Summary
白细胞募集到肝脏发生这是由独特的肝窦内皮细胞衬里肝窦的专业渠道内。整个生理切应力条件下的人力肝窦内皮细胞白细胞招聘相衬显微镜可以促进其背后这一过程的分子机制的阐明。
Abstract
白细胞浸润到人肝组织中所有成年肝脏炎性疾病的一个共同的过程。慢性浸润可以驱动纤维化进展的发展为肝硬化。了解介导白细胞募集到肝脏的分子机制可以识别肝脏疾病的重要治疗靶标。白细胞招募期间的关键相互作用是炎症细胞与剪切应力的条件下，内皮细胞。招聘到肝脏发生这是由肝窦内皮细胞（HSEC）内衬肝窦的低剪切通道内。肝窦内的条件可以通过在特定的流速内衬由人类HSEC单层通道灌注白细胞进行概括。在这些条件下的白细胞进行一个简短的圈养步骤和随后的激活和紧贴性，其次是跨内皮爬行一步，后续的轮回层。用相衬显微镜，这'粘附级联“的每一步骤，可以可视化并记录随后的离线分析。内皮细胞或白细胞可以预先用抑制剂，以确定特定的分子在此过程中的作用。
Introduction
现在是公认的一般白细胞招聘如下多级级联的附着力1的范例。这涉及白细胞从血管内皮细胞衬里的容器壁流动的血液的采集。最初，白细胞经受这是由选择素受体或免疫球蛋白超家族的成员介导的一个轧制工序。这使得G-蛋白偶联受体（GPCRs）表达于白细胞表面由呈现在内皮糖萼的趋化因子被激活。这导致整确认的改动在白细胞表面的“高亲和力'的状态，并逮捕和牢固粘附于血管内皮细胞。随后是在容器上的白细胞的形态变化和爬行牢固粘连。最后的步骤是轮回穿过内皮细胞单层，其可以通过细胞旁或跨细胞途径发生。
而多级级联的附着力描述s白细胞招聘的身体内的一般机制有器官特异性差异。在肝脏中的大多数白细胞招募发生在相对 于其他器官，其中招募一般发生在毛细血管后微静脉2内肝窦内。肝窦是低剪切环境和白细胞进行坚定的附着力是选择素独立前2简要圈养的一步。这些通道是由肝窦内皮细胞是不连续的，并且包含窗孔，在直径开孔100-200nm的内衬，以及缺乏基底膜3。阐明介导白细胞招聘人力对面肝窦内皮细胞的分子机制，可以识别器官的炎症性肝脏疾病的具体治疗目标。
流动附着力试验正在研究白细胞招聘必不可少的工具。他们允许白细胞recru重建itment在剪应力分析下明确定义的粘附力的存在。最频繁使用的测定是研究白细胞粘附到培养的内皮单层的或纯化的底物。市售的流动室被用于灌注细胞两个平面之间的层流的条件下，然后显现粘合性的动态过程，在显微镜4。前面的组显示出，某些粘合剂的相互作用仅采取下流动的地方，无法在静态测定5,6研究。
我们已经用这种技术来概括肝窦和研究低剪切应力条件下白细胞招聘。初级人类HSEC在microslides和白细胞培养就可以在流量计算，肝窦内重现剪切应力的速度进行灌注在这个单层。的剪切应力是应用于平行或相切的面作为奥普一个应力osed正常应力相垂直。任何沿边界移动的流体将施加在该边界上的剪应力。剪切应力已被证明是淋巴细胞轮回7的基本组成部分。在这些条件下的粘附级联的每个步骤可通过相衬显微镜可观察到。这种方法已允许了重要的见解进入肝脏，包括研究常规粘附分子8，趋化因子和趋化因子受体9-11的作用，和非典型的粘附分子，如血管粘附蛋白-1（VAP-1内白细胞的募集）8,12和共同淋巴管和血管内皮受体-1（叻-1）13。虽然这个实验已经提到在我们几个组的出版物，它描述颇短，我们已经采取了这一机会，提供一步地指导了详细的步骤，以帮助故障诊断和预防技术错误时尝试ing的检测。此外，我们最近改变了microslide室的采购，它允许精确的改建剪切应力。我们相信，这拓宽了检测到其他内皮细胞和免疫细胞的适用性。下面的方法描述了制备和技术，用于执行与人类肝窦内皮细胞和外周血淋巴细胞的流程基于粘附实验。
