Isolering av cancer stamceller från mänskliga Prostate Cancer Prov

Summary

Isoleringen av cancer stamceller (CSCs) direkt från mänskliga vävnader är nödvändiga för deras biologiska karakterisering. Detta manuskript beskriver en metod för isolering av prostata CSCs från mänskliga vävnader, och samtidigt ge tips om felsökning svåra steg.

Abstract

Cancern stamcell (CSC) modell har avsevärt revisited under de senaste två decennierna. Under denna tid CSCs har identifierats och direkt isolerat från mänskliga vävnader och seriellt förökat i immundefekta möss, vanligtvis genom antikropps märkning av subpopulationer av celler och fraktionering genom flödescytometri. Däremot har de unika kliniska funktionerna i prostatacancer avsevärt begränsade studier av prostata CSCs från färska humana tumörprover. Vi rapporterade nyligen isoleringen av prostata CSCs direkt från humana vävnader på grund av deras HLA klass I (HLAI)-negativ fenotyp. Prostatacancerceller skördas från kirurgiska prover och mekaniskt dissocierade. En cellsuspension genereras och märkta med fluorescerande konjugerade HLAI och stromal antikroppar. Subpopulationer av HLAI negativa celler isolerades slutligen med hjälp av en flödescytometer. Den främsta begränsningen av detta protokoll är det ofta mikroskopiska och multifokal naturprimär cancer i prostatectomy prover. Icke desto mindre, isolerade levande prostata CSCs är lämpliga för molekylär karakterisering och funktionell validering av transplantation i immundefekta möss.

Introduction

Intratumoral heterogenitet anses vara ett kännetecken för cancer ^1. I själva verket har flera mekanismer för intratumoral heterogenitet beskrivits, inklusive genetisk mutation och interaktion med mikromiljö. Dessutom kan vissa cancer innehålla en cellulär struktur med en subpopulation av cancer stamceller (CSCs), som uppvisar egenskaperna hos tumör-initierande kapacitet och självförnyelse i seriell transplantation analyser ^2-5. Inledningsvis beskrivs i hematologiska ^6, bröst ^7, och hjärna ⁸ maligniteter har CSCs också studerats i prostatacancer ^9-12 samt andra tumörtyper ^2-5.

CSCs är allmänt som en cellulär fraktion inom en heterogen population ^2-5. Därför är det funktionella och molekylär karakterisering av CSCs avhängigt deras anrikning från bulk populationer. Således, under de senaste två decennierna flera uppfyllshodologies av CSC anrikning har uppfunnits, som typiskt omfattar separation av märkta populationer med flödescytometri. Dessutom är en viktig fråga i studien av CSCs att den hierarkiska organisationen av mänskliga vävnader kan störas av experimentella manipulationer såsom seriepassage i kultur-eller immundefekta möss. Som en följd av detta har direkt isolering av CSCs från mänskliga vävnader vuxit fram som en viktig metod i CSC området.

Prostatacancer är en ledande orsak till cancer sjuklighet och dödlighet i USA och runt om i världen ^13. Därför är isolering och biologisk karakterisering av prostata CSCs av betydande intresse. Prostata CSCs har tidigare berikats från cellinjer, patient härrör xenografter och låg passage patienten härstammar suspensionskulturer ^9,10,12,14.

Vi rapporterade nyligen isolering av prostata CSCs direkt från humana kirurgiska sempel på grund av deras HLAI negativa cellytan fenotyp ^10. Här är vi i detalj de förfaranden som genomförts för isolering av dessa celler. Prostatatumörer skördas från kirurgiska prover och göras till cellsuspensioner. Celler färgas sedan med användning av antikroppar mot HLAI liksom stromala och genomförbarhet markörer och CSCs isoleras genom fluorescensaktiverad cellsortering (FACS). Isolerat CSCs kan sedan användas för analyser som kräver viabla celler.

