בידוד של תאי גזע סרטני מדגימות אדם סרטן הערמונית

Summary

הבידוד של תאי גזע סרטני (CSCs) ישירות מרקמות אנושיות הוא הנדרש לאפיון הביולוגי שלהם. כתב יד זה מתאר מתודולוגיה לבידודה של CSCs ערמונית מרקמות אנושיות, תוך מתן טיפים על פתרון בעיות בצעדים קשים גם.

Abstract

מודל תאי גזע סרטני (CSC) כבר בקר במידה ניכרת במהלך שני העשורים האחרונים. במהלך תקופה זו CSCs זוהה ובודד ישירות מרקמות אנושיות ומופץ באופן סדרתי בעכברים עם מערכת חיסון חלש, בדרך כלל באמצעות תיוג נוגדן של אוכלוסיות של תאים וחלוקה על ידי cytometry זרימה. עם זאת, המאפיינים הקליניים הייחודיים של סרטן הערמונית באופן משמעותי מוגבלים על המחקר של CSCs ערמונית מדגימות גידול אנושיים טריות. לאחרונה דיווחו על הבידוד של CSCs ערמונית ישירות מרקמות אנושיות מכוח פנוטיפ (HLAI) שלילי כיתת HLA שלהם. תאי סרטן ערמונית נקצרים מן הדגימות כירורגית וניתקו באופן מכאני. השעיה תא שנוצרה ושכותרתו עם נוגדני HLAI וסטרומה מצומדות fluorescently. תת אוכלוסיות של תאי HLAI השליליים סוף סוף מבודדות באמצעות cytometer זרימה. המגבלה העיקרית של פרוטוקול זה היא הטבע בתדירות גבוהה המיקרוסקופי והמולטי שלסרטן ראשוני בדגימות ערמונית. יחד עם זאת, CSCs ערמונית חי המבודד מתאים לאפיון מולקולרי ואימות פונקציונלית על ידי השתלה בעכברים עם מערכת חיסון חלש.

Introduction

ההטרוגניות intratumoral נחשבת לסימן היכר של סרטן ^1. ואכן, מספר מנגנונים של הטרוגניות intratumoral תוארו, כולל מוטציה ואינטראקציות עם microenvironment גנטיים. בנוסף, סוגים מסוימים של סרטן עשויים להכיל היררכיה סלולרית עם subpopulation של תאי גזע סרטני (CSCs) המציג את המאפיינים של יכולת ייזום גידול והתחדשות עצמית במבחני השתלה סידוריים ^2-5. תאר בתחילה בהמטולוגיות ^{6, 7} שד, ומוח ⁸ ממאירות, CSCs נחקר גם בסרטן ערמונית ^9-12, כמו גם סוגי גידולים אחרים ^2-5.

CSCs נחשב בדרך כלל חלק קטן הסלולר בתוך אוכלוסייה הטרוגנית ^2-5. לכן, האפיון הפונקציונלי ומולקולרי של CSCs מותנה ההעשרה שלהם מאוכלוסיות בתפזורת. בהתאם לכך, בשני העשורים האחרונים כמה נפגשוhodologies העשרת CSC כבר המציא אשר בדרך כלל כרוך בהפרדה בין אוכלוסיות שכותרתו על ידי cytometry זרימה. בנוסף, שיקול משמעותי במחקר של CSCs הוא שהארגון ההיררכי של רקמות אנושיות עשוי להיות מופר על ידי מניפולציות ניסוייות כגון passaging הסידורי בעכברים עם מערכת חיסון חלש או תרבות. כתוצאה מכך, הבידוד הישיר של CSCs מרקמות אנושיות התפתחה המתודולוגיה חשובה בתחום CSC.

סרטן הערמונית הוא סיבה מובילה לתחלואה בסרטן והתמותה בארצות הברית וברחבי העולם ^13. לכן, הבידוד והאפיון ביולוגי של CSCs הערמונית הוא עניין משמעותי. CSCs ערמונית בעבר כבר מועשר משורות תאים, xenografts מטופל נגזר, ותרבויות השעיה מטופל נובע מעבר נמוך ^9,10,12,14.

