Summary
सीधे मानव ऊतकों से कैंसर स्टेम कोशिकाओं (सीएससी) के अलगाव के उनके जैविक लक्षण वर्णन के लिए अपेक्षित है. भी मुश्किल कदम समस्या निवारण पर सुझाव प्रदान करते हुए यह पांडुलिपि, मानव ऊतकों से प्रोस्टेट सीएससी के अलगाव के लिए एक कार्यप्रणाली का वर्णन करता है.
Abstract
कैंसर स्टेम सेल (सीएससी) मॉडल काफी पिछले दो दशकों में दोबारा गौर किया गया है. इस समय के दौरान सीएससी की पहचान की और सीधे पृथक मानव ऊतकों से और क्रमानुसार आमतौर पर फ्लो द्वारा कोशिकाओं और विभाजन की subpopulations की एंटीबॉडी लेबलिंग के माध्यम से, immunodeficient चूहों में प्रचारित किया गया है. हालांकि, प्रोस्टेट कैंसर का अनूठा नैदानिक सुविधाओं में काफी ताजा मानव ट्यूमर के नमूनों से प्रोस्टेट सीएससी का अध्ययन सीमित है. हमने हाल ही में उनकी एचएलए वर्ग मैं (HLAI) नकारात्मक phenotype के पुण्य से सीधे मानव ऊतकों से प्रोस्टेट सीएससी के अलगाव की सूचना दी. प्रोस्टेट कैंसर की कोशिकाओं शल्य नमूनों से काटा और यंत्रवत् अलग हैं. एक सेल निलंबन उत्पन्न और fluorescently संयुग्मित HLAI और stromal एंटीबॉडी के साथ लेबल है. HLAI नकारात्मक कोशिकाओं की subpopulations अंत में एक प्रवाह cytometer का उपयोग कर अलग कर रहे हैं. इस प्रोटोकॉल की प्रिंसिपल सीमा के अक्सर सूक्ष्म और Multifocal प्रकृति हैprostatectomy के नमूनों में प्राथमिक कैंसर. बहरहाल, अलग रहते हैं प्रोस्टेट सीएससी immunodeficient चूहों में प्रत्यारोपण द्वारा आणविक लक्षण वर्णन और कार्यात्मक सत्यापन के लिए उपयुक्त हैं.
Introduction
Intratumoral विविधता कैंसर 1 की एक बानगी माना जाता है. दरअसल, intratumoral विविधता के कई तंत्र आनुवंशिक उत्परिवर्तन और microenvironment के साथ बातचीत सहित वर्णित किया गया है. इसके अलावा, कुछ तरह के कैंसर धारावाहिक प्रत्यारोपण assays 2-5 में ट्यूमर की शुरुआत क्षमता और आत्म नवीकरण के गुणों को दर्शाती है कि कैंसर स्टेम कोशिकाओं (सीएससी) के एक subpopulation साथ एक सेलुलर पदानुक्रम हो सकती है. प्रारंभ में हिमेटोलोजिकल 6, स्तन 7, और 8 मस्तिष्क दुर्दमताओं में वर्णित, सीएससी भी प्रोस्टेट कैंसर 9-12 के साथ ही अन्य प्रकार के ट्यूमर 2-5 में अध्ययन किया गया है.
सीएससी आम तौर पर एक विषम जनसंख्या 2-5 भीतर एक सेलुलर अंश माना जाता है. इसलिए, सीएससी के कार्यात्मक और आणविक लक्षण वर्णन थोक आबादी से उनके संवर्धन पर प्रासंगिक है. तदनुसार, पिछले दो दशकों के दौरान कई मिलेसीएससी संवर्धन के hodologies आमतौर पर फ्लो द्वारा लेबल आबादी की जुदाई शामिल है जो तैयार किया गया है. इसके अलावा, सीएससी के अध्ययन में एक महत्वपूर्ण विचार मानव ऊतकों के पदानुक्रम संगठन ऐसी संस्कृति या immunodeficient चूहों में धारावाहिक passaging के रूप में प्रयोगात्मक जोड़तोड़ से बाधित हो सकता है. नतीजतन, मानव ऊतकों से सीएससी के प्रत्यक्ष अलगाव सीएससी क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण पद्धति के रूप में उभरा है.
