antal celler plottad på övre kvadranterna (UL + UR) är högre. FACS regelverkUtgåva inställningar var följande: Spänning kanaler: FL-1: 582 Logga; FL-4:. 410 Log D) Histogram visar den andel av celler (UL + UR) påverkas av oxidativ stress i H 2 O 2-behandlade embryon och respektive kontroll. Mätningar är relaterade till prover som visas i C. Celler som påverkas av oxidativ stress detekteras med hjälp av en generisk ROS känslig fluorescerande sond (CellROX, 2,5 M). Resultaten är medelvärdet av n = 2 olika biologiska replikat ± SD. E) Histogram som visar andelen av endotelceller (GFP +) påverkas av oxidativ stress (ROS +) av H 2 O 2-behandlade embryon och respektive kontroll. Mätningar är relaterade till prover som visas i C. Resultaten är medelvärdet av n = 2 olika biologiska replikat ± SD. F) Histogram som visar den procentuella andelen av celler som påverkas av oxidativ stress (ROS +) av nrf2a morphants (nrf2a MO) och respektive kontroller(Ctrl MO) vid 24 HPF. Resultaten är medelvärdet av n = 2 olika biologiska replikat ± SD G) Histogram som visar den procentuella andelen av celler som påverkas av mitokondriell oxidativ stress i behandlade embryon (Rotenone,. 10 pM) och respektive kontroller (Ctrl; DMSO) vid 72 HPF. Efter dissociation av embryon in i enskilda celler, var mitokondriell oxidativ stress (mitokondriell ROS +) mätt med en mitokondriell specifik sond (MitoSOX, 5 M). Resultaten är medelvärdet av n = 3 olika biologiska replikat ± SD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kritiska steg

Förfarandet för oxidativ stress detektering i zebrafiskembryon beskrivs häri innefattar två olika metoder. Hela berget ROS-detekteringsmetod är främst en kvalitativ analys för ROS-detektion, medan den enda cell ROS-detekteringsmetod tillåter mer specifika kvantitativa mätningar (Figur 1). Båda metoderna ger ett snabbt och enkelt sätt att utvärdera in vivo ROS-detektion på zebrafisk embryon. Men de båda presenterar några viktiga steg.

Kritiska steg besläktade med metod I

Den första metoden för hela montera ROS-detektering har den stora fördelen att lätt detektera oxidativ stress i alla vävnader i levande embryon (figur 2). Men det finns tre viktiga kritiska aspekter som måste beaktas och kan påverka resultatet av analysen: 1) Permeabiliteten av proben till embryovävnad, 2) proben toxicitet och 3): tee sond känslighet för låg ROS koncentration.

Den första aspekten är specifikt relaterade till vivo tillämpning av metoden 42 in. Den "cell-permeabilitet" egendom ROS känsliga sond är en viktig egenskap för att nå denna analys. Helst alla vattenlösliga kemikalier är optimala för leverans i levande zebrafisk embryon; men de flesta av de reagens för oxidativ stress detektion är olösliga i vatten. Sålunda är det vanligen rekommenderas att använda prober som är lösliga i DMSO (dimetylsulfoxid).

