Summary
De isolatie van kankerstamcellen (KSC) rechtstreeks van menselijke weefsels is voorwaarde voor hun biologische karakterisering. Dit manuscript beschrijft een methode voor de isolatie van prostaat CSC van menselijk weefsel, terwijl ook het verstrekken van tips over het oplossen van moeilijke stappen.
Abstract
De kanker stamcellen (CSC) model is aanzienlijk herzien in de afgelopen twee decennia. Gedurende deze tijd CSC geïdentificeerd en rechtstreeks geïsoleerd uit humane weefsels en serieel gepropageerd in immunodeficiënte muizen, meestal via antilichaamidentificatie subpopulaties van cellen en fractionering door flowcytometrie. Echter, de unieke klinische kenmerken van prostaatkanker aanzienlijk de studie van de prostaat CSC uit verse stalen van menselijke tumoren beperkt. We hebben onlangs gemeld de isolatie van prostate CSC rechtstreeks uit humane weefsels door hun HLA klasse I (HLAI)-negatief fenotype. Prostaatkankercellen worden geoogst van chirurgische specimens en mechanisch gescheiden. Een celsuspensie gegenereerd en gelabeld met fluorescent geconjugeerd HLAI en stromale antilichamen. Subpopulaties van HLAI-negatieve cellen eindelijk geïsoleerd met behulp van een flowcytometer. De belangrijkste beperking van dit protocol is het vaak microscopische en multifocale aard vanprimaire kanker in prostatectomie exemplaren. Toch geïsoleerde levende prostaat CSC zijn geschikt voor de moleculaire karakterisatie en functionele validatie door transplantatie in immunodeficiënte muizen.
Introduction
Intratumorale heterogeniteit wordt beschouwd als een merker voor kanker 1 zijn. Inderdaad hebben verscheidene mechanismen van intratumorale heterogeniteit beschreven, waaronder genetische mutatie en interacties met de micro. Bovendien kunnen sommige kankers cellulair hiërarchie bevatten met een subpopulatie van kanker stamcellen (CSC) de eigenschappen van tumor-initiërende capaciteit en zelfvernieuwing seriële transplantatie assays 2-5 vertoont. Aanvankelijk beschreven in hematologische 6, 7 borst en hersenen 8 maligniteiten zijn CSC ook onderzocht bij prostaatkanker 9-12 en andere tumortypes 2-5.
CSC wordt algemeen beschouwd als een cellulaire fractie bij een heterogene populatie 2-5. Daarom is de functionele en moleculaire karakterisering van CSC is afhankelijk van hun verrijking van bulk populaties. Dienovereenkomstig, tijdens de laatste twee decennia verschillende voldaanhodologies CSC verrijking zijn ontwikkeld die gewoonlijk uit de scheiding van gemerkte populaties door flowcytometrie. Daarnaast is een belangrijke overweging in de studie van CSC is dat de hiërarchische organisatie van weefsels kan worden verstoord door experimentele manipulaties zoals seriële passages in kweek of immunodeficiënte muizen. Hierdoor heeft de directe isolatie van CSC uit humane weefsels ontwikkeld tot een belangrijke methode in het veld CSC.
Prostaatkanker is een belangrijke oorzaak van kanker morbiditeit en sterfte in de Verenigde Staten en over de hele wereld 13. Daarom is de isolatie en biologische karakterisering van de prostaat CSC is van significant belang. Prostaat CSC zijn eerder verrijkt uit cellijnen, patiënt afgeleid xenotransplantaten, en de patiënt afgeleid lage passage suspensiekweken 9,10,12,14.
We hebben onlangs meldde de isolatie van prostaat CSC direct uit menselijke chirurgische samples op grond van hun HLAI-negatieve celoppervlak fenotype 10. Hier hebben we detail de voor het isoleren van deze cellen procedures. Prostaattumoren worden geoogst van chirurgische specimens en maakte in cel suspensies. De cellen worden vervolgens gekleurd met antilichamen tegen HLAI en stromale en levensvatbaarheid markers en CSC worden geïsoleerd door fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS). Geïsoleerde CSC kan vervolgens worden gebruikt voor assays die levensvatbare cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Oogsten en verwerken van menselijke prostaatkankerweefsel van Chirurgische Specimens
- Bereid twee 50 ml polystyreen conische buizen met 15 ml van Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 kweekmedium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline / streptomycine.
