心肌缺血再灌注损伤的通过左前降支结扎小鼠模型

Summary

我们介绍一种手术方法来诱导实验性缺血/再灌注（I / R）损伤模拟心肌梗死（MI）的小鼠模型，允许在结扎定位左前降支（LAD）上更清晰，增加了重复性MI的实验小鼠。

Abstract

急性或慢性心肌梗死（MI）是导致高发病率和死亡率心血管事件。建立病理机制在工作期间心肌梗死并制定有效的治疗方法，需要的方法来重复地模拟临床发病率，并反映与心肌梗死相关的病理生理改变。在这里，我们描述了一种手术方法来诱导心肌梗塞的小鼠模型，可用于短期缺血 - 再灌注（I / R）损伤以及永久性结扎。这种方法的主要优点是便于左前降支（LAD）的位置，以允许该动脉的准确结扎来诱导局部缺血的小鼠心脏的左心室。结扎对LAD准确定位增加梗死面积的可重复性，从而产生更可靠的结果。在结扎位置更高的精确度将提高标准的手术方法来模拟心肌梗死小鼠中，THUS减少了必要的实验动物的数量统计上相关的研究和改进我们的生产心功能不全以下心肌梗死的机制的理解。这种小鼠心肌梗死模型也是靶向心肌损害以下MI治疗的临床前测试非常有用。

Introduction

心肌梗死（MI）的动物模型是很重要的缺血性心脏疾病¹的复杂病理生理机制的研究。缺血 - 再灌注（I / R）损伤是一个重大的贡献MI期间产生的心肌损伤。经冠脉循环的阻塞产生的初始缺血损伤可在心肌梗死患者通过使用血管成形术来及时恢复灌注最小化。尽管这种干预已经死亡的人数大大减少因急性心肌梗死，血流恢复到缺血区会导致I / R损伤，导致心肌细胞的死亡。这种损失心肌质量有助于心输出量和对心脏衰竭恶化下降。因此，这导致从I / R损伤心肌细胞死亡机制的研究是调查在心血管研究的重要防线。外科冠脉结扎术是一种有用的实验技术诱导心肌梗死在各种动物模型的类型，includi纳克的大鼠，狗和猪。在不同的实验室的出版物纷纷出台关于建立I / R损伤^2,3小鼠心脏模型的各种方法。为了深入了解这些机制，我们必须获得可靠的动物模型，可以重现心肌梗死病理的几个方面。这种模型的发展也是用于测试治疗方法治疗心肌梗死和相关的I / R损伤至关重要。

大部分的现有的外科手术技术来模拟MI在实验动物涉及手术解剖入胸腔，以暴露左前降支（LAD），然后由一个连字为定义的周期中的时间来产生的缺血性事件闭塞。然后该绑带可以移除，以允许缺血区的I / R损伤和产生再灌注损伤。这些方法中，关于在LAD文献的位置并不总是精确地再现，其中一个主要的限制可以导致变异的心肌梗死的诱发这种做法的严重性。大多数现有技术在心脏前壁一般只描述法援署的大致位置。由于法援署的分支和方向可以在动物个体而异的位置并不总是固定的，可以很容易混淆^4,5，手术⁶时导致潜在的并发症。放置不当的绑带的后果可以从变异诱发左心室完全损害模型的特异性梗塞的大小运行。这里，我们提出对心肌I / R和在小鼠体内的永久结扎，其允许在LAD结扎线放置的改进的准确性的改进方法。通过施加初始切口和内部夹层，以及使用的操作的解除心房，以便更好地欣赏LAD和站点如果出现从主动脉的具体方法。建立在LAD和它的起源位置提供了机会，结扎LAD可重复的方式。心肌I / R和永久结扎该模型不仅降低手术后的变化在梗塞面积，它也可以在操作过程中减少过度出血的发生率。

Protocol

这种动物议定书批准，并按照规定的机构动物护理和使用委员会（IACUC）在俄亥俄州立大学的准则和法规。由当地IACUC制定的所有政策都符合了实验动物福利办公室在美国国立卫生研究院研制的动物实验指南。