Det finns möjliga toxiska effekter på embryon i samband med koncentrationen av ROS-proben. Biverkningar som vanligen representeras av vävnadsskada (dvs. nekros) eller accelererad metabolism av sonden. Långa inkubationer (dagar) av zebrafisk embryon med hydroetidin sondorsaken embryo död medan höga doser av 5 - (och-6)-karboxi-2 ', 7'-diklorfluorescein diacetat ger non-specifik ackumulering av fluorescens i tarmen (opublicerade data). För att övervinna detta problem är det viktigt att övervaka embryon under inkubationen med sonden. Tester av flera koncentrationer och tider inkubation med samma sond skulle vara fördelaktigt också. Den optimala inkubationstiden möjliggör tillförsel och oxidation av den molekylära sonden utan ytliga vävnader skadas. Inkubationstider använder kemiska sonder (0,5-10 ^ M) kan i allmänhet fastställas inom intervallet 10-30 minuter och bör inte överstiga 1 timme. Detta tillstånd kan vara ganska svårt att sätta upp speciellt när mängden av oxidativa species är nära fysiologiska nivåer eller när den är begränsad till de inre embryonala vävnader. Det är när en hel organism inkuberas med en ROS-detektions kemisk sond, de mest ytliga vävnader (dvs hud, ögon och hjärta) är där sonden huvudsakligen oxideras och blir fluorescerande. Senare, är sonden successivt levereras till inre organ, lever eller vessels. Som en följd av detta är en lämplig tid för inkubation av zebrafisk embryon med ROS-detektion sond avgörande för att upptäcka oxidativ stress i alla vävnader.

Slutligen är det viktigt vid användning av denna metod för att undersöka känsligheten hos sonden till nivån av oxidativ stress uttrycks av vävnader. De flesta av de kommersiellt tillgängliga sonderna inte fint karakteriseras för sin känslighet och detta innebär att den optimala sond för specifika applikationer måste bestämmas empiriskt. Alla ROS-känsliga sonder upptäcker generellt höga nivåer av oxidativ stress, men de flesta av dem är inte känsliga för minimala förskjutningar av oxidativ stress 43.

För att begränsa denna nackdel och möjliggöra en mer detaljerad och exakt analys föreslås att tillämpa den andra metoden bygger på enstaka celler detektion av oxidativ stress.

Kritiska steg besläktade med metod II

Den sIngle-cell ROS-detekteringsmetod presenterar några viktiga steg. De är i huvudsak bestäms av en) effektiviteten i embryonal cell dissociation och genom 2) typen av ROS känslig prob associerad till analysen.

Den dissociation av embryon in i enskilda celler har anpassats från tidigare protokoll för zebrafisk cellanalys via flödescytometri 44 och presenterar två viktiga aspekter som kraftigt påverkar resultatet av hela förfarandet. Den första aspekten gäller den metod som används för att skilja embryon, medan den andra är relaterad till återvinning av dissocierade celler.

Den dissociation av embryon in i enskilda celler i huvudsak styrs av koncentrationen av dissociation reagens (dvs. kollagenas P och trypsin). Det måste emellertid beaktas att verkningsgraden för vävnadsdissociering är beroende av antalet embryon inkuberade och deras utvecklingsstadium. Zebrafisk embryon i tidigare utvecklingsstadier (24 HPF-48 HPF) är klokare att dissociation reagenser än larver (96 HPF-120 HPF) på grund av den progressiva vävnader tillväxt 45. Således är justeringar i dissociation förfarande krävs vid arbete med zebrafisk embryon vid olika utvecklingsstadier än 72 HPF. Överdriven inkubation med reagenser orsakar celldöd, medan minskad koncentration av reagens dissocierar endast delvis embryona. Eftersom det är viktigt att rätt dela upp vävnader, är det lika viktigt att samla in och bevara enskilda celler. En viktig faktor är den temperatur vid vilken celler återvinns efter vävnads division. Det är viktigt att hålla cellerna på is eller vid 4 ° C under centrifugering för att begränsa den oxidativa stressen sekundärt till mekanisk störning av vävnader eller hanteringsrutiner.

Den andra kritiska steget avseende den associerade sonden är kopplad till analysen på en specifik vävnad av intresse. Det enklaste sättet att upptäcka en cell population i zebrafisk erbjuds av det stora utbudet av transgena linjer som har etablerats under de senaste decennierna 46,47. Emellertid fluorescensen av den valda transgena linjen måste vara kompatibel med den ROS-detekteringssond. Det är viktigt att undvika överhörning mellan bakgrundsvävnad fluorescens och låg, men visst, fluorescenssignal som avges av sonden.