- Pathologie onderhoudspersoneel oogsten primaire en metastatische prostaatkanker monsters van prostatectomie en palliatieve chirurgie exemplaren, respectievelijk, op grond van een Institutional Review Board goedgekeurde protocol. Metastatische monsters kunnen worden verkregen uit lymfklierdissecties bij de primaire operatie de wervels tijdens palliatieve chirurgische procedures, zoals ruggenmerg decompressie en de longen tijdens diagnostische verwijderen van enige metastatische laesies, onder anderen.
- Oogst overtollige massa weefsel niet noodzakelijk voor klinische diagnostiek in de eerste 50 ml polystyreen conische buis uit stap 1.1 en onmiddellijk bewaren bij 4 ° C. De harvested weefsel moet ten minste een 4-5 cm 2 in het gebied en 1-2 cm dikte te meten.
- Laboratoriumpersoneel verwerken bulk weefsel verkregen van de pathologie dienst ter voorbereiding op histologisch onderzoek en het genereren van cel suspensies.
- Verwerking van bulk weefsels mag niet meer dan 24 uur van chirurgische resectie om maximale levensvatbaarheid van de cellen te garanderen.
- Werken in een bioveiligheid kast met een steriel scalpel en pincet, neem 2-4 mm dik horizontale coupes van macroscopische tumoren. Onmiddellijk slaan de secties in de tweede 50 ml polystyreen conische buis vanaf stap 1.1.
- Bij macroscopische knobbeltjes niet worden gevisualiseerd van prostatectomie monsters, het verzamelen van willekeurige 2-4 mm dik horizontale coupes uit de achterste lobben en overgangszone.
- Scheid een gedeelte van de chirurgische weefsel met een steriele scalpel en pincet en repareren in 10% formaline voorafgaand aan generatie van celsuspensies. Archief analyseren dit materiaal histologisch de aanwezigheid van prostaatkanker weefsel bevestigen.
2. Generatie Cell Schorsingen van Tissue Secties
- Werken in een steriele bioveiligheid kast, breng een weefselsectie van een 60 x 15 mm kweekschaal met 1 ml steriele 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Mechanisch vermaal het monster met behulp van een steriel scalpel en pincet.
- Geen enzymatische ontsluitingen zijn in dit protocol.
- Spoel de suspensie 1 ml in een steriele 50 ml conische buis.
- Voeg 1 ml om de cultuur schotel en herhaal de fijnwrijving stap totdat de sectie weefsel volledig wordt gescheiden, meestal 3-4x.
- Herhaal deze procedure serieel totdat alle coupes zijn losgekoppeld.
- Resuspendeer de inhoud van 50 ml polystyreen conische buis met een 5 ml serologische piPette en vortex op maximale snelheid (ongeveer 3200 rpm) gedurende 1 minuut.
- Filter de resulterende suspensie door een 35-um cel zeef en verzamelen in een tweede steriele 50 ml polystyreen conische buis.
- Genereer een pellet door centrifugeren bij 450 g gedurende 10 minuten.
- Verwijder het supernatant, resuspendeer de pellet met 5 ml rode bloedcel lysisbuffer en incubeer de oplossing gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de rode bloedcel lysisbuffer door centrifugatie gedurende 5 min bij 450 x g bij kamertemperatuur.
- Verwijder het supernatant, resuspendeer de pellet in 1 x PBS aangevuld met 5% FBS en kwantificeren van het aantal levensvatbare (trypan blauw-negatieve) cellen met een hemocytometer of geautomatiseerde celteller. Genereer een 1x10 6 cellen / ml suspensie en op te slaan op ijs niet langer dan 1 uur.
- De levensvatbaarheid en het rendement van de cellen kan sterk tussen tumorspecimens variëren. In de prostatectomie instelling, kan levensvatbaarheid variëren tussen 45-70%, en five 2-4 mm kan worden verwacht dikke horizontale coupes van een macroscopische tumor knobbeltje ongeveer 3x10 6 levensvatbare cellen opleveren.