לאחרונה דיווחו על הבידוד של CSCs ערמונית ישירות מים כירורגית אדםamples מכוח פנוטיפ תא שטח HLAI השלילי ^10. כאן אנו מפרטים את הנהלים המיושמים לבידוד של תאים אלה. גידולי ערמונית נקצרים מן הדגימות כירורגית וגרמו להשעיות תא. לאחר מכן תאים הם מוכתמים באמצעות נוגדנים נגד HLAI כמו גם סמני סטרומה וכדאיויות, וCSCs מבודדים על ידי מיון תא הקרינה מופעלת (FACS). CSCs הבודד לאחר מכן ניתן להשתמש עבור מבחני הדורשים תאי קיימא.

Protocol

1. איסוף ועיבוד של רקמה האנושית של סרטן הערמונית מדגימות כירורגית

1. הכן שני 50 מיליליטר צינורות חרוטי קלקר המכילים 15 מיליליטר של Roswell Park Memorial Institute (RPMI) מדיום 1640 תרבות בתוספת 10% בסרום שור העובר (FBS) ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין.
2. אנשי שירות פתולוגיה למסוק דגימות ראשוניות וגרורתי סרטן ערמונית מדגימות כריתת ערמונית וניתוח פליאטיבי, בהתאמה, תחת דירקטוריון סקירה מוסדית אישרו פרוטוקול. ניתן לקבל דגימות גרורתי מניתוחי בלוטות לימפה במהלך ניתוח ראשוני, החוליות במהלך הליכים פליאטיבי כירורגית, כגון לחץ בעמוד השדרה, והריאות במהלך הסרת אבחון של גרורות בודדות, בין יתר.
   1. קציר רקמות עודפות בתפזורת אין צורך לאבחון קליני לתוך צינור חרוטי הקלקר הראשון 50 מ"ל משלב 1.1 ולאחסן מייד ב 4 ° C. Harvesteרקמת ד צריכה למדוד לפחות 4-5 סנטימטר ² באזור ו1-2 סנטימטר עובי.
3. אנשי מעבדה לעבד רקמה בכמות גדולה שהתקבלה מהשירות לפתולוגיה בהכנה לבחינה ודור היסטולוגית של השעיות תא.
   1. עיבוד של רקמות בתפזורת לא יעלה 24 שעות מכריתה כירורגית על מנת להבטיח את כדאיות תא מקסימליים.
   2. עבודה בארון בטיחות ביולוגית עם אזמל ומלקחיים סטריליות, לקחת 2-4 חלקי מ"מ עובי אופקי רקמה מגושים סרטניים מקרוסקופיים. מייד לאחסן את החלקים בצינור חרוטי קלקר השני 50 מיליליטר משלב 1.1.
   3. כאשר גושים מאקרוסקופיים לא דמיינו מדגימות ערמונית, לאסוף קטעים אקראיים 2-4 מ"מ עובי אופקיים רקמה מהאונות האחורית ואזור מעבר.
4. להפריד בין חלק של הרקמה כירורגית באמצעות אזמל ומלקחיים סטריליות ולתקן אותה בפורמלין 10% לפני generation של השעיות תא. ארכיון ולנתח בהיסטולוגיה החומר הזה כדי לאשר את קיומו של רקמת סרטן ערמונית.