1，麻醉和气管插管

1. 使用高压灭菌前所有仪器和手术用品。整个手术过程中戴无菌，一次性使用手术手套。保持无菌区域在整个手术过程。使用无菌悬垂的建议，但在视频中没有显示，以便更好地在鼠​​标可视化的解剖标志。
2. 单独地将每个小鼠在感应腔和用5％异氟烷和氧气为0.4升/分钟的流速，直到正向反射丧失提供麻醉，然后保持第ë动物用2％异氟醚在100％氧气为0.4升/分钟通过鼻锥管连接到麻醉机，直到气管导管到位的方式流动。用异氟醚麻醉机应适当通风，并配备了木炭过滤器，在操作过程中尽量减少医生暴露于异氟醚烟雾。鼻锥注意到但在视频中未示出，以允许操作的可视插管鼠标。
3. 剃除动物的胸带在不同位置的动物毛发推剪比手术平台，以避免手术位置的污染。
4. 鼠标放置在手术平台，为后续插管仰卧位。一个简单的小的聚苯乙烯泡沫平台可以作为一个操作平台。盖上预先消毒盖布，以提供无菌表面的平台。放置一个加热垫的平台和悬垂性之间维持小鼠中surgica体温升过程。
5. 附加的至少10cm 2-0丝线缝合的长度与带的平台，然后环缝线围绕前上门牙。在靠近（2-3厘米）的锥形定位到平台的在鼠标的鼻部的边缘。拖动鼠标拉紧并用一块胶布尾巴将其固定到平台上。
6. 固定腿向身体的两侧的带合股线。重要的是，前面的四肢不过度紧张，因为这可能会危及呼吸。
7. 准备剃光手术部位用优碘和酒精的颈部和胸部切口才制成。
8. 放置平台，用鼠标头指向操作者的方向。切具有0.5cm正中颈部皮肤切口。分离甲状腺叶在其峡部，以暴露胸骨舌骨肌肌肉，其中气管可以根据肌肉可以看出。
9. 除去18号套管针的内针，因此它可以被用来作为intub通报BULLETIN管。针尖可以作为支架，1厘米外管的可作为气管套管。
10. 按住鼠标用弯钳的舌头，另一只手稍微动一下向上。通过子宫颈皮肤切口看到气管。用另一只手轻轻地插入插管直至管子被认为是在气管内。
11. 只要管子在气管中，将在朝向管另一方面弯曲的镊子，并迅速取出内针。如果管不能被插入到气管，该管应拉出，以避免产生呼吸问题。它指向的管向上的尖端，当它靠近喉部，以避免在插入管进入食道而不是气管是很重要的。

2，通风和固定

1. 提供人工通气与动物呼吸器通气2％异氟烷在氧气中为0.4升/分钟的流速。使用改性Y-SHAPE连接到插管与呼吸机连接。气管导管的正确定位可以通过判断对称的胸部扩张得到证实。
2. 设定潮气量为260微升/冲程和通气速率是每分钟130冲程，其可以被调整到体重特定鼠标，如果必要的。
3. 取出磁带的尾巴上，然后转动鼠标轻轻将它放在一个正确的卧位为后续手术。用胶带重新固定尾巴和腿的平台。
4. 插入直肠探头监测体温并调整变暖垫，保持约37ºC的温度
5. 用胶带固定探头的平台。布比卡因注射在皮下切口部位麻木的区域切口前作出。

3。开胸

1. 做一个斜切口也就是大约1厘米长在站台2 mm处从左侧在哪里左前腿符合主体（以下，其中腿和身体加入约1-2毫米）的方向胸骨。浅表胸静脉靠近这个位点和切口应使得切口的侧端上升到，但不会切入，静脉。
2. 虽然切胸肌肉下方露出肋骨。在此步骤期间避免血管意外伤害。如果出血确实发生，用棉花涂药停止任何出血继续下一步骤⁷之前。
3. 可视化的肋骨和透过薄薄的半透明胸壁肺膨胀。用手术剪，以6-8毫米的切口在第三肋间打开胸腔。这个切口应该是一个最小为2 mm从胸骨处所在的胸廓内动脉的位置。损坏动脉会产生大量出血是难以控制的。
4. 将预先消毒自制的胸部拉钩INTØ切口，轻轻地拉了回来，打开切口，使其约8-10毫米宽的同时小心避开肺。该卷收器应附到外科手术平台与标签了。
5. 在这一点上的心脏应该是可见的，然而，肺仍然覆盖心脏上的一个部分。轻轻拿起心包弯钳，拉它拆开，然后滑动牵引器背后的组织。在这个操纵肺会抬起并远离心脏。