3. Antilichaam kleuring van cellen voor FACS
- Label vijf 15 ml conische buizen van polystyreen zoals hieronder getoond. Gebruik CD45 en CD31-antigeen etikettering om hematopoietische en endotheelcellen elementen respectievelijk uitsluiten.
- Onbevlekt
- IgG2a κ-PE + IgG 1 κ-FITC
- HLAI-PE + IgG 1 κ-FITC
- IgG2a κ-PE + CD31-FITC + CD45-FITC
- HLAI-PE + CD45-FITC + CD31-FITC
- Verdeel de gekwantificeerde celsuspensie uit de vorige paragraaf (stap 2.7) in de vijf buizen in stap 3.1. Voeg de antilichamen in een verdunning van 1:250, en incubeer de celsuspensies op ijs gedurende 30 minuten.
- Centrifugeer de cellen bij 450 g gedurende 3 min bij 4 ° C en gooi de supernatanten. Was de cellen door resuspenderen elk pellet 1x met steriel PBS gesupplementeerd met 10% FBS, gevolgd door centrifugatie bij 450 xg gedurende 3 min bij 4 ° C.
- Resuspendeer de cellen in een 1 ml oplossing van 1x PBS met 4 ',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) bij een concentratie van 10 ug / ml.
- Filter de uiteindelijke oplossing door 35 micrometer zeef caps in 12 mm x 75 mm polystyreen buizen.
4. Isolatie van Prostaat CSC door FACS
- Gebruik een doorstroomcytometer voor celsortering.
- Temperatuurregelknoppen compensatie cuvetten van buizen # 1, # 2, # 3 en # 4.
- Maak poorten die puin en clusters van cellen uit te sluiten met behulp van forward-en side-scatter parameters.
- Bepaal de FITC en PE-poorten met behulp van de schorsingen van buis # 3 en # 4 buis, respectievelijk.
- Gate levensvatbare (DAPI-negatief) cellen met behulp van de Pacific Blue-A-kanaal.
- Met behulp van buis # 5 discard CD31-positieve en CD45-positieve cellen enverzamelen zowel HLAI-negatieve en HLAI-positieve populatie in steriele 15 ml polystyreen conische buizen met 2 ml RPMI aangevuld met 10% FBS.
- Centrifugeer de gesorteerde celsuspensies bij 450 xg gedurende 5 minuten en vervolgens resuspendeer de pellets in 200-500 ul RPMI gesupplementeerd met 10% FBS.
- Kwantificeren levensvatbare (trypaanblauw-negatief) cellen met behulp van een hemocytometer of geautomatiseerde celgetalmeter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1. Human prostaatkanker tumor oogsten en flowcytometrie grafiek, die illustreert specifieke populaties uit een menselijke prostaatkanker. (A) Tumor knobbeltjes worden geoogst om een celsuspensie te genereren. Tumor inhoud van het verwerkte monster wordt bevestigd middels conventionele hematoxyline en eosine kleuring. (B) cellen die positief kleuren voor DAPI zijn uitgesloten om enige levensvatbare cellen te isoleren. (C) HLAI-negatieve gate gemaakt op basis van cellen gekleurd met controle isotype IgG1 κ-FITC en IgG2a κ-PE-antilichamen. Het percentage HLAI-negatieve en HLAI-positieve cellen worden getoond in de poort. Klik hierom een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft de isolatie van CSC uit verse menselijke prostaatkankercellen weefsels. Een aantal belangrijke overwegingen invloed op de succesvolle afloop van dit protocol.
Het herstel van de hoge aantallen levensvatbare prostaatkankercellen is afhankelijk van een zorgvuldige bruto evaluatie van chirurgische monsters. In onze ervaring, is de succesvolle isolatie van tumorigenic prostaatcellen best gegarandeerd wanneer macroscopische tumoren worden waargenomen en verwerkt 10.
Echter, tegenwoordig primaire ziekte afgeleid na prostatectomie is vaak multifocale en microscopische. In deze gevallen, waar mogelijk monster verwerking moet worden door eerdere klinische biopsieresultaten teneinde de kans op het oogsten prostaatkankercellen verhogen. In onze ervaring is het noodzakelijk om goed opgeleid personeel van het laboratorium aan het protocol regelmatig uit te voeren om de succesvolle isolatie van prostaat CSC verzekeren van multiple klinische prostatectomie monsters.