Tillämpningar av detta protokoll

Med tanke på båda metoderna erbjuder en enkel och kostnadseffektiv analys för att mäta oxidativ stress in vivo, är det möjligt att tillämpa detta protokoll för att flera villkor:

Mätningar av oxidativ stress i olika genetiska (t.ex. patologiska) Villkor

Oxidationsmedel och antioxidant gener lätt kan moduleras i zebrafisk embryon genom injektion av morpholinos (förlust-av-funktion) eller mRNA (gain-of-function). Nyligen rapporterade experiment av gen knock-down och microinprojicering av utjämnade mRNA i zebrafisk embryon etablerat olika roller för de antioxidant Nrf2a och Nrf2b gener i att skydda cellerna från oxidativ stress under utveckling. Metoder för genuttryck module bedömde en evolutionär bevarade axel mellan däggdjurs-och zebrafisk till hypoxi respons och oxidativ stress i neuronala celler 38,48. Dessutom är en stor möjlighet att studera oxidativ stress erbjuds av flera zebrafisk mutant linjer. Exempelvis zebrafishna ducttrip (DTP)-mutant representerar ett intressant exempel för karakterisering av oxidativ stress i samband med ett patologiskt tillstånd. DTP mutant bär en brist på S-adenosylhomocystein hydrolas (ahcy) genen och dess karakterisering visade att förlusten av Ahcy verksamhet orsakar leverdegeneration genom att påverka ROS nivåer 49. Ekvivalent, zebrafisk mutant Nrf2 fh318, bär en förlust-av-fungen mutation av transkriptionsfaktor Nrf2 gen, har betraktats med stort intresse för att undersöka den skyddande roll i denna antioxidant gen i lägre ryggradsdjur 50.

Mätningar av Redox State utlöses av läkemedelssubstanser

Behandling av zebrafisk embryon med små läkemedel kan hämma eller aktivera oxidativ stress. Vi visar nyligen att statinbehandling av zebrafisk embryon inducerad oxidativ stress som kan återvinnas genom Q10 behandling 51. Alternativt kan analysen av oxidativ stress i zebrafisk djurmodell för mänskliga RYR1 relaterade myopatier betonade den roll som antioxidant drog NAC (N-acetylcystein) som ett potentiellt terapeutiskt förhållningssätt för muskelsjukdom 52.

Storskalig Screening av små molekyler och droger för att karakterisera deras oxidativa egenskaper

Den zebrafisk är en väletablerad djur model för stor kemisk screening. En nyligen kemisk screening av små molekyler som utförs i zebrafisk identifierade antioxidanter som modulatorer av dopaminerga neuron överlevnad, som allvarligt påverkas i däggdjursneurodegenerativa sjukdomar som Parkinsons sjukdom 53. Denna metod kan användas för att screena för nya pro-eller antioxidant molekyler in vivo.

Betydelse och begränsningar

Den framträdande av både "hela berget" och "encelliga" ROS-detektionsmetoder bygger på förmågan att utföra in vivo-mätningar av oxidativ stress genom att använda enkla laboratorietekniker och basutrustning. Tillämpningen av zebrafisk som en djurmodell i kombination med ROS-upptäcka sonder gör inte bara blotta uppenbarelse av oxidativ stress, men också dess upptäckt i samband med en levande organism och kvantifiering på nivån för enskilda vävnader. Huvudsakligen kan dessa analyser varautföras med kommersiellt tillgängliga verktyg och inte kräver särskild kompetens för att kunna förverkligas. Dessutom har båda metoder är inte tidskrävande förfaranden och kan tillämpas med lämplig tidpunkt för att stora mängder av prover. Tillsammans dessa praktiska fördelar gör dessa metoder av särskild betydelse för att förbättra oxidativ stress analys in vivo.

