Summary
El aislamiento de células madre de cáncer (CSC) directamente a partir de tejidos humanos es necesaria para su caracterización biológica. Este manuscrito describe una metodología para el aislamiento de células madre cancerosas de la próstata de los tejidos humanos, mientras que también proporciona consejos sobre la solución de problemas difíciles pasos.
Abstract
El modelo de célula madre del cáncer (CSC) se ha revisado considerablemente en las últimas dos décadas. Durante este tiempo CSC se han identificado y aislado directamente a partir de tejidos humanos y en serie propagado en ratones inmunodeficientes, típicamente mediante el etiquetado de anticuerpos de las subpoblaciones de células y fraccionamiento por citometría de flujo. Sin embargo, las características clínicas únicas del cáncer de próstata han limitado considerablemente el estudio de las células madre cancerosas de la próstata a partir de muestras de tumores humanos frescos. Recientemente hemos informado el aislamiento de células madre cancerosas de la próstata directamente de tejidos humanos en virtud de su clase fenotipo HLA I (HLAI)-negativo. Las células del cáncer de próstata se cosechan a partir de especímenes quirúrgicos y disocian mecánicamente. Una suspensión de células se genera y se marcó con anticuerpos HLAI y del estroma conjugados con fluorescencia. Las subpoblaciones de células HLAI-negativos se aíslan finalmente utilizando un citómetro de flujo. La principal limitación de este protocolo es la naturaleza frecuentemente microscópica y multifocal decáncer primario en pacientes sometidos a prostatectomía. No obstante, aisladas células madre cancerosas de próstata en directo son adecuados para la caracterización molecular y validación funcional de trasplante en ratones inmunodeficientes.
Introduction
La heterogeneidad intratumoral se considera que es un sello del cáncer 1. De hecho, varios mecanismos de heterogeneidad intratumoral se han descrito, incluyendo mutación genética y las interacciones con el microambiente. Además, algunos tipos de cáncer pueden contener una jerarquía celular con una subpoblación de células madre de cáncer (CSC) que exhibe las propiedades de capacidad iniciadoras del tumor y la auto-renovación en ensayos de trasplante de serie 2-5. Inicialmente descrito en hematológica 6, 7 de mama, cerebro y 8 tumores malignos, células madre cancerosas también se han estudiado en el cáncer de próstata 9-12, así como otros tipos de tumores 2-5.
CSC se consideran generalmente una fracción celular dentro de una población heterogénea 2-5. Por lo tanto, la caracterización funcional y molecular de las células madre cancerosas depende de su enriquecimiento de poblaciones a granel. En consecuencia, durante las últimas dos décadas se reunieron varioshodologies de enriquecimiento CSC se han ideado que típicamente implica la separación de las poblaciones marcadas por citometría de flujo. Además, una consideración importante en el estudio de las células madre cancerosas es que la organización jerárquica de los tejidos humanos puede ser alterada por las manipulaciones experimentales tales como pases seriados en cultivos o inmunodeficientes ratones. Como resultado, el aislamiento directo de células madre cancerosas de los tejidos humanos ha surgido como una metodología importante en el campo de CSC.
El cáncer de próstata es una causa principal de morbilidad y mortalidad en los Estados Unidos y en todo el mundo 13 cáncer. Por lo tanto, el aislamiento y la caracterización biológica de células madre cancerosas de la próstata es de interés significativo. CSC próstata previamente se han enriquecido a partir de líneas celulares, los pacientes derivados xenoinjertos, y los pacientes derivados de cultivos en suspensión de bajo pasaje 9,10,12,14.
Recientemente hemos informado el aislamiento de células madre cancerosas de la próstata directamente de s quirúrgicos humanosejemplos en virtud de su fenotipo de la superficie celular-HLAI negativo 10. A continuación te detallamos los procedimientos aplicados para el aislamiento de estas células. Los tumores de próstata se cosechan a partir de muestras quirúrgicas y se convierten en células en suspensión. Después las células se tiñeron utilizando anticuerpos contra HLAI así como marcadores del estroma y de viabilidad, y células madre cancerosas son aisladas por clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). CSC aisladas se pueden utilizar para los ensayos que requieren células viables.
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Protocol
1. Recolección y Procesamiento de tejido del cáncer de próstata humano de especímenes quirúrgicos
- Preparar dos tubos cónicos de 50 ml de poliestireno que contienen 15 ml de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medio de cultivo suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina / estreptomicina.
- El personal de servicio de Patología cosechan las muestras primarias y metastásicas del cáncer de próstata de la prostatectomía y cirugía paliativa ejemplares, respectivamente, en virtud de una Junta de Revisión Institucional aprobado protocolo. Metastásico muestras se pueden obtener a partir de disecciones de ganglios linfáticos durante la cirugía primaria, las vértebras durante los procedimientos quirúrgicos paliativos, tales como la descompresión de la médula espinal, y los pulmones durante la extracción de diagnóstico de lesiones metastásicas individuales, entre otros.