प्रोस्टेट कैंसर के कैंसर रुग्णता और संयुक्त राज्य अमेरिका में और दुनिया में 13 के आसपास मृत्यु दर का एक प्रमुख कारण है. इसलिए, प्रोस्टेट सीएससी के अलगाव और जैविक लक्षण वर्णन महत्वपूर्ण ब्याज की है. प्रोस्टेट सीएससी पहले सेल लाइनों, रोगी व्युत्पन्न xenografts, और कम बीतने रोगी व्युत्पन्न निलंबन संस्कृतियों 9,10,12,14 से समृद्ध किया गया है.
हमने हाल ही में सीधे मानव शल्य एस से प्रोस्टेट सीएससी के अलगाव की सूचनाउनके HLAI नकारात्मक कोशिका की सतह phenotype 10 से पुण्य amples. यहाँ विस्तार से इन कोशिकाओं के अलगाव के लिए लागू की प्रक्रियाओं हम. प्रोस्टेट ट्यूमर शल्य नमूनों से काटा और सेल निलंबन में बना रहे हैं. कोशिकाओं तो HLAI के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ ही stromal और व्यवहार्यता मार्कर का उपयोग दाग रहे हैं, और सीएससी प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) द्वारा अलग कर रहे हैं. पृथक सीएससी तो व्यवहार्य कोशिकाओं की आवश्यकता होती है assays के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. फसल काटने वाले और सर्जिकल नमूनों से मानव प्रोस्टेट कैंसर के ऊतकों के प्रसंस्करण
- Roswell पार्क मेमोरियल संस्थान (RPMI) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक 1640 संस्कृति के माध्यम से 15 मिलीलीटर युक्त दो 50 एमएल polystyrene शंक्वाकार ट्यूबों तैयार.
- पैथोलॉजी सेवा कर्मियों प्रोटोकॉल को मंजूरी दे दी एक संस्थागत समीक्षा बोर्ड के तहत क्रमश prostatectomy और उपशामक सर्जरी नमूनों से प्राथमिक और metastatic प्रोस्टेट कैंसर के नमूने, फसल. Metastatic नमूने प्राथमिक सर्जरी के दौरान लिम्फ नोड विच्छेदन से प्राप्त किया जा सकता है, दूसरों के बीच में एक metastatic घावों के निदान को हटाने के दौरान उपशामक शल्य ऐसे रीढ़ की हड्डी decompression के रूप में प्रक्रियाओं, और फेफड़ों के दौरान कशेरुकाओं.
- 1.1 कदम से पहले 50 एमएल polystyrene शंक्वाकार ट्यूब में नैदानिक निदान के लिए आवश्यक नहीं अतिरिक्त थोक ऊतक फसल और 4 डिग्री सेल्सियस पर तुरंत स्टोर harvesteडी ऊतक में कम से कम एक क्षेत्र में 4-5 सेमी 2 और मोटाई में 1-2 सेमी उपाय करना चाहिए.
- प्रयोगशाला कर्मियों सेल निलंबन के ऊतकीय परीक्षा और पीढ़ी के लिए तैयारी में विकृति सेवा से प्राप्त थोक ऊतक की प्रक्रिया.
- थोक ऊतकों के प्रसंस्करण अधिक से अधिक सेल व्यवहार्यता की गारंटी के लिए शल्य लकीर से 24 घंटे से अधिक नहीं होना चाहिए.
- एक बाँझ स्केलपेल और संदंश के साथ एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में काम करते हुए, macroscopic ट्यूमर पिंड से 2-4 मिमी मोटी क्षैतिज ऊतक वर्गों ले. इसके तत्काल बाद 1.1 कदम से दूसरा 50 एमएल polystyrene शंक्वाकार ट्यूब में वर्गों की दुकान.
- Macroscopic पिंड prostatectomy के नमूनों से कल्पना की नहीं कर रहे हैं, पीछे पालियों और संक्रमण क्षेत्र से यादृच्छिक 2-4 मिमी मोटी क्षैतिज ऊतक वर्गों इकट्ठा.
- एक बाँझ स्केलपेल और संदंश का उपयोग शल्य ऊतक के एक हिस्से को अलग किया और पिछले पीढ़ी के लिए 10% formalin में तयसेल निलंबन की tion. पुरालेख और प्रोस्टेट कैंसर के ऊतकों की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए इस सामग्री histologically का विश्लेषण.