2. דור של השעיות תא מסעיפי רקמות

1. עבודה בארון בטיחות ביולוגית סטרילי, להעביר קטע רקמה למנת תרבות מ"מ 60 x 15 מכילה 1 מיליליטר של בופר פוספט 1x סטרילי (PBS).
   1. מכאני triturate המדגם באמצעות אזמל ומלקחיים סטריליות.
   2. לא digestions האנזימטית הם בפרוטוקול זה.
2. מעביר את ההשעיה 1 מיליליטר לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר סטרילי.
   1. הוסף 1 מיליליטר למנת התרבות ולחזור על שלב טחינה דקה עד לקטע הרקמה מנותק לחלוטין, בדרך כלל 3-4x.
   2. חזור על תהליך זה באופן סדרתי עד שכל חלקי הרקמות כבר ניתקו.
3. Resuspend את התוכן של צינור חרוטי קלקר 50 מיליליטר עם pi סרולוגיות 5 מיליליטרpette ומערבולת במהירות המרבית (כ 3,200 סל"ד) דקות 1.
4. סנן את ההשעיה וכתוצאה מכך דרך מסננת תא 35-מיקרומטר ולאסוף לתוך צינור שני סטרילי 50 מיליליטר קלקר חרוטי.
5. לייצר גלולה ידי צנטריפוגה ב450 XG 10 דקות.
6. בטל supernatant, resuspend את הכדור עם 5 מיליליטר של חיץ תמוגה תא דם אדום, ודגירת הפתרון עבור 5 דקות ב RT. הסר את חוצץ תמוגה תא דם האדום על ידי צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 450 XG ב RT.
7. בטל supernatant, resuspend את הכדור ב 1x PBS בתוספת 5% FBS, ולכמת את מספר תאי קיימא (trypan הכחולים שליליים) באמצעות hemocytometer או נגד תא אוטומטי. צור 1x10 ⁶ תאים / מיליליטר השעיה ולאחסן אותו על קרח למשך לא יותר משעה 1.
   1. הכדאיות והתשואה של תאים עשויות להשתנות במידה ניכרת בין דגימות גידול. בהגדרת כריתת הערמונית, כדאיות עשויה לנוע בין 45-70%, ובדיונייש 2-4 מ"מ סעיפי רקמות אופקיים עבים מגולה גידול מאקרוסקופי עשויים להיות צפויים להניב כ 3x10 ⁶ תאי קיימא.

3. מכתים נוגדן של תאים עבור FACS

1. לייבל חמישה 15 מיליליטר צינורות חרוטי קלקר כמוצג להלן. השתמש בתיוג אנטיגן CD45 CD31 ולהוציא hematopoietic ואלמנטי אנדותל, בהתאמה.
   1. ללא רבב
   2. _2a IgG κ-PE + IgG ₁ κ-FITC
   3. HLAI-PE + IgG ₁ κ-FITC
   4. κ-PE _2a IgG + CD31-FITC + CD45-FITC
   5. HLAI-PE + CD45-FITC + CD31-FITC
2. הפץ את ההשעיה תא לכימות מהסעיף הקודם (שלב 2.7) לחמישה צינורות בשלב 3.1. מוסיף את הנוגדנים בדילול של 1:250, ודגירת השעיות תא על קרח למשך 30 דקות.
3. צנטריפוגה התאים ב XG 450 3 דקות ב 4 ° C, וזורקים supernatants. לשטוף את התאים על ידי resuspending כל גלולה עם סטרילי 1x PBS בתוספת 10% FBS ואחריו צנטריפוגה ב450 XG במשך 3 דקות ב 4 ° C.
4. Resuspend התאים בתמיסת 1 מיליליטר של 1x PBS המכילה 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) בריכוז של 10 מיקרוגרם / מיליליטר.
5. סנן את הפתרון הסופי באמצעות 35 כובעי מסננת מיקרומטר ל12 מ"מ x 75 צינורות קלקר מ"מ.

4. בידוד של הערמונית CSCs ידי FACS

1. לנצל cytometer זרימה למיון תא.
2. קבע בקרות פיצוי באמצעות תאים מצינורות # 1, # 2, # 3, ומס '4.
3. צור שערים שלא לכלול פסולת ואשכולות של תאים באמצעות פרמטרים צופה ותופעות פיזור.
4. להקים את שערי FITC ו-PE באמצעות ההשעיות מצינור # 3 וצינור # 4, בהתאמה.
5. תאי שער קיימא (DAPI שלילי) באמצעות כחול ערוץ האוקיינוס ​​השקט.
6. באמצעות צינור # תאים חיוביים ל-CD45 CD31 חיובי ו5 קלפים שנזרקו ולאסוף שני אוכלוסיות HLAI שליליות וHLAI חיוביות לתוך צינורות חרוטי קלקר 15 מיליליטר סטרילי המכילים 2 מיליליטר של RPMI בתוספת 10% FBS.
7. צנטריפוגה מסודרים השעיות תא ב450 XG במשך 5 דקות, ולאחר מכן resuspend את כדורים ב200-500 μl של RPMI בתוספת 10% FBS.
8. לכמת תאי קיימא (trypan הכחולים שליליים) באמצעות hemocytometer או נגד תא אוטומטי.