- Cosecha de tejido grueso exceso no es necesario para el diagnóstico clínico en el primer tubo cónico de poliestireno de 50 ml desde el paso 1.1 y almacenar inmediatamente a 4 ° C. El Harvestetejido d debe medir por lo menos un 4-5 cm 2 de superficie y de 1-2 cm de espesor.
- El personal de laboratorio procesan el tejido a granel obtenido desde el servicio de patología en la preparación para el examen histológico y la generación de suspensiones de células.
- Procesamiento de tejidos a granel no debe exceder de 24 horas de la resección quirúrgica con el fin de garantizar la viabilidad celular máxima.
- Trabajar en un gabinete de bioseguridad con un bisturí y pinzas estériles, tomar 2-4 mm de espesor secciones de tejidos horizontales de nódulos tumorales macroscópicas. Almacene inmediatamente las secciones en el segundo tubo cónico de 50 ml de poliestireno desde el paso 1.1.
- Cuando los nódulos macroscópicos no se visualizan a partir de muestras de prostatectomía, recoger 2-4 mm de espesor secciones de tejidos horizontales aleatorias de los lóbulos posteriores y zona de transición.
- Separar una porción del tejido quirúrgico usando un escalpelo y pinzas estériles, y fijarlo en 10% de formalina antes de génerosción de suspensiones de células. Archivo y analizar esta histológicamente el material para confirmar la presencia de tejido de cáncer de próstata.
2. Generación de suspensiones de células a partir de tejido Secciones
- Trabajando en una cabina de bioseguridad estéril, transferir una sección de tejido a una placa de cultivo de 60 mm x 15 que contiene 1 ml de 1x solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS).
- Mecánicamente se tritura la muestra utilizando un bisturí y pinzas estériles.
- No hay digestiones enzimáticas se encuentran en este protocolo.
- Transferir la suspensión de 1 ml en un tubo cónico de 50 ml estéril.
- Añadir 1 ml de la placa de cultivo y repetir el paso de trituración hasta que la sección de tejido está completamente disociado, generalmente 3-4x.
- Repita este procedimiento en serie hasta que todas las secciones de tejido se han disociado.
- Resuspender el contenido del tubo cónico de poliestireno de 50 ml con un 5 ml de PI serológicaPette y vórtice a velocidad máxima (aproximadamente 3200 rpm) durante 1 min.
- Se filtra la suspensión resultante a través de un filtro de células de 35 micras y recoger en un segundo tubo cónico de poliestireno de 50 ml estéril.
- Generar un sedimento por centrifugación a 450 xg durante 10 min.
- Descartar el sobrenadante, resuspender el precipitado con 5 ml de sangre roja tampón de lisis celular, e incubar la solución durante 5 min a TA. Retire la sangre tampón de lisis de glóbulos rojos por centrifugación durante 5 min a 450 x g a temperatura ambiente.
- Descartar el sobrenadante, resuspender el precipitado en 1x PBS suplementado con 5% de FBS, y cuantificar el número de células viables (azul de tripano negativas) usando un hemocitómetro o un contador de células automatizado. Generar un 1x10 6 células / ml suspensión y almacenarla en hielo durante no más de 1 hora.
- La viabilidad y el rendimiento de las células pueden variar considerablemente entre las muestras de tumor. En el ajuste de la prostatectomía, la viabilidad puede oscilar entre 45-70%, y fiVE 2-4 mm se puede esperar gruesas secciones de tejidos horizontales de un nódulo tumoral macroscópica para producir aproximadamente 3x10 6 células viables.
3. Anticuerpo tinción de las células para FACS
- Etiqueta de cinco tubos de 15 ml cónicos de poliestireno como se muestra a continuación. Utilice CD45 y CD31 etiquetado antígeno para excluir hematopoyéticas y endoteliales elementos, respectivamente.
- Unstained
- IgG 2a κ-PE + IgG 1 κ-FITC
- HLAI-PE + IgG 1 κ-FITC
- Κ-PE de IgG 2a + CD31-FITC + CD45-FITC
- HLAI-PE + CD45-FITC + CD31-FITC
- Distribuir la suspensión celular cuantificada de la sección anterior (paso 2.7) en los cinco tubos en el paso 3.1. Añadir los anticuerpos en una dilución de 1:250, y se incuba las suspensiones de células en hielo durante 30 min.
- Centrifugar las células a 450 xg durante 3 min a 4 ° C, y descartar los sobrenadantes. Lavar las células resuspendiendo cada sedimento con 1x PBS estéril suplementado con FBS al 10% seguido por centrifugación a 450 xg durante 3 min a 4 ° C.
- Resuspender las células en una solución de 1 ml de 1x PBS que contenía 4 ',6-diamino-2-fenilindol (DAPI) a una concentración de 10 mg / ml.
- Filtrar la solución final a través de 35 micras tapas colador en 12 mm x 75 mm tubos de poliestireno.
4. Aislamiento de células madre cancerosas de próstata por FACS
- Utilizar un citómetro de flujo para la clasificación de células.