Protocol

1. Skörd och bearbetning av Human Prostate Cancer Vävnad från kirurgiska preparat

1. Bered två 50 ml polystyren koniska rör som innehåller 15 ml av Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-odlingsmedium kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin / streptomycin.
2. Patologi servicepersonal skörda primära och metastaserande prostatacancer prover från prostatektomi och palliativ kirurgi exemplar, respektive, enligt en Institutional Review Board godkänt protokoll. Metastatiska prover kan fås från lymfkörtel dissektioner under primär kirurgi, kotorna under palliative kirurgiska procedurer, såsom ryggmärg dekomprimering och lungorna under diagnostisk avlägsnandet av enstaka metastatiska lesioner, bland andra.
   1. Skörda överskotts bulk vävnad som inte behövs för klinisk diagnostik i den första 50-ml polystyren koniskt rör från steg 1,1 och lagra omedelbart vid 4 ° C. Den harvested vävnad bör vara minst en 4-5 cm ² i området och 1-2 cm i tjocklek.
3. Laboratoriepersonal bearbeta bulk vävnad erhålls från patologi tjänst som förberedelse för histologisk undersökning och generering av cellsuspensioner.
   1. Bearbetning av bulk vävnader bör inte överstiga 24 tim från kirurgisk resektion för att garantera maximal cellviabilitet.
   2. Att arbeta i en biosäkerhet skåp med en steril skalpell och pincett, ta 2-4 mm tjocka horisontella sektioner vävnad från makroskopiska tumörnoduli. Omedelbart lagra avsnitt i det andra 50 ml polystyren koniskt rör från steg 1.1.
   3. När makroskopiska knölar inte visualiseras från prostatektomi prover, samla slump 2-4 mm tjocka horisontella sektioner vävnad från de bakre loberna och övergångszon.
4. Separera en del av det kirurgiska vävnad med hjälp av en steril skalpell och pincett och fixera den i 10% formalin innan släktenaning av cellsuspensioner. Arkiv och analysera detta material histologiskt för att bekräfta förekomsten av prostatacancer vävnad.

2. Generering av cellsuspensioner från vävnadssnitt

1. Att arbeta i en steril biosäkerhet skåp, överföra en vävnadssektion till ett 60 x 15 mm odlingsskål innehållande 1 ml sterilt 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
   1. Mekaniskt mal sönder provet med en steril skalpell och pincett.
   2. Inga enzymatiska klyvningar är i detta protokoll.
2. Överför 1 ml suspension i en steril 50 ml koniska rör.
   1. Tillsätt 1 ml till kulturen skålen och upprepa finfördelning steg tills vävnadssnittet är helt dissocierade, vanligen 3-4x.
   2. Upprepa proceduren i serie tills alla vävnadssnitt har tagit avstånd.
3. Omsuspendera innehållet i 50 ml polystyren koniska rör med en 5 ml serologisk piPette och skaka vid maximal hastighet (ca 3200 rpm) i 1 minut.
4. Filtrera den erhållna suspensionen genom en 35-ìm cell sil och samla upp i andra steril 50 ml polystyren koniska rör.
5. Generera en pellet genom centrifugering vid 450 x g under 10 min.
6. Kasta bort supernatanten, resuspendera pelleten med 5 ml av röda blodkroppar lyseringsbuffert och inkubera lösningen under 5 min vid rumstemperatur. Ta bort den röda blodkroppen lysbuffert genom centrifugering under 5 min vid 450 xg vid rumstemperatur.
7. Kasta bort supernatanten, återsuspendera pelleten i 1 x PBS supplementerat med 5% FBS, och kvantifiera antalet viabla (trypanblått-negativa) celler med användning av en hemocytometer eller en automatiserad cellräknare. Generera en 1x10 ⁶ celler / ml suspension och lagra den på is i högst 1 timme.
   1. Den lönsamhet och avkastning av celler kan variera avsevärt mellan tumörprover. I inställningen prostatektomi, kan lönsamheten varierar mellan 45-70%, och five 2-4 mm tjocka horisontella sektioner vävnad från en makroskopisk tumör knöl kan förväntas ge cirka 3x10 ⁶ levande celler.

3. Antikropp färgning av celler för FACS

1. Märk fem 15 ml polystyren koniska rör enligt nedan. Använd CD45 och CD31 antigen märkning för att utesluta hematopoetisk och endothelial element, respektive.
   1. Obehandlat
   2. _IgG2a κ-PE + IgG ₁ κ-FITC
   3. HLAI-PE + IgG ₁ κ-FITC
   4. _IgG2a κ-PE + CD31-FITC + CD45-FITC
   5. HLAI-PE + CD45-FITC + CD31-FITC
2. Fördela den kvantifierade cellsuspension från föregående avsnitt (steg 2,7) i de fem rören i steg 3,1. Lägg till de antikroppar vid en utspädning av 1:250, och inkubera cellsuspensioner på is under 30 min.
3. Centrifugera cellerna vid 450 x g under 3 min vid 4 ° C och kasta bort supernatanten. Tvätta cellerna genom återsuspendering av varje pellet med sterilt 1x PBS supplementerat med 10% FBS, följt av centrifugering vid 450 x g under 3 min vid 4 ° C.
4. Resuspendera cellerna i en 1 ml lösning av 1 x PBS innehållande 4 ',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) vid en koncentration av 10 pg / ml.
5. Filtrera den slutliga lösningen genom 35 ìm sil lock i 12 mm x 75 mm polystyren rör.