2. ऊतक वर्गों से सेल निलंबन की पीढ़ी
- एक बाँझ जैव सुरक्षा कैबिनेट में काम करते हुए, बाँझ 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के 1 मिलीलीटर युक्त एक 60 x 15 मिमी संस्कृति डिश के लिए एक ऊतक अनुभाग हस्तांतरण.
- यंत्रवत् एक बाँझ स्केलपेल और संदंश का उपयोग नमूना triturate.
- कोई एंजाइमी digestions इस प्रोटोकॉल में हैं.
- एक बाँझ 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 1 मिलीलीटर निलंबन स्थानांतरण.
- संस्कृति डिश के लिए 1 मिलीलीटर जोड़ें और ऊतक अनुभाग पूरी तरह से आमतौर पर 3-4x, अलग है जब तक विचूर्णन कदम दोहराएँ.
- सभी ऊतक वर्गों अलग कर दिया गया है जब तक क्रमानुसार इस प्रक्रिया को दोहराएँ.
- एक 5 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पीआई के साथ 50 एमएल polystyrene शंक्वाकार ट्यूब की सामग्री Resuspendpette और 1 मिनट के लिए अधिकतम गति (लगभग 3,200 आरपीएम) में भंवर.
- एक 35 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से परिणामस्वरूप निलंबन फिल्टर और एक दूसरे बाँझ 50 मिलीलीटर polystyrene शंक्वाकार ट्यूब में इकट्ठा.
- 10 मिनट के लिए 450 XG पर centrifugation द्वारा एक गोली उत्पन्न करें.
- सतह पर तैरनेवाला त्यागें लाल रक्त कोशिका lysis बफर के 5 एमएल के साथ गोली resuspend, और आरटी पर 5 मिनट के लिए समाधान सेते हैं. आरटी पर 450 XG पर 5 मिनट के लिए centrifugation द्वारा लाल रक्त कोशिका lysis बफर निकालें.
- सतह पर तैरनेवाला त्यागें 5% FBS के साथ पूरक 1x पीबीएस में गोली resuspend, और एक hemocytometer या स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग व्यवहार्य (trypan नीले नकारात्मक) कोशिकाओं की संख्या यों. एक 1x10 6 कोशिकाओं / एमएल निलंबन पैदा करते हैं और यह अब 1 घंटा से अधिक के लिए बर्फ पर दुकान.
- व्यवहार्यता और कोशिकाओं की उपज ट्यूमर नमूनों के बीच काफी भिन्न हो सकते हैं. Prostatectomy स्थापित करने में, व्यवहार्यता 45-70%, और फाई के बीच लेकर कर सकते हैंएक macroscopic ट्यूमर गुत्थी से मोटी क्षैतिज ऊतक वर्गों लगभग 3x10 6 व्यवहार्य कोशिकाओं उपज की संभावना हो सकती 2-4 मिमी लिया.
3. FACS के लिए कक्षों की एंटीबॉडी धुंधला
- नीचे दिखाए गए के रूप में पांच से 15 एमएल polystyrene शंक्वाकार ट्यूब लेबल. क्रमशः, hematopoietic और endothelial तत्वों को बाहर करने के CD45 और CD31 प्रतिजन लेबलिंग का उपयोग करें.
- बेदाग
- आईजीजी 2A κ-पीई + आईजीजी 1 κ-FITC
- HLAI-पीई + आईजीजी 1 κ-FITC
- आईजीजी 2A κ-पीई + CD31-FITC + CD45-FITC
- HLAI-पीई + CD45-FITC + CD31-FITC
- 3.1 कदम में पांच ट्यूबों में पिछले अनुभाग (कदम 2.7) से मात्रा निर्धारित सेल निलंबन बांटो. 1:250 के एक कमजोर पड़ने पर एंटीबॉडी जोड़ें, और 30 मिनट के लिए बर्फ पर सेल निलंबन सेते हैं.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 450 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र, और supernatants त्यागें. बाँझ 1x पीबीएस के साथ प्रत्येक गोली resuspending द्वारा कोशिकाओं को धो 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 450 XG पर centrifugation द्वारा पीछा 10% FBS के साथ पूरक
- 10 माइक्रोग्राम / एमएल के एक एकाग्रता में 4 युक्त 1x पीबीएस के 1 मिलीलीटर समाधान ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) में कोशिकाओं Resuspend.
- 12 मिमी x 75 मिमी polystyrene ट्यूबों में 35 माइक्रोन झरनी टोपी के माध्यम से अंतिम समाधान तक.