Men dessa analyser visar också vissa begränsningar. I allmänhet är de flesta ROS-känsliga sonder nu kommersiellt tillgängliga inte värderats för fin kvalitativ och kvantitativ analys av oxidativ stress i levande celler. Den vanligaste hydroetidin och MitoSOX prober utformades för avkänning av superoxid (O2 -.), Men nyligen oro för sin specificitet har höjts, speciellt vid användning av fluorescensbaserade analyser 54. Analogt några rapporter avancerade tvivel om diklorfluorescein diacetat (DCFH-DA) för exklusiva H 2 2 avkänning 55,56. Dessutom dessa redox-aktiv fluorescerande prober kännetecknas av delvis icke-specifik aktivering (dvs. vävnad auto-fluorescens) och inte är reversibla efter oxidation. När den fluorescerande prob oxideras av ROS det inte kan komma tillbaka till sin icke-fluorescerande reducerade tillstånd. Följaktligen upptäckt av ROS fluktuationer med tidsupplösning begränsas genom tillämpning av sådana kemiska prober 43.

En betydande begränsning i detta fält är representeras av bristen på prober för exklusiva RNS upptäckt. Nyligen, proteomik baserade metoder visade att RNS inducerar proteinmodifieringar som anses som biomarkörer för nitroso-aktiv stress och kan utvärderas via immunoblotting-analyser med hjälp av specifika antikroppar mot protein oxidation / nitrering (t.ex. anti-SNO-cystein, anti-3- nitrotyrosin) 22,23. Men alla dessa analyser är endast indirekta mätningar av oxidativ stress utlöses av RNS och i de flesta fall de kräver cellextrakt, vilket innebär att de inte är tillämpliga på levande celler eller levande zebrafisk embryon.