Protocol
1。 Microslide准备
- 预涂层的六通道microslide与鼠尾I型胶原（RTC，在PBS中稀释1:100给予220微克/毫升的工作稀释度）。这是通过注入30微升稀释的RTC溶液直接进入通道和温育2小时，在37℃，随后洗涤三次，用PBS进行的。
2。在Microslides种子细胞
- 在胰蛋白酶-EDTA离解培养的人肝窦内皮细胞的汇合的T75烧瓶（HSEC）（从肝组织中分离出如先前13描述的），在PBS洗，重悬在完全培养基（人内皮3×10 6个细胞/毫升基础培养基补充了2mM L-谷氨酰胺，100 U / ml的青霉素和100μg/ml的链霉素，10％热灭活的AB人血清，血管内皮细胞生长因子10纳克/毫升和肝细胞生长因子10毫微克/毫升）。注入30微升细胞悬液可怕CTLY到每个信道。
- 离开细胞在37附着1小时，在湿润的培养箱中 °下用幻灯片上的齿条5％CO 2的气氛。后使细胞附着用完全培养基（ 图1）填充在每个信道的两侧的端口。
3。细胞的细胞因子刺激
- 离开细胞培养箱中培养24小时。使用倒置相差显微镜评估细胞的生长。 24小时前粘附实验，通过用由肿瘤坏死因子α和干扰素γ补充的完全培养基，无论是在10纳克/毫升更换生长培养基中刺激的内皮单层细胞因子。
4。外周血淋巴细胞的分离
- 分离自全血的外周血淋巴细胞通过最初纯化单核组分通过密度梯度离心法在适当的细胞分离介质离心25分钟，在800×g的。孵育塑料1小时的细胞，使单核细胞的粘附。
- 下面粘附于塑料吸出淋巴细胞丰富上清。洗淋巴细胞和重悬它们（通常为1×10 6个细胞/流动介质毫升（内皮基础培养基含有0.1％（V / V）牛血清白蛋白（BSA））。
5。或内皮细胞与白细胞抑制剂预处理
- 准备功能阻断性抗体或小分子抑制剂在血管内皮media/0.1％（V / V）牛血清白蛋白的推荐稀释度。替换完全培养基用封闭抗体/抑制剂溶液中选择的信道microslide 30分钟前，流检测。
- 其中，计划趋化因子受体在淋巴细胞上的预处理，重悬含有0.1％（V / V）牛血清白蛋白分离白细胞的RPMI溶液孵育用百日咳毒素的200纳克/毫升到方框趋化因子受体的G蛋白偶联受体活性;交替稀释具体功能阻断性抗体或趋化因子受体的小分子抑制剂的建议稀释。白细胞孵育在37℃30分钟，然后洗净，并悬浮在流体介质。
6。流量分析系统的建立
- Prewarm恒温控制透明室37 °C。该室应该有硅胶管和电子供应电子电磁阀，使细胞和媒体之间切换，几乎没有死体积的插入口。该腔室安装在倒置显微镜，以允许相衬显微镜。 图2演示了流化验室和显微镜和microslide放置在显微镜载物台上。
- 预填充50毫升的玻璃注射器与鲁尔锁定用10ml无菌蒸馏水，并连接至注射器端口25厘米硅胶管的长度。在注射器泵插入。根据改变的注射器泵的提取率该microslide制造商的说明，以维持0.05帕（0.5达因/厘米2， 图3）的剪切应力。
- 举两个5毫升注射器，丢弃柱塞和附加桶用硅胶管电子电磁阀的两个流端口。
- 附上12厘米硅胶管的出流阀。该阀允许一个无细胞洗涤缓冲液（内皮media/0.1％（V / V）牛血清白蛋白）和淋巴细胞悬浮液之间交替。
- 通过将洗涤缓冲液在两个针筒，并确保缓冲区从一个桶通过阀门和入出流量硅胶管流动冲洗电子电磁阀。
- 使用阀门开关交替到另一桶，保证了缓冲器流动，并且所有气泡被从系统中删除。从桶1拆下洗涤缓冲液并更换淋巴细胞悬液图4a。
- 连接硅tubin从经由microslide适配器的注射器泵，以一个选定的microslide信道的一个端口克。然后通过一个microslide适配器从流出阀的硅胶管连接到对面的端口。确保硅管和适配器都充满了洗涤缓冲液之前，连接以防止气泡进入系统（ 图4b）。