4. FACS द्वारा प्रोस्टेट सीएससी के अलगाव
- सेल छँटाई के लिए एक प्रवाह cytometer का उपयोग.
- ट्यूब से # 1, # 2, # 3 कोशिकाओं का उपयोग कर मुआवजा नियंत्रण सेट, और # 4.
- आगे और पक्ष बिखराव मापदंडों का उपयोग मलबा और कोशिकाओं के समूहों को बाहर उस द्वार बनाएँ.
- क्रमशः, ट्यूब # 3 और ट्यूब # 4 से निलंबन का उपयोग FITC और पीई द्वार स्थापित करना.
- प्रशांत नीली एक चैनल का उपयोग गेट व्यवहार्य (DAPI नकारात्मक) कोशिकाओं.
- ट्यूब # 5 त्यागें CD31 पॉजिटिव और CD45 पॉजिटिव कोशिकाओं का प्रयोग औरRPMI के 2 मिलीलीटर 10% FBS के साथ पूरक युक्त बाँझ 15 मिलीलीटर polystyrene शंक्वाकार ट्यूबों में दोनों HLAI नकारात्मक और HLAI पॉजिटिव आबादी इकट्ठा.
- अपकेंद्रित्र 5 मिनट के लिए 450 XG पर सेल निलंबन हल है, और फिर 10% FBS के साथ पूरक RPMI के 200-500 μl में छर्रों resuspend.
- एक hemocytometer या स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग व्यवहार्य (trypan नीले नकारात्मक) कोशिकाओं यों.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
चित्रा 1. मानव प्रोस्टेट कैंसर ट्यूमर कटाई और एक मानव प्रोस्टेट कैंसर से विशिष्ट जनसंख्या illustrating साजिश प्रवाह cytometry. (ए) ट्यूमर पिंड एक सेल निलंबन उत्पन्न करने के लिए काटा जाता है. संसाधित नमूने के ट्यूमर सामग्री पारंपरिक hematoxylin और eosin धुंधला का उपयोग कर पुष्टि की है. DAPI के लिए सकारात्मक धुंधला (बी) कक्ष केवल व्यवहार्य कोशिकाओं को अलग करने के लिए बाहर रखा गया है. (सी) HLAI नकारात्मक गेट नियंत्रण isotypic आईजीजी 1 κ FITC और आईजीजी 2A κ-पीई एंटीबॉडी के साथ दाग कोशिकाओं के आधार पर बनाया गया है. HLAI नकारात्मक और HLAI पॉजिटिव कोशिकाओं का प्रतिशत गेट में दिखाए जाते हैं. यहां क्लिक करेंइस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
इस प्रोटोकॉल ताजा मानव प्रोस्टेट कैंसर ऊतकों से सीएससी के अलगाव का वर्णन करता है. कई महत्वपूर्ण बातों को इस प्रोटोकॉल का सफल परिणाम को प्रभावित.
व्यवहार्य प्रोस्टेट कैंसर कोशिकाओं की उच्च संख्या की वसूली शल्य नमूनों की सावधान सकल मूल्यांकन पर निर्भर है. Macroscopic ट्यूमर पिंड मनाया और 10 संसाधित कर रहे हैं जब हमारे अनुभव में, tumorigenic प्रोस्टेट कोशिकाओं के सफल अलगाव सबसे अच्छा आश्वासन दिया है.
हालांकि, prostatectomy के नमूनों से व्युत्पन्न आजकल प्राथमिक बीमारी अक्सर Multifocal और सूक्ष्म है. इन मामलों में, संभव नमूना प्रसंस्करण कटाई प्रोस्टेट कैंसर कोशिकाओं की संभावना को बढ़ाने के क्रम में पिछले नैदानिक बायोप्सी के परिणाम से सूचित किया जाना चाहिए जब. अच्छी तरह से प्रशिक्षित प्रयोगशाला कर्मियों mult से प्रोस्टेट सीएससी के सफल अलगाव को आश्वस्त करने के क्रम में अक्सर प्रोटोकॉल प्रदर्शन करने के लिए हमारे अनुभव में, यह आवश्यक हैiple नैदानिक prostatectomy के नमूने हैं.