Ett giltigt alternativ till konventionella sonder representeras av genetiskt kodade redox känsliga fluorescerande proteiner. De viktigaste beståndsdelarna i denna grupp är: roGFP, härrörande från gröna fluorescerande proteiner, rxYFP och cpYFP, ​​båda härledda från den gula fluorescerande protein och hyper sond, en specifik H 2 O 2-känslig fluorescerande prob 57. Alla dessa manipulerade redox prober skapade av fluorescerande proteiner tillåter fluorescensbaserade kvotmetriska kvantifieringar och möjliggöra högre tidsupplösning (från sekunder till minuter) än kemiska prober 58. In vivo-tillämpning av dessa biosensorer är också möjlig, vilket framgår av den zebrafisk transgen linje som uttrycker Hyper för realtidsanalys av endogen H 2 O 2 nivåer 39,59. Jagmplementing zebrafisk med genetiskt kodade sensorer ger ett optimalt system för att undersöka oxidativ stress, men kräver att inrätta ett transgent djur linje och lämpliga bildframställning. Förfarandet för oxidativ stress detektering i zebrafisk som presenteras här är mindre exakt än genetiska metoder, men är snabb och ger en primär analys för in vivo-detektion av höga nivåer av pro-oxidativa species. Noggrann mätning av individuella reaktivt syre och / eller kväve arter är för närvarande en gräns på detta forskningsområde. I framtiden kan kommande nanoskala redox-sensorer hjälpa till att lösa det här problemet. En framgångsrik tillämpning av nanopartiklar och nanorör baserade redox-sensorer har testats i ett flertal in vitro-studier, men inte som in vivo-analyser hittills 60.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hydrogen peroxide solution SIGMA 516813 DO NOT STORE DILUITIONS
Hank's Balanced Salt Solution 1x GIBCO 14025
Methyl cellulose SIGMA M0387
Instant Ocean Aquarium Sea Salt Mixture INSTANT OCEAN SS15-10
Tricaine SIGMA A5040
Cgeneric ROS-sensitive probe: CellROX Deep Red Reagent INVITROGEN C10422
Mitochondria specific ROS-sensitive probe: MitoSOX  INVITROGEN M36008 dissolve one vial with 13 μl of DMSO
Hydroethidine INVITROGEN D23107
Rotenone SIGMA R8875 Prepare 5 mM stock solution in DMSO. 
Dimethyl sulfoxide SIGMA D2650
VAS2870; 3-Benzyl-7-(2-benzoxazolyl)thio-1,2,3-triazolo(4,5-d)pyrimidine EnzoLifeScience BML-EI395 dissolve the powder in DMSO; diluite in fish water
Propidium Iodide  Molecular probes
(Life Technologies)
P3566
7-aminoactinomycin D (7-AAD)  Molecular probes
(Life Technologies)
A1310
Nrf2a Morpholino GeneTools 5'-CATTTCAATCTCCAT
CATGTCTCAG-3'
Ref: Timme-LaLaragy et al.; 2012 (PMID: 22174413); Kobayashi et al.; 2002 (PMID:12167159)
Collagenase P ROCHE 11213857001 Dissolve the powder at 100 mg/ml in sterile HBSS. Store aliquots at -20 °C
Phosphate-Buffered Saline (PBS) GIBCO 10010-056
Fetal Bovine Serum  GIBCO 10082-147
Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets ROCHE Dissolve one tablet in 1 ml of water
0.5% Trypsin-EDTA (10x), no phenol red GIBCO 15400-054 Prepare 1x working solution before usage
Compound microscope  ZEISS
Stereo microscope with fluorescent illumination Nikon AZ100
Camera ZEISS AxioCamMRm
software for fluorescence image acquisition ZEISS ZEN 2011
Fluorescence-activated cell sorter BD FACSCalibur
Centrifuge  Eppendorf 5417R
FACS tubes  BD 342065
Multiwell Plate  BD Falcon 353047
Sterilized, non treated Petri dishes 90 mm VWR 391-1915
Confocal microscope Leica Leica SP5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alfadda, A. A., Sallam, R. M. Reactive oxygen species in health and disease. J Biomed Biotechnol. 2012, (2012).
  2. Lu, T., Finkel, T. Free radicals and senescence. Exp Cell Res. 314, 1918-1922 (2008).
  3. Chen, A. F., et al. Free radical biology of the cardiovascular system. Clin Sci (Lond. 123, 73-91 (2012).
  4. Selvaraju, V., et al. Diabetes, oxidative stress, molecular mechanism, and cardiovascular disease--an overview. Toxicol Mech Methods. 22, 330-335 (2012).
  5. Gandhi, S., Abramov, A. Y. Mechanism of oxidative stress in neurodegeneration. Oxid Med Cell Longev. 2012, (2012).
  6. Shi, X., Zhang, Y., Zheng, J., Pan, J. Reactive oxygen species in cancer stem cells. Antioxid Redox Signal. 16, 1215-1228 (2012).