Representative Results

איור 1. קצירת גידול של סרטן ערמונית אדם וcytometry זרימת עלילה הממחישה אוכלוסיות ספציפיות מסרטן הערמונית אנושית. () גושי גידול נקצרים ליצור השעיה תא. תוכן גידול של מדגם מעובד הוא אישר שימוש Hematoxylin קונבנציונלי ומכתימים Eosin. תאים (B) מכתימים באופן חיובי לDAPI מודרים לבודד רק תאי קיימא. (ג) שער HLAI שלילי נוצר על בסיס תאים מוכתמים עם נוגדני IgG שליטת isotypic ₁ κ-FITC _ו2a IgG κ-PE. אחוז התאים HLAI השליליים וHLAI חיוביים מוצג בשער. אנא לחץ כאןכדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר את בידודו של CSCs מרקמות סרטן ערמונית אנושית טריות. כמה שיקולים חשובים להשפיע על התוצאות המוצלחות של פרוטוקול זה.

ההתאוששות של מספרים גבוהים של תאי סרטן ערמונית קיימא תלויה בהערכה זהירה ברוטו של דגימות כירורגית. מניסיוננו, הבידוד המוצלח של תאי ערמונית סרטניים הוא הטוב ביותר ובטוח כאשר גושים סרטניים מקרוסקופיים הם נצפו ומעובד ^10.

עם זאת, מחלה בימינו העיקרית נובעת מדגימות ערמונית היא לעתים קרובות multifocal ומיקרוסקופי. במקרים אלה, כאשר יש ליידע עיבוד דגימה אפשרי על ידי תוצאות ביופסיה קליניות קודמות על מנת להגדיל את הסיכוי של תאי סרטן ערמונית קציר. מניסיוננו, זה הכרחי עבור אנשי מעבדה מאומנים היטב כדי לבצע את הפרוטוקול בתדירות גבוהה על מנת להבטיח את הבידוד המוצלח של CSCs הערמונית מmultדגימות ערמונית קליניות iple.

בנוסף, מאז שאנחנו מתארים כאן פרוטוקול סלקציה שלילי מעורב ביטוי HLAI פני תא, חשוב להסיר את פוטנציאל זיהום אלמנטי HLAI שליליים מהשעיות תא סרטן הערמונית מעובדות על ידי FACS. בפרט, השימוש במאגר דם אדום תמוגה תא וההשמטה של ​​תאי nonviable ידי מכתים DAPI הם שיקולים משמעותיים. בעוד אמצעים אלה לא יכולים לערוב לכך שתאי הסרטן nonprostate לא לזהם את אוכלוסיית HLAI שלילית, המחקרים להגביל הדילול הקודם שלנו מצביעים על כך שCSCs הערמונית בכל זאת מועשר ביעילות בתא זה ^10.

לבסוף, הבידוד של תאי חיים מאפשר אפיון הפונקציונלי שלהם, למשל היכולת שלהם ליזום יעילות xenografts בעכברי מדוכאי חיסון, בין יתר. מחקרים מולקולריים, כוללים פרופיל ביטוי, גם ברי השגה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI	Gibco Life Technologies	11875-093
Fetal bovine serum	Gibco Life Technologies	10437-028
Penicillin Streptomycin	Gibco Life Technologies	15140-122
PBS	Corning Cell Gro	21-031-CM
60 mm, 15 mm Cell culture dish	Corning	3295
35 µm Cell Strainer	BD Falcon	352340
50 ml conical tube	Crystalgen	23-2263
15 ml conical tube	Crystalgen	23-2265
Red blood cell lysing buffer	Sigma	R7757
HLA class I (W6/32) PE antibody	Abcam	ab43545
CD31 FITC antibody	eBioscience	11-0319-42
CD45 FITC antibody	Abcam	ab27287
IgG2aκ PE antibody	BD Pharminogen	555574
IgG1κ FITC antibody	BD Pharminogen	551954
DAPI	Invitrogen	d3571
12 mm x 75 mm Polystyrene tubes with cell strainer cap	BD Falcon	352235
Vortex Mixer	Crystalgen	CG-BV1000
10% Neutral Buffer Formalin	Fisher	RBBP-0480