4。定位法援署

1. 通过解剖镜下找到心脏表面上的法援署。法援署流下心脏壁从靠近心脏向下穿过左心室心尖部的中间。法援署会出现鲜红色，并坚决脉冲。这里的静脉有时被误认为法援署，但是适当的照明可以帮助区分两艘船只。如果光线太亮可能很难体会到的颜色血管之间的差异。
2. 用无菌棉球片段的直径为约1-2毫米，以准备在LAD用于连接。将左心房和左心室之间的棉花，这将解除左心房，并帮助揭露LAD和澄清其立场。如果在LAD不能定位，该片段可以进一步使左心房被提升更高，揭示其中LAD来源于主动脉滑动。

5，LAD结扎

1. 对于结扎的理想定位是比左心耳的前端下大约为2毫米。肺动脉干，可以用作标记，以帮助识别左外耳。可替换地，结扎位置可以看作一个点1-2毫米远离左回旋的分支。用弯钳在紧随拟结扎点以下站点轻轻地施加压力。这将使它更容易看到的动脉也将有助于保持心脏的地方并简化绑绷带。用钳子超过5秒钟的时间，不要施加压力，并避免可能改变泵的心脏压缩。
2. 使用锥形针通过6-0丝线缝合LAD下方同时用解剖显微镜观察。将针头准确动脉下仿佛置身太深针将进入左心室腔或损坏法援署如果针太浅。如果在LAD受伤取出针和缝合LAD控制出血，但如果出血不能被控制，优选安乐死的动物。
3. 使一个松散的双结的缝合，留下通过一个2-3毫米长片的PE-10管放置⁸ 2-3毫米直径的环。
4. 拧紧动脉和管道周围循环再固定循环通过把一个额外的活结，小心不要损坏室壁。对于永久性结扎，直接将法援署与结^9。通过检查在应该出现结扎后的几秒钟内，该LV的前壁外观苍白色的确认LAD闭塞。
5. 取下牵引器并暂时通过与斗牛犬一起夹捏肌肤关闭伤口。的时间缺血保持长度取决于实验设计，但常常是20，30，45或60分钟。鼠标仍然在呼吸机上的LAD动脉阻塞的持续时间。

6。再灌注

1. 缺血期后取出钢夹，然后插入胸部拉钩暴露结扎。解开，取下PE-10管。通过观察返回的LV后15-20秒前壁的粉红色的确认再灌注。
2. 离开缝合到位，如果2％三苯基氯化四唑（TTC）和蓝染色将灌注后进行。如果染色是没有必要的，缝合线可以bE法除去。
3. 再灌注时间将取决于实验设计中，通常从1小时跨越到24小时。