Bovendien, aangezien beschrijven we hier een negatief selectieprotocol waarbij celoppervlak HLAI expressie, is het belangrijk om mogelijk verwijderen verontreinigende HLAI-negatieve elementen van de prostaatkanker celsuspensies verwerkt door FACS. Met name het gebruik van rode bloedcel lysisbuffer en het weglaten van levensvatbare cellen door DAPI kleuring significant overwegingen. Hoewel deze maatregelen kunnen niet garanderen dat nonprostate kankercellen niet de HLAI-negatieve populatie vervuilen, onze vorige beperkende verdunning studies suggereren dat prostaat CSCs zijn niettemin efficiënt verrijkt in dit compartiment 10.
Tenslotte, de isolatie van levende cellen maakt functionele karakterisatie, bijvoorbeeld hun vermogen om efficiënt te leiden xenotransplantaten in immuungecompromitteerde muizen, onder anderen. Moleculaire studies, waaronder expressie profilering, zijn ook haalbaar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Stichting Hariri Familie en de TJ Martell Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Gibco Life Technologies | 11875-093 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life Technologies | 10437-028 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco Life Technologies | 15140-122 | |
| PBS | Corning Cell Gro | 21-031-CM | |
| 60 mm, 15 mm Cell culture dish | Corning | 3295 | |
| 35 µm Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | |
| 50 ml conical tube | Crystalgen | 23-2263 | |
| 15 ml conical tube | Crystalgen | 23-2265 | |
| Red blood cell lysing buffer | Sigma | R7757 | |
| HLA class I (W6/32) PE antibody | Abcam | ab43545 | |
| CD31 FITC antibody | eBioscience | 11-0319-42 | |
| CD45 FITC antibody | Abcam | ab27287 | |
| IgG2aκ PE antibody | BD Pharminogen | 555574 | |
| IgG1κ FITC antibody | BD Pharminogen | 551954 | |
| DAPI | Invitrogen | d3571 | |
| 12 mm x 75 mm Polystyrene tubes with cell strainer cap | BD Falcon | 352235 | |
| Vortex Mixer | Crystalgen | CG-BV1000 | |
| 10% Neutral Buffer Formalin | Fisher | RBBP-0480 |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Magee, J. A., Piskounova, E., Morrison, S. J. Cancer stem cells: impact, heterogeneity, and uncertainty. Cancer Cell. 21, 283-296 (2012).
- Nguyen, L. V., Vanner, R., Dirks, P., Eaves, C. J. Cancer stem cells: an evolving concept. Nat. Rev. Cancer. 12, 133-143 (2012).
- Valent, P., et al. Cancer stem cell definitions and terminology: the devil is in the details. Nat. Rev. Cancer. 12, 767-775 (2012).
- Visvader, J. E., Lindeman, G. J. Cancer stem cells: current status and evolving complexities. Cell Stem Cell. 10, 717-728 (2012).
- Lapidot, T., et al. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature. 367, 645-648 (1994).
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 3983-3988 (2003).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432, 396-401 (2004).
- Collins, A. T., Berry, P. A., Hyde, C., Stower, M. J., Maitland, N. J. Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells. Cancer Res. 65, 10946-10951 (2005).
- Domingo-Domenech, J., et al. Suppression of acquired docetaxel resistance in prostate cancer through depletion of notch- and hedgehog-dependent tumor-initiating cells. Cancer Cell. 22, 373-388 (2012).
- Patrawala, L., Calhoun-Davis, T., Schneider-Broussard, R., Tang, D. G. Hierarchical organization of prostate cancer cells in xenograft tumors: the CD44+alpha2beta1+ cell population is enriched in tumor-initiating cells. Cancer Res. 67, 6796-6805 (2007).
- Qin, J., et al. The PSA(-/lo) prostate cancer cell population harbors self-renewing long-term tumor-propagating cells that resist castration. Cell Stem Cell. 10, 556-569 (2012).
- Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A. Cancer statistics, 2013. CA Cancer J. Clin. 63, 11-30 (2013).
- Patrawala, L., et al. Highly purified CD44+ prostate cancer cells from xenograft human tumors are enriched in tumorigenic and metastatic progenitor cells. Oncogene. 25, 1696-1708 (2006).