- Establecer controles de compensación que utilizan células de los tubos # 1, # 2, # 3 y # 4.
- Crear puertas que excluyen los residuos y grupos de células utilizando parámetros hacia adelante y lateral de dispersión.
- Establecer las FITC y PE puertas utilizando las suspensiones de tubo # 3 y el tubo # 4, respectivamente.
- Células viables (Gate-DAPI negativo) con el pacífico azul-Un canal.
- Usando el tubo # células CD31-positivas y CD45-positivas 5 de descarte yrecoger ambas poblaciones HLAI-negativos y HLAI-positivos en tubos cónicos de poliestireno de 15 ml estériles que contienen 2 ml de medio RPMI suplementado con 10% de FBS.
- Centrifugar la suspensión de células ordenados a 450 xg durante 5 min, y luego resuspender los gránulos en 200-500 l de RPMI suplementado con 10% de FBS.
- Cuantificar las células viables (azul de tripano-negativo) utilizando un hemocitómetro o un contador de células automatizado.
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Representative Results
Figura 1. De próstata humano recolección tumor de cáncer y citometría de flujo gráfico que ilustra las poblaciones específicas de un cáncer de próstata humano. (A) nódulos tumorales se cosechan para generar una suspensión de células. Tumor contenido de la muestra procesada se confirmó mediante hematoxilina convencional y tinción eosina. (B) Las células con tinción positiva para DAPI se excluyen de aislar sólo las células viables. (C) La puerta HLAI negativo se crea sobre la base de las células teñidas con el control isotípicos anticuerpos IgG 1 κ-PE-κ FITC e IgG 2a. El porcentaje de células HLAI-negativos y positivos-HLAI se muestran en la puerta. Por favor haga clic aquípara ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este protocolo describe el aislamiento de células madre cancerosas a partir de tejidos de cáncer de próstata humana fresca. Varias consideraciones importantes influyen en el éxito de este protocolo.
La recuperación de un gran número de células de cáncer de próstata viables depende de una evaluación cuidadosa de las muestras brutas quirúrgicas. En nuestra experiencia, el éxito en el aislamiento de células de la próstata tumorigénicos se asegura mejor cuando se observan y se procesan 10 nódulos tumorales macroscópicas.
Sin embargo, hoy en día la enfermedad primaria derivada de las piezas de prostatectomía es con frecuencia multifocal y microscópica. En estos casos, cuando sea posible procesamiento de la muestra debe ser informado por resultados de la biopsia clínicos anteriores con el fin de aumentar la posibilidad de células de cáncer de próstata de cosecha. En nuestra experiencia, es necesario que el personal de laboratorio bien entrenados para llevar a cabo el protocolo de frecuencia con el fin de asegurar el éxito en el aislamiento de células madre cancerosas de la próstata de multmuestras de prostatectomía clínicos IPLE.
Además, ya que describe aquí un protocolo de selección negativa que incluya superficie celular HLAI expresión, es importante para eliminar potencialmente contaminante elementos HLAI-negativos de las suspensiones celulares de cáncer de próstata procesados por FACS. En particular, el uso de sangre tampón de lisis de glóbulos rojos y la omisión de las células no viables mediante tinción con DAPI son consideraciones importantes. Aunque estas medidas pueden no garantizar que las células cancerosas nonprostate no contaminen la población HLAI-negativo, nuestros estudios de dilución limitante anteriores sugieren que las CSC de próstata, sin embargo, se enriquecen de manera eficiente en este compartimiento 10.
Por último, el aislamiento de células vivas permite su caracterización funcional, por ejemplo su capacidad para iniciar eficientemente xenoinjertos en ratones inmunocomprometidos, entre otros. Los estudios moleculares, incluyendo perfiles de expresión, también son alcanzables.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Hariri Familia y la Fundación TJ Martell.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Gibco Life Technologies | 11875-093 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life Technologies | 10437-028 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco Life Technologies | 15140-122 | |
| PBS | Corning Cell Gro | 21-031-CM | |
| 60 mm, 15 mm Cell culture dish | Corning | 3295 | |
| 35 µm Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | |
| 50 ml conical tube | Crystalgen | 23-2263 | |
| 15 ml conical tube | Crystalgen | 23-2265 | |
| Red blood cell lysing buffer | Sigma | R7757 | |
| HLA class I (W6/32) PE antibody | Abcam | ab43545 | |
| CD31 FITC antibody | eBioscience | 11-0319-42 | |
| CD45 FITC antibody | Abcam | ab27287 | |
| IgG2aκ PE antibody | BD Pharminogen | 555574 | |
| IgG1κ FITC antibody | BD Pharminogen | 551954 | |
| DAPI | Invitrogen | d3571 | |
| 12 mm x 75 mm Polystyrene tubes with cell strainer cap | BD Falcon | 352235 | |
| Vortex Mixer | Crystalgen | CG-BV1000 | |
| 10% Neutral Buffer Formalin | Fisher | RBBP-0480 |
References
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