7，胸部闭合和术后护理

1. 缝制关闭胸腔关闭切口在^第三肋间用4-0丝线缝合。重要的是，肺部有明显的缝线，并不会成为被困的3 ^和第 4肋骨缝合在一起。同时追平了缝线结是有帮助的轻微压力施加到胸前持针器，以尽量减少任何室内空气可能被截留在胸腔。
2. 收肌的所有层使用4-0丝线连续缝合。使用尼龙缝合关闭了连续缝合皮肤。可选地，皮肤可以被关闭以间断缝合。
3. 当缝合完成后辍异氟醚的流动，而氧气继续流动。当鼠标移动胡须或尾部吧，建议立即进行删除D开始进行尝试自主呼吸。从与插管呼吸​​机取下鼠标仍保留在气管。
4. 仔细观察动物，直到鼠标恢复正常的呼吸模式，然后拔管鼠标。该管应缓慢取出，以避免口腔分泌物误吸。
5. 确认鼠标是不是在任何呼吸窘迫由它返回一个笼子前，观察它的另一个3-5分钟。如果脱水迹象手术后的观察，提供高达0.5毫升无菌生理盐水腹腔注射。
6. 对于手术后的镇痛，管理阿片类镇痛药（丁丙诺啡，0.1毫克/千克），皮下（SC）的前动物门诊，然后提供一个额外的剂量每4-6小时在接下来的24小时。检查窘迫的属相在12小时后手术。使用模拟手术存活心肌梗死，需要痛苦和困扰下从苏复苏的评估rgery。目前公认的最佳做法是提供镇痛前24小时以下的侵入性程序给定的保证，由于体重减轻或疼痛的迹象追加剂量。对于永久性结扎，体重应每天跟踪，以帮助衡量动物的恢复。
7. 布洛芬（布洛芬），非类固醇消炎药（NSAID），具有抗炎，镇痛和解热的活性，或其他NSAID，可在动物的饮用水提供为0.2毫克/毫升的溶液用于手术前两天和高达手术后7天随着丁丙诺啡管理任何额外的疼痛/不适。

心肌梗死面积8。测量

1. 麻醉和插管鼠标在所需的再灌注时间的尽头。切开胸部皮肤在中线至剑突。打开下方的肋骨和锁骨中线两侧的腹部和隔膜。
<LI>暴露心脏，然后重新结扎在同一位置的法援署。导管插入主动脉所以10％的酞菁蓝，可以慢慢地直接注入主动脉从非缺血区¹⁰弄脏的心脏的缺血区的划定。
2. 迅速摘除心脏并在30毫米氯化钾（氯化钾溶液）清洗它停止了心脏跳动，并允许更一致的切片。冻结心脏，至少4小时，在-20°C和切心脏成使用心脏矩阵切片装置¹¹ 1 mm层厚。
3. 培养心脏切片用2％TTC，在37℃40分钟。梗死区被划为白色区域，而活组织染色红。
4. 固定染色切片用10％甲醛过夜，这将有助于增加梗死区和正常组织之间的对比度。拍摄切片并计算以危险区（AAR），非缺血区和使用ImageJ软件的梗塞面积。

<P类=“j​​ove_title”> 9。的心脏酶水平测量

测量肌钙蛋白小鼠通过获得来自门静脉的血，然后通过离心分离血清，血清中I（cTnI水平）的水平。血清cTnI的水平然后用定量的快速cTnI检测¹²确定。

Representative Results

在24小时再灌注损伤，心肌梗死面积和地区高危（AAR），用酞菁蓝染料和三苯四氮唑（TTC），法援署结扎可以通过观察心肌组织远端热烫的缝合证实的分析以及前壁的功能障碍。再灌注可以通过红色的回归心肌组织和前壁运动的一些复苏的演示验证。

梗塞区域（白色）应该是区别于领域的风险（红色）和面积没有风险（蓝色）。的酞菁蓝染（ 图1A）应用程序允许的心脏所在闭塞法援署的，而并非染成蓝色染料的心只能显示梗死（ 图1B）的区域的面积的分辨率。梗塞的大小是依赖于缺血的持续时间。重要的是，心肌肌钙蛋白I（cTnI水平）水平低假手术动物，经历一切手术过程中，除了缺血再灌注相比，动物，经历心肌梗塞（ 图2）。这表明，假手术并没有产生显著心肌病理改变，而缺血/再灌注损伤是足以产生这种广泛使用的生物标志物的MI升高。

图1：梗塞以下LAD闭塞手术的程度的量化 （ 一 ）从动物野生型小鼠心脏切片进行到45分钟缺血和再灌注24h代表形象。注射蓝色染料允许，是不是在危险中为梗塞心脏的非缺血区的评估。一个心脏，其中蓝色染料是不是注射的（B）代表图像要强调的区域高危（AAR），它出现红色，并且梗塞面积，从而出现白色。每个区域的面积计算为总左心室（LV）的面积乘以该切片的总重量的百分比。 点击这里查看大图。