- 一旦附着在流动系统中，将microslide在显微镜载物台上，并用夹子或带子连接，以防止移动。在显微镜下用适当的相位设置设置为10X客观在一起。确保内皮细胞单层的可视化，并在重点用目镜。确保图像可以通过其安装到显微镜的图像，从而可以将其传送到显示器和记录一个相机来捕获。
7。流附着力的分析检测技术和录制
- 由开始withdrawa灌注内皮细胞层，2分钟洗涤缓冲液升注射泵，以消除任何碎片或绑定封闭抗体，然后切换阀，允许有5分钟推注的白细胞溶液在0.05帕恒定壁面切应力
- 在白细胞丸的最后2分钟，记录沿microslide的长度10个随机领域。这使得对内皮细胞单层淋巴细胞滚动/圈养的离线分析。移动到下一个之前，记录的每个字段为约10秒，并确保记录被针对流的方向，以避免记录在同一轧制细胞两次连续快速制造。
- 由阀返回到起始位置跟随白细胞丸用5分钟推注的洗涤缓冲液。在此丸剂的最后2分钟，进行第二次记录阶段通过沿microslide的长度选择至少10个随机选择的字段。移动到下一个记录之前，每个字段为约5秒，并确保内皮细胞单层贴壁leucocytes是明确的重点。这使得附着的图案离线分析。
Representative Results
此法有可视化的多步流程的附着力和级联通过比较对照实验结果对那些与分子抑制剂阐明潜在的分子机制的能力。各种血管床可通过将特定的内皮细胞和改变剪切应力条件来概括。
粘附级联的每个步骤可以在离线状态下通过在协议中列出的记录方法进行分析。粘附级联的第一步骤是可被表示为总贴壁细胞的百分比的白细胞的滚动。离线分析允许白细胞丸剂过程中列举的每个记录的字段的贴壁细胞的数量。图像回放允许细胞，贴壁牢固和那些跨内皮经历了滚动运动的比较。滚动运动可以使用该技术进行可视化，每个字段中记录为至少10秒。滚动细胞通过在内皮细胞表面的减少速度识别相比，流动的细胞。这种行为必须证明至少5秒，而没有脱离。肝窦内的粘附级联发生在低剪切环境和体内研究已证实最少的轧制仅简要圈养步骤。我们已经证实，该流量测定反映肝血窦通过证明粘附白细胞少于10％的持续滚动激HSEC在这些测定中的环境。
粘附级联的下一步骤是牢固的粘合。总坚持可从记录的第二阶段的洗涤缓冲液丸（步骤7.3）中进行计算。离线分析允许牢固地粘附细胞的总数量，以在每个字段进行计数（ 图5）。牢固粘附的细胞被定义为细胞，静止或shapechanged缓慢爬行行为。每场的细胞的平均数量可以被计算出来。该图可以被用来在与所述视场的总表面积结合（使用确定的标线或等效物），淋巴细胞（通常为1×10 6个细胞/ ml）的浓度和流速来表达的程度淋巴细胞粘附以贴壁细胞/毫米2/10 6细胞的灌流。
学习粘连的模式涉及的最后两个步骤的附着力级联包括形状变化，爬行和跨内皮迁移的分析。白细胞粘附于HSEC单层的上表面出现相亮，而那些通过单层迁移阶段出现暗（ 图6）。该细胞可以被分类为显示出“静态”粘着（nonmigrated /轮），“形状改变”的形态或为'迁移'和单个类别，然后表示为的百分比胶粘剂总人口。
图1。单层原代人肝窦内皮流室中的细胞。 A）充满了含有内皮细胞的单层介质开始流动粘附实验的融合内皮细胞单层B）相衬图像之前Microslides，内皮细胞应在microslide已预涂播种（人类肝脏内皮细胞，这应该是与鼠尾胶原蛋白I型），它是至关重要的内皮细胞是健康的文化和融合。 点击这里查看大图 。