हम यहाँ कोशिका की सतह HLAI अभिव्यक्ति से जुड़े एक नकारात्मक चयन प्रोटोकॉल का वर्णन के बाद से ही, यह FACS द्वारा संसाधित प्रोस्टेट कैंसर सेल निलंबन से HLAI नकारात्मक तत्वों को दूषित संभावित दूर करने के लिए महत्वपूर्ण है. विशेष रूप से, लाल रक्त कोशिका lysis बफर और DAPI धुंधला द्वारा nonviable कोशिकाओं की चूक का उपयोग महत्वपूर्ण विचार कर रहे हैं. इन उपायों nonprostate कैंसर कोशिकाओं HLAI नकारात्मक आबादी को दूषित नहीं है कि गारंटी नहीं हो सकता है, हमारे पिछले सीमित कमजोर पड़ने पढ़ाई प्रोस्टेट सीएससी फिर भी कुशलता से इस डिब्बे 10 में समृद्ध है कि सुझाव देते हैं.
उदाहरण के लिए उनकी क्षमता कुशलतापूर्वक दूसरों के बीच में, immunocompromised चूहों में xenografts आरंभ करने के लिए अंत में, जीवित कोशिकाओं के अलगाव, उनके कार्यात्मक विशेषता सक्षम बनाता है. अभिव्यक्ति की रूपरेखा सहित आण्विक अध्ययन, भी प्राप्त कर रहे हैं.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम हरीरी परिवार फाउंडेशन और टी जे Martell फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Gibco Life Technologies | 11875-093 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life Technologies | 10437-028 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco Life Technologies | 15140-122 | |
| PBS | Corning Cell Gro | 21-031-CM | |
| 60 mm, 15 mm Cell culture dish | Corning | 3295 | |
| 35 µm Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | |
| 50 ml conical tube | Crystalgen | 23-2263 | |
| 15 ml conical tube | Crystalgen | 23-2265 | |
| Red blood cell lysing buffer | Sigma | R7757 | |
| HLA class I (W6/32) PE antibody | Abcam | ab43545 | |
| CD31 FITC antibody | eBioscience | 11-0319-42 | |
| CD45 FITC antibody | Abcam | ab27287 | |
| IgG2aκ PE antibody | BD Pharminogen | 555574 | |
| IgG1κ FITC antibody | BD Pharminogen | 551954 | |
| DAPI | Invitrogen | d3571 | |
| 12 mm x 75 mm Polystyrene tubes with cell strainer cap | BD Falcon | 352235 | |
| Vortex Mixer | Crystalgen | CG-BV1000 | |
| 10% Neutral Buffer Formalin | Fisher | RBBP-0480 |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Magee, J. A., Piskounova, E., Morrison, S. J. Cancer stem cells: impact, heterogeneity, and uncertainty. Cancer Cell. 21, 283-296 (2012).
- Nguyen, L. V., Vanner, R., Dirks, P., Eaves, C. J. Cancer stem cells: an evolving concept. Nat. Rev. Cancer. 12, 133-143 (2012).
- Valent, P., et al. Cancer stem cell definitions and terminology: the devil is in the details. Nat. Rev. Cancer. 12, 767-775 (2012).
- Visvader, J. E., Lindeman, G. J. Cancer stem cells: current status and evolving complexities. Cell Stem Cell. 10, 717-728 (2012).
- Lapidot, T., et al. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature. 367, 645-648 (1994).
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 3983-3988 (2003).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432, 396-401 (2004).
- Collins, A. T., Berry, P. A., Hyde, C., Stower, M. J., Maitland, N. J. Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells. Cancer Res. 65, 10946-10951 (2005).
- Domingo-Domenech, J., et al. Suppression of acquired docetaxel resistance in prostate cancer through depletion of notch- and hedgehog-dependent tumor-initiating cells. Cancer Cell. 22, 373-388 (2012).
- Patrawala, L., Calhoun-Davis, T., Schneider-Broussard, R., Tang, D. G. Hierarchical organization of prostate cancer cells in xenograft tumors: the CD44+alpha2beta1+ cell population is enriched in tumor-initiating cells. Cancer Res. 67, 6796-6805 (2007).
- Qin, J., et al. The PSA(-/lo) prostate cancer cell population harbors self-renewing long-term tumor-propagating cells that resist castration. Cell Stem Cell. 10, 556-569 (2012).
- Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A. Cancer statistics, 2013. CA Cancer J. Clin. 63, 11-30 (2013).
- Patrawala, L., et al. Highly purified CD44+ prostate cancer cells from xenograft human tumors are enriched in tumorigenic and metastatic progenitor cells. Oncogene. 25, 1696-1708 (2006).