  7. Cui, X. Reactive oxygen species: the achilles' heel of cancer cells. Antioxid Redox Signal. 16, 1212-1214 (2012).
  8. Park, H., Bourla, A. B., Kastner, D. L., Colbert, R. A., Siegel, R. M. Lighting the fires within: the cell biology of autoinflammatory diseases. Nat Rev Immunol. 12, 570-580 (2012).
  9. Nathan, C., Ding, A. SnapShot: Reactive Oxygen Intermediates (ROI). Cell. 140, 951-951 (2010).
  10. Brown, G. C., Borutaite, V. Interactions between nitric oxide, oxygen, reactive oxygen species and reactive nitrogen species. Biochem Soc Trans. 34, 953-956 (2006).
  11. Brieger, K., Schiavone, S., Miller, F. J., Krause, K. H. Reactive oxygen species: from health to disease. Swiss Med Wkly. 142, (2012).
  12. Littarru, G. P., Tiano, L., Belardinelli, R., Watts, G. F. Coenzyme Q(10), endothelial function, and cardiovascular disease. Biofactors. 37, 366-373 (2011).
  13. Landete, J. M. Dietary intake of natural antioxidants: vitamins and polyphenols. Crit Rev Food Sci Nutr. 53, 706-721 (2013).
  14. Finkel, T. Oxidant signals and oxidative stress. Curr Opin Cell Biol. 15, 247-254 (2003).
  15. Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417, 1-13 (2009).
  16. Sarsour, E. H., Kumar, M. G., Chaudhuri, L., Kalen, A. L., Goswami, P. C. Redox control of the cell cycle in health and disease. Antioxid Redox Signal. 11, 2985-3011 (2009).
  17. Nathan, C., Shiloh, M. U. Reactive oxygen and nitrogen intermediates in the relationship between mammalian hosts and microbial pathogens. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 8841-8848 (2000).
  18. Finkel, T. Signal transduction by reactive oxygen species. J Cell Biol. 194, 7-15 (2011).
  19. Autreaux, B., Toledano, M. B. ROS as signalling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 813-824 (2007).
  20. Maryanovich, M., Gross, A. A ROS rheostat for cell fate regulation. Trends Cell Biol. 23, 129-134 (2013).
  21. Tonks, N. K. Redox redux: revisiting PTPs and the control of cell signaling. Cell. 121, 667-670 (2005).
  22. Antelmann, H., Helmann, J. D. Thiol-based redox switches and gene regulation. Antioxid Redox Signal. 14, 1049-1063 (2011).
  23. Foster, M. W., Hess, D. T., Stamler, J. S. Protein S-nitrosylation in health and disease: a current perspective. Trends Mol Med. 15, 391-404 (2009).
  24. Albrecht, S. C., Barata, A. G., Grosshans, J., Teleman, A. A., Dick, T. P. In vivo mapping of hydrogen peroxide and oxidized glutathione reveals chemical and regional specificity of redox homeostasis. Cell Metab. 14, 819-829 (2011).
  25. Knoefler, D., et al. Quantitative in vivo redox sensors uncover oxidative stress as an early event in life. Mol Cell. 47, 767-776 (2012).
  26. Fang, L., Miller, Y. I. Emerging applications for zebrafish as a model organism to study oxidative mechanisms and their roles in inflammation and vascular accumulation of oxidized lipids. Free Radic Biol Med. 53, 1411-1420 (2012).
  27. White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
  28. Amatruda, J. F., Patton, E. E. Genetic models of cancer in zebrafish. Int Rev Cell Mol Biol. 271, 1-34 (2008).
  29. Jing, L., Zon, L. I. Zebrafish as a model for normal and malignant hematopoiesis. Dis Model Mech. 4, 433-438 (2011).
  30. Shin, J. T., Fishman, M. C. From Zebrafish to human: modular medical models. Annu Rev Genomics Hum Genet. 3, 311-340 (2002).
  31. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
  32. Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Dev Cell. 21, 48-64 (2011).
  33. Duan, J., Yu, Y., Li, Y., Sun, Z. Cardiovascular toxicity evaluation of silica nanoparticles in endothelial cells and zebrafish model. Biomaterials. 34, 5853-5862 (2013).
  34. Sobrino-Figueroa, A. S. Evaluation of oxidative stress and genetic damage caused by detergents in the zebrafish Danio rerio (Cyprinidae). Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 165, 528-532 (2013).
  35. Xu, H., et al. Oxidative stress and immune related gene expression following exposure to di-n-butyl phthalate and diethyl phthalate in zebrafish embryos. Ecotoxicol Environ Saf. 93, 39-44 (2013).