图2。流量测定室。一种流量测定室的建立在这里可以看到，它包括一个安装在倒置显微镜的透明腔。加热器被放置在所述腔室，并应恒温控制，以保持37℃的温度。应该有可从该腔室中的microslide连接硅胶管到注射器泵，其位于外侧的端口。该microslide直接放置在显微镜舞台上。 点击这里查看大图 。
图3。注射泵 。注射器泵连接通过硅胶管的流室编。该泵被设置为根据所需的检测所需的剪切应力特定的退出率。 点击这里查看大图 。
图4。连接阀流室A）电子电磁阀允许，几乎没有死角。 乙含有两种细胞或媒体2针筒之间切换）一旦阀门被刷新和两桶的设立，从阀门的硅胶管连接到所述流动室。该连接上的硅橡胶管上的流动腔室的端口适配器时，有一个液/液界面是至关重要的。 <A HREF =“http://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg”目标=“_blank”>点击这里查看大图。
图5。测定白细胞总数坚持。在最后两分钟的洗涤缓冲液丸步骤（在协议中所述）的，最少十场随机应记录。这些可以脱线进行分析，并牢固地粘附细胞的总数量可以在每个字段进行计数。白细胞黏附总能控制腔和那些与预处理封闭抗体之间进行比较，在这里我们将展示一个领域的代表从控制幻灯片和预处理细胞间黏附分子-1（ICAM-1）阻断抗体的幻灯片。箭头已经添加到突出粘附白细胞，在代表性从控制幻灯片略去场共有25白细胞认定是和ICAM-1的块滑动共有13白细胞识别是。比例尺= 100微米。 点击这里查看大图 。
图6。也可以使用记录的字段的白细胞粘附于内皮细胞单层用相差显微镜模式分析。离线分析，以研究白细胞粘附的方向和速度。粘附级联的特定步骤可以可视化，并使用相位对比成像定量。相亮细胞是粘附牢固，但不激活可以被称为'轮'的附着力，这是激活细胞D和明亮的阶段可以称为“形状变化”的，哪些是黑暗期的细胞是已经过跨内皮迁移，可以称为“迁移”的细胞。该图像显示粘连每个模式的例子。 点击这里查看大图 。
Discussion
为成功地执行流分析中最关键的步骤是确保内皮细胞的健康和汇合单层准备之前的流动粘附实验。初级内皮细胞可能很难培养，并在培养方法的改变很敏感。但重要的是1）流动室被充分且均匀地涂覆有内皮细胞的单层;为HSEC我们采用鼠尾I型胶原，但是这可能不同于其他内皮种群，2）培养基是适当的细胞类型，为HSEC我们在协议部分描述了我们完全培养基。其他重要的步骤包括设置注射泵以适当的比率来反映生理水平的剪切应力。
在流量测定，有必要防止流电路，它可以破坏内皮细胞单层或由内皮表面剥离的免疫细胞内的气泡。这可以通过连接被阻止suring所有的硅胶管和适配器灌注前连接洗涤缓冲液，所有的气泡被去除，并且在使用前媒体预热。当连接到适配器上的microslide这是很重要的，有连接过程中的液/液界面的端口，如果存在任何空气，那么这将形成系统，该系统将注射器抽出时破坏内皮细胞单层中的空气间隙一步。在注射器针筒的白细胞溶液需要定期搅动以确保该细胞不沉淀，从而保持恒定的细胞密度在整个实验。
在记录步骤，它保证了内皮细胞层的图像被适当地聚焦和清晰，以允许精确的离线分析是很重要的，并且在该流量测定法（后白细胞药团）的第二步骤中有足够的时间在洗涤缓冲液中左录制前阶段重新开始，以确保所有非贴壁白细胞被删除。同样地，必须使用内皮细胞中的适当密度的单层，以防止细胞可以在窄的毛细管流动模式干涉的损失，也可以是硬从相差显微镜下放大粘附白细胞区分。我们已经描述了最佳接种密度对人肝窦内皮细胞，但可能不同内皮种群和物种之间变化。