图2：使用肌钙蛋白水平作为心肌梗死的程度的测量心肌肌钙蛋白的条形图中经受45分钟的缺血再灌注24小时（I / R）或假手术小鼠我（的CTnl）水平作为对照。血液从门静脉在从三只动物为每个组手术后24小时收集。肌钙蛋白I的水平都显著升高动物相比，假手术对照组动物（1.195±0.06651）以下I / R损伤（9.195±0.07146）。数据以平均值±SEM和***表示P <0.0001比较，假手术对照组和I / R组T检验。 点击这里查看大图。

Discussion

小鼠心肌缺血再灌注模型是一种有效的方法心血管研究模拟临床急性或慢性心脏疾病^13,14。显著的努力已经被应用到发展和完善产生缺血性事件再灌注损伤几种不同类型的动物的心外科手术的方法。虽然有特定的优势，以使用不同的动物系统，鼠标具有导致在小鼠心脏产生心肌I / R广泛关注的特点。其中一个重要的原因是鼠标系统的遗传可追踪性。广泛的选择提供转基因动物，并通过该新模型可以产生解决具体问题相对容易的，也敌不过其他动物模型系统。另一个原因是在心血管研究中越来越多地使用鼠标的是外科手术设备和特定的其他实验工具的日益普及盟友设计在鼠标的使用。小鼠模型的成本相对较低也是一个重要的贡献及其在研究中使用。对于严格的需求日益增加在临床前研究中需要使用额外的动物，其可以是更现实时更少的资源是必要的，包括动物的适当数量。虽然使用的小鼠模型中有几个优点考虑的小鼠和人体心血管生理学的不同方面，尤其是当有一些缺点。许多较大的动物模型，如狗，猪，更加紧密地模仿人体心血管生理学比鼠标的大多数方面。另一个缺点是鼠标，操纵在小鼠的心脏较小的尺寸要求较高程度的外科技术人员，特别是定位在LAD和可重复性地结扎它来产生一个一致的梗死区中的左心室。这里介绍的方法，可以提供在识别一个显著改善ND结扎法援署的。我们在从心脏（ 图2）的cTnI释放的量一致的结果表明，我们可以重复地产生一个类似尺寸和心肌细胞死亡水平的梗塞。

手术的一个重要方面，诱导实验性心肌梗死是法援署的标识清晰和结扎。在我们的方法在这里详细说明我们改进的方法来识别和访问LAD，允许在容器上的结扎更一致的定位。在手术过程中，我们利用一小块消毒棉的解除左心房和充分暴露法援署，阐明法援署的位置，便于LAD结扎。这对于从其他方法的技术和分化点的关键步骤。这些修改对LAD结扎的简介应允许更多的可重复的结果在小鼠模型模拟心肌梗死的过程中。而在这里改进的精确度结扎换货应该改善梗塞的大小一致性产生它仍然是重要的用酞菁蓝染料灌注测量在危险区。这是尤其如此利用遗传修饰小鼠品系，其中基因表达的操纵可能导致改变的心脏血管结扎响应的过程中。

结扎确认缺血的另一个关键步骤已经由法援署结扎有效地产生。在危险的区域中的不同的，快速的颜色变化的观察是可以肯定，缺血性病症已经产生在心肌的靶向部分是必不可少的。在心肌颜色的变化应在几秒钟内可以看到，如果在LAD有效地遮挡。在程序中其他关键步骤涉及的缺血期的持续时间和允许再灌注时间的实验端点检测前。诚如公关otocol，在缺血期间的长度可以改变，以产生不同程度的对心脏缺血性损伤。通常缺血的一个较长时期，将导致更广泛的心肌细胞死亡整个危险区。再灌注的长度可能对心脏的病理的发展，包括纤维化病变的心脏的外观以及心输出量和电生理变化的稳定化效果。因此，这些实验性的步骤的特定长度必须被定制以满足在研究中的具体问题。实验终点也应根据使用缺血和再灌注期间和具体的问题在实验中要处理的长度选择的。我们目前采用TTC染色测量心肌梗死面积和血清血清cTnI水平的酶联免疫吸附测定为终点，以评估心肌损伤的程度。这些端点可用于灌注的任何长度，但是它们特别USEFUL缩短再灌注时间（24小时），其中功能缺陷可能还没有稳定下来呢。虽然我们不细讲这里对心输出量的测量功能，如多普勒超声心动图¹⁵和冠状动脉血流量¹⁶微球的测量，这些方法是有用的在较长期的实验，如慢性阻塞理解的变化，心功能法援署。

虽然使用的MI小鼠模型有很大的优势为I / R损伤心脏的研究还存在局限性，这些方法。因为主要的手术切口必须作出入胸腔所得的组织破坏和相关的炎症可以影响心脏的心肌梗死影响的响应。这些问题可以通过使用假手术对照组小鼠，其中所有的外科手术步骤，都与该异常周围的绑带的收紧所进行的被部分地解决法援署。这是由手术的侵入性产生的另一个问题是需要管理过程中和手术后出现的疼痛和痛苦。疼痛管理办法，符合当前的最佳实践详情载于本程序，是必要的，以防止实验动物的痛苦。要知道，使用许多不同类型的麻醉剂和止痛药可以有心脏保护作用下它们的应用是很重要的。因此，适当的对这些药物适用于对照小鼠，即使是不使用假手术任何的对照小鼠中，为了避免任何并发症的实验结果的解释。另一个限制到这样的做法是，它并没有提供病理学的完美仿真人的MI有关。经常用于这样的实验小鼠模型中不从共同病态所依据的MI在人类中，如冠状动脉血管疾病，糖尿病和高血压患。这样并发症中不存在在小鼠模型中，可能对所研究的特定的实验和分析结果时，因此，应考虑的路径的效果。在这些情况下，使用该显示一些这些相关病症的遗传修饰的小鼠可能是适当的，更有效地进行建模的疾病，因为它会呈现在人类患者。在将来，这种方法的其他方面可以进行修改，以更准确地模拟人类的心肌梗塞病理的其它方面。

尽管有这些限制，这里所描述的方法表示，模拟多的多元智能理论在人类患者的病理影响鼠标产生局部I / R损伤的有效途径。我们的技术可以更容易操作，可导致更多的可重复性的结果，简化了手术法援署的。然而，掌握这项技术仍然需要只能通过实践来获得显著手术技巧的过程。采取足够小心在进行手术时，特别是在其中这是指出，在协议的地方，将改善动物的存活率，以及与实验结果的可重复性。一旦手术方法掌握了，这个协议将证明是相当有用的调查研究心肌梗死对心血管生理的影响以及那些有兴趣在测试治疗干预的效果在小鼠模型。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PhysioSuite with RightTemp Homeothermic Warming	Kent Scientific Corp	PS-RT
Light source	Zeiss	KL 1500 LCD
Mouse Heart Slicer Matrix	Zivic Miller	HSMS001-1
Micro Tray - Base, Lid, & Mat (6.0 x 10 x 0.75)	Fine Science Tools	6100A
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	Sigma Aldrich	T8877
Buprenorphine (Buprenex Injectable)	Reckitt Benkiser Healthcare	NDC 12496-0757-1
bupivacaine	Hospira	NDC 0409-1163-01
Isoflurane	Abbott	NDC 5260-04-05
Betadine Soultion	Purdue Pharma	25655-41-8
Mouse Cardiac Troponin T(cTnT) ELISA	Kamiya Biomedical Company	KT-58997
Fine Scissors	Fine Science Tools	14040-10
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-30
Dumont #3 Forceps	Fine Science Tools	11231-30
Castroviejo Micro Needle Holders	Fine Science Tools	12060-01
Slim Elongated Needle Holder	Fine Science Tools	12005-15
Round Handled Needle Holders	Fine Science Tools	12075-12
Omano Trinocular Stereoscope	Microscope.com	OM99-V6
SB2 Boom Stand with Universal Arm	Microscope.com	V6
Tracheal Tube, 0.5 mm, 1/16 in Y	Kent Scientific Corp	RSP05T16
Anesthesia Systems for Rodents and Small Animals	VetEquip, Inc	901807
4-0 silk taper suture	Sharpoint™ Products	DC-2515N
6-0 silk taper suture	Sharpoint™ Products	DC-2150N