4. Isolering av Prostata CSCs genom FACS

1. Utnyttja en flödescytometer för cellsortering.
2. Ställ kompensationskontroller genom att använda celler från rören # 1, # 2, # 3 och # 4.
3. Skapa grindar som utesluter skräp och kluster av celler med hjälp av framåt och sidospridningsparametrar.
4. Upprätta FITC och PE grindar med hjälp av suspensioner från tuben # 3 och rör # 4, respektive.
5. Gate livskraftiga (DAPI-negativa) celler med pacific blue-En kanal.
6. Använda röret # 5 kastas överbord CD31-positiva och CD45-positiva celler ochsamla både HLAI-negativa och HLAI-positiva befolkningar i sterila 15 ml polystyren koniska rör innehållande 2 ml RPMI kompletterat med 10% FBS.
7. Centrifugera den sorterade cellsuspensionerna vid 450 x g under 5 min, och sedan återsuspendera pelleten i 200 till 500 | il av RPMI kompletterat med 10% FBS.
8. Kvantifiera livskraftiga (trypan blue-negativa) celler med hjälp av en hemocytometer eller automatiserad cellräknare.

Representative Results

Figur 1. Human prostatacancer tumör skörd och flödescytometri tomt illustrerar specifika populationer från en mänsklig prostatacancer. (A) tumörnoduli skördas för att generera en cellsuspension. Tumörhalten i det behandlade provet bekräftas med hjälp av konventionella hematoxylin och eosin färgning. (B) Celler som färgar positivt för DAPI exkluderas för att isolera enbart levande celler. (C) HLAI-negativ grind skapas utifrån celler färgade med kontroll isotypiska IgG ₁ κ-FITC och IgG _2a κ-PE-antikroppar. Andelen HLAI negativa och HLAI-positiva celler visas i porten. Klicka härför att se en större version av denna siffra.

Discussion

Detta protokoll beskriver isolering av CSCs från färska human prostatacancer vävnad. Flera viktiga faktorer påverkar det framgångsrika resultatet av detta protokoll.

Återhämtningen av ett högt antal viabla prostatacancerceller är beroende av noggrann grov bedömning av kirurgiska prover. Enligt vår erfarenhet är det framgångsrika isoleringen av tumörframkallande prostataceller bäst garanteras när makroskopiska tumörnoduli observeras och behandlas ^10.

Men är numera primär sjukdom som härrör från prostatektomi prover ofta multifokal och mikroskopisk. I dessa fall, när det är möjligt provbearbetning bör informeras av föregående kliniska biopsiresultat för att öka chansen att skörda prostatacancerceller. Enligt vår erfarenhet är det nödvändigt att väl-utbildad laboratoriepersonal att utföra protokollet ofta för att säkerställa en framgångsrik isolering av prostata CSCs från multiple kliniska prostatektomi prover.

Dessutom, eftersom vi här att beskriva ett negativt urvalsprotokoll involverar cellytan HLAI uttryck, är det viktigt att avlägsna eventuellt kontaminerande HLAI negativa element från prostatacancer cellsuspensioner beredda med FACS. Särskilt användningen av röda blodkroppar lyseringsbuffert och utelämnandet av icke-livsdugliga celler genom DAPI färgning är viktiga överväganden. Även om dessa åtgärder kan inte garantera att nonprostate cancerceller inte förorenar HLAI-negativ befolknings, våra tidigare begränsande utspädning studier tyder på att prostata CSCs ändå effektivt anrikas i detta fack ^10.

Slutligen isolering av levande celler möjliggör deras funktionella karakteriseringen, exempelvis deras förmåga att effektivt initiera xenotransplantat hos immunsupprimerade möss, bland andra. Molekylära studier, inklusive uttrycksprofilering, är också uppnås.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI	Gibco Life Technologies	11875-093
Fetal bovine serum	Gibco Life Technologies	10437-028
Penicillin Streptomycin	Gibco Life Technologies	15140-122
PBS	Corning Cell Gro	21-031-CM
60 mm, 15 mm Cell culture dish	Corning	3295
35 µm Cell Strainer	BD Falcon	352340
50 ml conical tube	Crystalgen	23-2263
15 ml conical tube	Crystalgen	23-2265
Red blood cell lysing buffer	Sigma	R7757
HLA class I (W6/32) PE antibody	Abcam	ab43545
CD31 FITC antibody	eBioscience	11-0319-42
CD45 FITC antibody	Abcam	ab27287
IgG2aκ PE antibody	BD Pharminogen	555574
IgG1κ FITC antibody	BD Pharminogen	551954
DAPI	Invitrogen	d3571
12 mm x 75 mm Polystyrene tubes with cell strainer cap	BD Falcon	352235
Vortex Mixer	Crystalgen	CG-BV1000
10% Neutral Buffer Formalin	Fisher	RBBP-0480