显著的进步已经取得了在研究招募白细胞在动物模型与活体显微镜。流粘附试验方法的主要优点是，白细胞招募可以在一个二进制系统与原代人内皮细胞进行研究。此外，这些相互作用可以根据剪应力的生理相关水平进行研究。它证实活体研究发现在动物与人类蜂窝系统是重要的，因为有可能是differencES在物种之间内皮属性。一项所述的流量测定的局限性在于，白细胞招募正在研究中的内皮单层的单细胞环境。此外，一旦白细胞已粘附和transmigrated跨内皮它们可能不存在足够数量的被分离并进行下游处理。
尽管有这些限制，一旦流动粘附实验已经掌握了它可以被开发来进行白细胞黏附级联的进一步分析和适应复述一个多细胞环境。单个字段以及使用跟踪软件的延长记录可以用来分析白细胞爬行行为。此外，该流分析完成后microslides可以使用激光扫描共聚焦显微术和免疫荧光标记，研究粘附和轮回中更详细地进行讯问。此外，我们先前开发编着的体外模型，其中流过的白细胞可与肝血管内皮细胞通过肝细胞的存在条件进行交互。此法也可开发研究白细胞亚群：我们集团已与子集，如调节性T细胞，B细胞和肝脏浸润的白细胞进行研究。
这些研究的证据表明，流动粘附实验是一个功能强大的工具来研究一般和器官特异性白细胞招聘人类系统。
Disclosures
作者宣称没有竞争经济利益
Acknowledgments
SS被资助由威康信托中级临床医学研究，顺时针由威康信托计划资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Six channel microslide VI 0.4 flow chamber | Ibidi | 80601 | Other channel size and precoated slides are available depending on assay requirements. |
| Flow adaptors microslide VI 0.4 | Ibidi | 80646 | |
| Flow assay chamber | Solent Scientific | 33-3322 | These chambers are custom made by the company dpending on the model of microscope and accessories. |
| Inverted Microscope IX2 | Olympus, UK | Model IX50 | |
| Harvard Syringe Pump | Harvard Apparatus, UK | 702101 | |
| Electronic solenoid valve | Lee Products Limited, UK | Part Number LFYA1226032H | |
| Silicon Tubing large | Fisher Scientific | FB50855 | 2 mm inner diameter, 4 mm outer diameter |
| Silicone Tubing-small | Fisher Scientific | FB50853 | 1 mm inner diameter, 3 mm outer diameter |
| Harvard Glass Syringe | Harvard Apparatus, UK | 55-0962 | |
| Cell separation medium/Lympholyte | VH Bio | CL-5020 | |
| Rat Tail Collagen | Sigma Aldrich | C3867-1VL |
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