  36. Hermann, A. C., Millard, P. J., Blake, S. L., Kim, C. H. Development of a respiratory burst assay using zebrafish kidneys and embryos. J Immunol Methods. 292, 119-129 (2004).
  37. Rieger, S., Sagasti, A. Hydrogen peroxide promotes injury-induced peripheral sensory axon regeneration in the zebrafish skin. PLoS Biol. 9, (2011).
  38. Timme-Laragy, A. R., et al. Nrf2b, novel zebrafish paralog of oxidant-responsive transcription factor NF-E2-related factor 2 (NRF2). J Biol Chem. 287, 4609-4627 (2012).
  39. Niethammer, P., Grabher, C., Look, A. T., Mitchison, T. J. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459, 996-999 (2009).
  40. Murphy, M. P., et al. Perspective. Cell Metabolism. 13 (4), 361-366 (2011).
  41. Li, N., et al. Mitochondrial complex I inhibitor rotenone induces apoptosis through enhancing mitochondrial reactive oxygen species production. J Biol Chem. 278, 8516-8525 (2003).
  42. Rhee, S. G., Chang, T. S., Jeong, W., Kang, D. Methods for detection and measurement of hydrogen peroxide inside and outside of cells. Mol Cells. 29, 539-549 (2010).
  43. Murphy, M. P., et al. Unraveling the biological roles of reactive oxygen species. Cell Metab. 13, 361-366 (2011).
  44. Covassin, L., et al. Global analysis of hematopoietic and vascular endothelial gene expression by tissue specific microarray profiling in zebrafish. Dev Biol. 299, 551-562 (2006).
  45. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
  46. Beis, D., Stainier, D. Y. In vivo cell biology: following the zebrafish trend. Trends Cell Biol. 16, 105-112 (2006).
  47. Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140, 2835-2846 (2013).
  48. Moussavi Nik, S. H., et al. The BACE1-PSEN-AbetaPP regulatory axis has an ancient role in response to low oxygen/oxidative stress. J Alzheimers Dis. 28, 515-530 (2012).
  49. Matthews, R. P., et al. TNFalpha-dependent hepatic steatosis and liver degeneration caused by mutation of zebrafish S-adenosylhomocysteine hydrolase. Development. 136, 865-875 (2009).
  50. Mukaigasa, K., et al. Genetic evidence of an evolutionarily conserved role for Nrf2 in the protection against oxidative stress. Mol Cell Biol. 32, 4455-4461 (2012).
  51. Mugoni, V., et al. Ubiad1 is an antioxidant enzyme that regulates eNOS activity by CoQ10 synthesis. Cell. 152, 504-518 (2013).
  52. Dowling, J. J., et al. Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy. Brain. 135, 1115-1127 (2012).
  53. Sun, Y., Dong, Z., Khodabakhsh, H., Chatterjee, S., Guo, S. Zebrafish chemical screening reveals the impairment of dopaminergic neuronal survival by cardiac glycosides. PLoS One. 7, (2012).
  54. Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radic Biol Med. 48, 983-1001 (2010).
  55. Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy. Free Radic Res. 44, 587-604 (2010).
  56. Karlsson, M., Kurz, T., Brunk, U. T., Nilsson, S. E., Frennesson, C. I. What does the commonly used DCF test for oxidative stress really show. Biochem J. 428, 183-190 (2010).
  57. Belousov, V. V., et al. Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nat Methods. 3, 281-286 (2006).
  58. Bjornberg, O., Ostergaard, H., Winther, J. R. Measuring intracellular redox conditions using GFP-based sensors. Antioxid Redox Signal. 8, 354-361 (2006).
  59. Yoo, S. K., Starnes, T. W., Deng, Q., Huttenlocher, A. Lyn is a redox sensor that mediates leukocyte wound attraction in vivo. Nature. 480, 109-112 (2011).
  60. Uusitalo, L. M., Hempel, N. Recent Advances in Intracellular and In Vivo ROS Sensing: Focus on Nanoparticle and Nanotube Applications. Int J Mol Sci. 13, 10660-10679 (2012).

Tags

Utvecklingsbiologi , Zebrafiskembryon endotelceller redoxtillstånd analys oxidativ stress detektering, FACS (fluorescensaktiverad cellsorterare) molekylära sonder
Analys av oxidativ stress i Zebrafish embryon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mugoni, V., Camporeale, A., Santoro, More

Mugoni, V., Camporeale, A., Santoro, M. M. Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (89), e51328, doi:10.3791/51328 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter