Summary
وترد تفاصيل بروتوكول للفي المختبر وضع العلامات الخلايا الجذعية الجنينية البشرية مع ثاني النانوية توليد التوافقي. وتعرض أيضا منهجيات التحقيق HESC بواسطة المجهر متعدد الفوتون والتمايز بهم في مجموعات القلب.
Abstract
في هذه التجربة تصور، وتقدم تفاصيل البروتوكول في المختبر لوضع العلامات من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (HESC) مع النانوية الجيل الثاني التوافقي (HNPs). هذه الأخيرة هي عائلة جديدة من تحقيقات أدخلت مؤخرا لوصفها العينات البيولوجية للتصوير متعددة الفوتون. HNPs قادرة على مضاعفة وتيرة ضوء الإثارة من خلال عملية البصرية غير الخطية من الجيل الثاني التوافقي مع عدم وجود قيود على الطول الموجي الإثارة.
متعدد الفوتون منهجيات HESC التمايز في مجموعات القلب (كما حافظت الثقافات الهواء السائل على المدى الطويل) استنادا يتم عرض بالتفصيل. على وجه الخصوص، وأظهرت الأدلة على كيفية تعظيم مكثفة الثاني التوافقي (SH) انبعاث HNPs معزولة خلال الرصد 3D من الضرب أنسجة القلب في 3D. هو مفصل أيضا تحليل الصور الناتجة لاسترداد أنماط النزوح 3D.
Introduction
أنظمة غير الخطية المجهري، وذلك بفضل قدرات الكامنة ثلاثة باجتزاء الأبعاد بهم، وقد أدت على نحو متزايد الطلب على صورة مستقرة fluorophores مع عصابات امتصاص ثنائي الفوتون في المستقبل القريب من الأشعة تحت الحمراء. فقط في العامين الماضيين، لاستكمال تطوير العلامات المستندة إلى مضان (الأصباغ، ونقاط الكم، النانوية تحويل متابعة)، وقد تم التصوير منهجية مختلفة الاستفادة من استخدام أسرة رواية الجسيمات النانوية غير الخطية بطبيعتها عن التسميات، أي النانوية التوافقي (HNPs) التي تم تطويرها خصيصا لمتعدد الفوتون المجهري. هذه التسميات، استنادا إلى بلورات noncentrosymmetric غير العضوية، وممارسة النقيض البصرية توليد SH من وتيرة الإثارة: على سبيل المثال من خلال تحويل جزء من الأشعة تحت الحمراء بالقرب من ضوء الإثارة نابض (λ = 800 نانومتر) إلى ضوء أزرق مرئية (λ / 2 = 400 نانومتر) . لقد اختبرت العديد من الكتاب في الماضي القريب مواد مختلفة، بما في ذلك أيودات الحديد الحديد (IO
في هذه التجربة تصور، وتقدم تفاصيل البروتوكول في المختبر لوضع العلامات من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (HESC) مع HNPs unfunctionalized. هو مفصل تركيب وإعداد المعلقات الغروية في منشور السابقة والمراجع فيها 16 ويقع خارج نطاق هذا العمل. يتم عرض منهجيات التحقيق HESC بواسطة المجهر متعدد الفوتون والتمايز بهم في مجموعات القلب (كما حافظت الثقافات الهواء السائل على المدى الطويل). يمكن السماح ESC الإنسان للتمييز ضمن ما يسمى الهيئات مضغي الشكل (EBS) بطريقتين مختلفتين، إما عن طريق تشكيل EB شظايا مستعمرة في تعليق أو، بدلا من ذلك، تجميع الخلايا واحد في EBS باستخدام لوحة Aggrewell القسري، كما هو موضح في الشكل 1A . زراعة ضرب مجموعات من الخلايا القلبية على بولي تترافلوروإيثيلين (السليكوون) مرشحات مسامية القوات المسلحة الكونغوليةilitates على الصيانة على المدى الطويل لمزيد من الدراسات (على سبيل المثال القياسات الكهربية من إمكانات العمل).
مصدر الإثارة من مجهر المسح يجب أن تكون قادرة على تقديم نبضات فائقة القصر (مع مدة نبض أصغر من 300 FSEC في عينة) من أجل الوصول إلى ذروة السلطة اللازمة لأداء التصوير التوافقي الثاني من HNPs. على سبيل المثال، وأكثرها شيوعا FSEC المصدر المستخدمة في التصوير هي الانضباطي تي: ليزر الياقوت. بدلا من ذلك، وأشعة الليزر فائق السرعة أخرى يمكن استخدامها، على سبيل المثال الإربيوم أيون 17، الكروم 18 forsterite أو تي: الياقوت ضخ الأشعة تحت الحمراء مؤشرات التذبذب حدودي البصرية. يمكن تجهيز المجهر مع الهدف يفضل أن يكون مع الفتحة العددية عالية نوعا ما. الأهم من ذلك، قبل القياسات، وفي كل مرة يتم استبدال الهدف، وهي ملزمة للحد من التشتت الحالي في انشاء (العدسات) عن طريق تحسين إعدادات نبضة ليزر قبل الضاغط في العملالطول الموجي للاختيار. هذا الإجراء، المفصل في البروتوكول، ويضمن أن نبضة ليزر هو أقرب ما يكون إلى التحويل مدة محدودة (أي أقصر وقت ممكن) في المستوى البؤري ويزيد من استجابة عينة غير الخطية.
الهدف من تحليل الصور موضح في نهاية هذا البروتوكول هو تحديد وتتبع الحركات في 3D HNPs المرتبطة تقلصات الإيقاعي من الضرب مجموعات القلب. ويتحقق النانوية تتبع في الطائرة صورة ببساطة عن طريق تحديد مواقعهم في إطارات الفيلم المتعاقبة. لاستخراج معلومات عن الحركة المحورية، ومعايرة مسبقة من شدة الاستجابة غير الخطية بوصفها وظيفة من الإزاحة المحورية إلزامي. نلاحظ أن لقياسات طويلة الأمد، عنصر تحكم التداخل النشطة من موقف محوري العينة المطلوبة للحفاظ على صحة منحنى المعايرة بحضور الانجرافات الحرارية و / أو الميكانيكية.
وHNPs تستخدم هنا لتراكوتقوم خلايا البريد الضرب داخل المجاميع على البوتاسيوم نيوبات أكسيد (KNbO 3)، ولكن يتم مراجعة المواد النانوية الأخرى غير الخطية المتاحة في التفاصيل في عمل Staedler وآخرون 16.
الكفاءات البصرية غير الخطية لمعظم المواد النانوية التحقيق حتى الآن قابلة للمقارنة جدا. الخيار لKNbO 3 كان الدافع وراء أساسا من الاستقرار جيدة من الحل الغروية وتوافق مع الحياة جيدة، واختبارها على العديد من خطوط الخلايا البشرية حتى في تركيز عالية نسبيا والأوقات الطويلة المعرض 16.
نظرا لحداثة من المواد متناهية الصغر المستخدمة لهذا العمل، وتظهر الخصائص الرئيسية للHNPs بالمقارنة مع نيون / الانارة علامات الحيوية في فترة قصيرة للرسوم المتحركة الفيديو الأصلي الكمبيوتر أدركت من قبل المؤلفين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. الثقافة وتوسيع ESC الإنسان
- إعداد وسط الانتشار الخلية (وتسمى PM) تحتوي على خروج المغلوب DMEM تستكمل مع 20٪ مصل خروج المغلوب، 1٪ MEM الأحماض الأمينية غير الأساسية، 1٪ الجلوتامين L-200 ملم، 1٪ البنسلين الستربتوميسين، و 3.5 ميكرولتر β-المركابتويثانول.
- ذوبان الجليد ESC الإنسان (HESC) في 8 مل PM المتوسطة وأجهزة الطرد المركزي منهم 5 دقائق في 115 x ج لتجاهل تستكمل DMSO تجميد المتوسطة.
- إضافة 1 مل من PM المتوسطة التي تحتوي على 10 ملي روك المانع لمنع موت الخلايا المبرمج وتحسين بقاء الخلية على ذوبان (24 الحضانة ساعة فقط).
- إضافة عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF) لرئيس الوزراء في التركيز المطلوب (4-10 نانوغرام / مل) لصيانة تعدد القدرات.
- لوحة للHESC على الإنسان المشع القلفة الخلايا المغذية (γHFF) (الشكل 1A)، مطلي سابقا بتركيز 2 × 10 4 خلية / سم 2.
- تغيير المتوسطة اليومية، وعند الضرورة، وإزالة أجزاء من جolonies بدءا التفريق بواسطة الشفط باستخدام ممدود خفض حاد باستور ماصة.
- مرة واحدة في الأسبوع، والمستعمرات مرور إنزيمي:
- إزالة المتوسطة وغسل المستعمرات مع 2 مل PBS.
- إزالة برنامج تلفزيوني واحتضان لهم مع 0.5 مل لكل بئر من الحارة كولاجيناز الرابع في 1 ملغ / مل لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2.
- جمع شظايا مستعمرة في 2 مل PM الجديدة وأجهزة الطرد المركزي في 115 x ج لمدة 3 دقائق.
- بدلا من ذلك، يمكن المستعمرات passaged ميكانيكيا عن طريق كشط:
- إزالة المتوسطة وغسل المستعمرات مع 2 مل PBS.
- تتخلص من المستعمرات باستخدام أداة StemPro EZPassage الأسطوانة مكشطة (الشكل 1B) يدويا.
- جمع شظايا مستعمرة وأجهزة الطرد المركزي ثم لمدة 3 دقائق في 115 x ج لإزالة طاف.
- شظايا وحة على γHFF أو معالجتها للتمايز في الهيئات مضغي الشكل (EBS).
2. التمايز ESC الإنسانبروتوكول
- إعداد المتوسطة التمايز (DM) باستخدام خروج المغلوب DMEM تستكمل مع 2٪ مصل Hyclone، 1.0٪ MEM الأحماض الأمينية غير الأساسية، 1.0٪ الجلوتامين L-200 ملم، 1٪ البنسلين الستربتوميسين، 3.5 ميكرولتر β-المركابتويثانول.
- إزالة المتوسطة وغسل المستعمرات مع 2 مل PBS.
- تشكيل EB شظايا مستعمرة في التعليق:
- إزالة برنامج تلفزيوني واحتضان لهم مع 0.5 مل لكل بئر من الحارة كولاجيناز الرابع في 1 ملغ / مل لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2.
- جمع شظايا مستعمرة في 2 مل DM جديدة وأجهزة الطرد المركزي في 115 x ج لمدة 3 دقائق.
- ثقافة لهم في تعليق في منخفضة للغاية مرفق 6 لوحات جيدة (2 مل لكل بئر) لمدة 4 أيام (الشكل 1C).
- وجمع لوحة للEBS شكلت حديثا على 0.1٪ المغلفة الجيلاتين 24 لوحات جيدة (حوالي 3 EBS / جيد) (الشكل 1D).
- بدلا من ذلك، اضطر تجميع الخلايا واحد في EBS باستخدام لوحة Aggrewell:
- إزالة برنامج تلفزيوني وفصل المستعمرات في الخلايا واحدة باستخدام accutase (0.5 مل / جيد).
- خلايا الطرد المركزي و resuspend في DM عند 1.2 × 10 6 / مل.
- إضافة 2 مل لكل غرفة Aggrewell لمدة 1 يوم (الشكل 1B).
- جمع EBS شكلت حديثا (الشكل 1C ') وطبق لهم على 0.1٪ المغلفة الجيلاتين 24 لوحات جيدة (حوالي 3 EBS / جيد).
- تغيير DM كل 2-3 أيام حتى ظهور مجموعات من الضرب العضلية (15-30 يوما).
3. الثقافات 3D الهواء السائل من ضرب الكتل وصفها مع HNPs
- تحديد وتشريح يدويا مجموعات من الضرب العضلية (الشكل 1D)، والتي تظهر عادة بعد 2-4 أسابيع من الثقافة، وذلك باستخدام ممدود خفض حاد باستور ماصة.
- إيداع 4 مرشحات السليكوون في إدراج التي سيتم وضعها على لوحة 6 جيدا (الشكل 1F).
- إضافة 1 مل من DM المتوسطة على رأس مجموعة شرق افريقياح جيدا.
- إضافة واحد تشريح كتلة الضرب على كل مرشح السليكوون (الشكل 1E)، والحد الأقصى 4/well، أي 24 في الركام لوحة (الشكل 1F).
- تغيير DM المتوسطة كل 2-3 أيام.
- لتسمية مجموعات، إزالة عامل التصفية السليكوون تحتوي الكتلة الضرب ووضعها على الزجاج 3.5 سم أسفل الطبق (170 ميكرون سميكة).
- إضافة 1 مل من الشرطة الوطنية الهايتية في تركيز 50 ميكروغرام / مل لمدة 30 دقيقة.
4. التصوير الضوئي غير الخطي
- إعداد العينات. بعد وضع العلامات باور (انظر الخطوة 3.6)، ونقل إما كليا أو تمييز أنواع البسكويت العالي الطاقة أوائل المجموعات الضرب القلب (تشريح عند ظهور انكماش) على مرشحات السليكوون أكثر من 170 ميكرون سميكة صحن الزجاج السفلي متوافق مع مسافة العمل من أهداف عالية الفتحة العددية. بدلا من ذلك، تطبيق الطلاء مباشرة لضرب التكتلات على طبق من الزجاج السفلي قبل المغلفة مع 0.1٪ الجيلاتين.
- عينات نقل إلىالكل في واحد المجهر مجهزة يحتضنها غرفة ضمان درجة حرارة ثابتة والرطوبة وثاني أكسيد الكربون 2 السيطرة على مدى فترات طويلة من الزمن.
- بعد التفتيش الأولي، وصورة العينة عن طريق التصوير حقل واسع تحت الضوء الإضاءة البيضاء لتحديد هياكل المصالح داخل EBS متباينة أو مجموعات الضرب النشطة التي سيتم اختيارها لمزيد من التحقيقات.
- إذا تألق ذاتي الخلية من NADH وSH من HNPs يجب أن يتم الحصول عليها في وقت واحد، ووضع أقصر طول موجي الإثارة ليزر (أي 720 نانومتر) لتتناسب مع امتصاص الجزيئي. استخدام واحد ضيق الفرقة تمرير مرشح الطيفية تركزت في نصف الطول الموجي الإثارة (أي λ = 360 ± 10 نانومتر) لكشف SH، وآخر للكشف عن تألق ذاتي.
- أداء أولا لذلك، دقة منخفضة سريع، ثلاثي الأبعاد مسح لإعادة بناء التشكل العام للكتلة القلب وتحديد الصورة داخل الطائرة حجم الكتلة مع عدة مرئية باورق.
- إذا لزم الأمر، تغيير الطول الموجي الإثارة بحرية لمطابقة أفضل الخصائص البصرية لعينة أو لتجنب photobleaching من وتلف الصورة وصورة أعمق في الأنسجة مع الطول الموجي الأشعة تحت الحمراء (أي 790 نانومتر) واستبدال فلتر التوافقي الثاني وفقا لذلك (أي 395 نانومتر ). تحسين إعدادات نبضة ليزر قبل ضاغط في الطول الموجي العمل من خيار من خلال تعظيم إشارة التوافقي الثاني من HNPs تترسب على العينة.
- رصد في الوقت الحقيقي تقلصات العنقودية القلب، وتعيين المجهر الماسح الضوئي في أسرع وضع مثل وضع الرنانة، مما يتيح الحصول على سرعة عالية من الصور ثنائية الأبعاد.
- اختيار الإعدادات كما أفضل حل وسط بين تباين الصورة وسرعة اكتساب، مثل:
- مسح المتوسط: 4
- بكسل يسكن الوقت: 0.1 μsec
- معدل الصورة: 3.75 قطة في ثانية (الثانية)
- يتم تعديل قوة الليزر وفقا لتنسيق بقعة قإيزي وسرعة المسح الضوئي. 50 ميغاواط (تقاس عند مدخل الهدف) هو القيمة النموذجية ل0.1 μsec بكسل زمن السكون وخطة APO 20X NA 0.75 هدف الحفاظ على بقاء الخلية.
5. تحليل الصور
- إجراء المعايرة المحوري. اختيار واحد باور المودعة على ركيزة العارية. ضبط التركيز (أي الموقف المحوري للجسيمات متناهية الصغر) لتعظيم كثافة SH. تختلف بطريقة تسيطر على الموقف المحوري للمرحلة المجهر للحصول على منحنى المعايرة المتعلقة كثافة SH بوصفها وظيفة من الشرطة الوطنية الهايتية تعويض من المستوى البؤري. وذكرت وإخراج هذا إجراء المعايرة ل0.75 هدف خطة APO 20X NA في الشكل 4C.
- حدد HNPs موجودة في جميع إطارات الفيديو وتحديد الحركات الدورية. هذا الإجراء يمكن أن يكون آليا بسهولة، على سبيل المثال من خلال التعليمات البرمجية المخصصة تسعى للإشارة أقصى البقع كثافة في منطقة محددة من الفائدة وربطها بين مختلف الأطر (رمز المثال مكتوبة في Matlab R2009 ب باستخدام وظيفة "الدعائم المنطقة من أدوات معالجة الصور وعرضها).
- تقييم الكمي للخارج الطائرة التشريد، ويرتبط مع HNPs ارجاعها غير مستمر تتحرك على طول المحور البصري، عن طريق تحويل التحويرات كثافة في جميع أنحاء إطارات مختلفة في الإزاحة المحورية باستخدام منحنى المعايرة الذي أنشئ في الخطوة 5.1. لاحظ أن هذا الإجراء يتيح الوصول إلى الحركات المحورية ولكن لا يمكن أن تستخدم لتحديد اتجاه المطلقة (صعودا أو هبوطا).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
قبل تقييم النشاط الضرب بواسطة التصوير متحد البؤر، تم إجراء توصيف دقيق للاستجابة البصرية غير الخطية من المرشحات السليكوون، إما وحده أو في وجود HNPs في تركيز عال (1 ملغ / مل). تم التأكد من أن: ط) الركيزة العارية اثنين من الفوتون مضان متحمس ضعيف جدا، ولا يمكن منع قياس العينات البيولوجية ذات الصلة، والثاني) انبعاث SH من HNPs معزولة يمكن الحصول عليها بسهولة عن طريق التصوير من خلال الركيزة في وضع برنامج التحصين الموسع للكشف عن (الشكل 2). كان الهدف أن يكون الضوابط المرجعية لتقدير حجم النزوح 3D.
في الشكل 3، يتم عرض الهياكل وEBS القلب باور المسمى. الأحمر (الشكل 3A)، والأصفر (أرقام 3B و 3C) والأخضر (الشكل 3D) ألوان تتوافق مع NADH تألق ذاتي، في حين وقف مكثفة البقع الزرقاء SH من الشرطة الوطنية الهايتية المعزولة. فمن المثير للاهتمام أن بوالباحث من التباين البصرية جيدة جدا يمكن تحقيقه من خلال هذه التقنية، ووضع العلامات متفرق نسبيا بالمقارنة مع الأساليب القائمة على جزيئات أخرى، مثل نقاط الكم أو حتى تحويل النانوية. في هذه الدراسة، وجود تسميات معزولة مكثفة للغاية وكان من المفيد لتتبع عدة حركات الجسيمات الفردية المستقلة وإعادة بناء حركة جماعية من الهياكل المشتقة من الخلايا الجذعية.
ويوضح الشكل 3B وجهة نظر شريحة من كتلة القلب النابض باور المسمى. ويمكن بعد ذلك يتم تسجيل مثل هذه الهياكل 3D بسرعة عالية لرصد نمط انكماش في مجموعها الخلية الشرطة الوطنية الهايتية كما ورد في الفيلم 1. في هذه الحالة، للحفاظ على ارتفاع معدل سرعة اكتساب لحل الحركة NP، بلغت حساسية اكتساب عموما ليست كافية لتسجيل تألق ذاتي الخلية جنبا إلى جنب مع الانبعاثات SH من HNPs.
تطبيق تحليل الصور وصفها في المادة 5 من بروتوعمود تطبيقها على مجموعة متكاملة من الأطر الفيلم تمكن من استخراج المعلومات حول الحركة الفردية باور (اتجاه والتشريد في الطائرة وخارج الطائرة، وتردد). نتيجة هذا التحليل (الشكل 4) يشير إلى أنه ضمن نفس الكتلة القلب، وتردد هو ثابت لفي الحركة والخروج من الطائرة (انظر تحويل فورييه في الشكل 4B) والتشريد هي من أجل بضعة ميكرومتر (أطوال الأسهم تشير إلى نزوح المثالية من خمسة مصادر القدرة النووية في الشكل 4A تتوافق مع استطالة القصوى من التذبذبات).
الشكل 1. HESC تمايز في مجموعات الضرب القلب ووضع العلامات مع النانوية HNPs لثانية والتصوير المجهري التوافقي. Undifferentiateكانت المستعمرات د HESC (A) إما 1) خفض إلى قطع أصغر باستخدام أداة StemPro EZPassage (B) والسماح في تعليق لتشكيل EBS غير النظامية (C)، أو 2) فصل في الخلايا واحد وreclustered باستخدام نظام Aggrewell (B ') لتشكيل EBS العادية (C'). وكلا النوعين من EBS (C أو C ') تربيتها لمدة 2 أيام في تعليق ثم انضمت إلى أطباق الجيلاتين المغلفة. ضرب مجموعات من العضلية (D) ثم تم تشريح يدويا باستخدام مشرط ومثقف على مرشحات السليكوون (E) تترسب على إدراج للسماح الثقافات الهواء السائل 3D (F و F ') (الحانات نطاق لوحات A، B، B'. ، C و C ': 100 ميكرون، لوحات D و E: 250 ميكرون) الرجاء الضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
توصيف بصري الشكل 2. الركيزة السليكوون. (A) صورة حقل مشرق للمرشح السليكوون وحدها. (ب) صورة ثنائي الفوتون للمرشح السليكوون، الذي يعرض مضان ضعيفة بالمقارنة مع كثافة الليزر عالية بدلا بطلب للحصول على هذا القياس التحكم (13 ميغاواط). (C و D) بعد إضافة إلى الركيزة العارية قطرة المياه التي تحتوي على تركيز HNPs في 1 ملغ / مل، الانبعاثات SH بهم يمكن الحصول عليها بسهولة من خلال تصفية منخفضة نسبيا في كثافة الليزر (2 ميغاواط). في D، يتم عرض صورة 3D من الجسيمات النانوية تنتشر على التصفية. (الحانات النطاق: 50 ميكرون).
_upload/51333/51333fig3highres.jpg "سرك =" / files/ftp_upload/51333/51333fig3.jpg "/>
الشكل 3. التصوير Multiphoton الشرطة الوطنية الهايتية وصفت هياكل القلب وEBS. (A) يتم عرض إشارة مضان اثنين من الفوتون كتلة الضرب في الحمراء ويظهر إشارة SH من HNPs باللون الأزرق. ألوان تتوافق مع كثافة يقاس photomultipliers nondescanned أربعة مجهزة مرشحات مختلفة الطيفية. (الأزرق 395 ± 11 نانومتر والأخضر 485 ± 20 نانومتر، الأصفر 531 ± 40 نانومتر، والأحمر 607 ± 70 نانومتر). تم تصوير هذه المجموعة مباشرة من خلال تصفية مسامية السليكوون مع الهدف 10X مع الطول الموجي من 720 نانومتر الإثارة وقوة يعني من 8.8 ميغاواط. (ب) وجهة نظر شريحة من الشرطة الوطنية الهايتية وصفت هيكل القلب المستخرجة من ض المكدس. (ج) EB تصويرها من خلال السليكوون (الحانات النطاق لA، B و C: 100 ميكرون). (D) صورة 3D لEB المسمى مع HNPs، أعيد بناؤها من ض بالاشعة باستخدام apochRomatic لل40X NA 1.25 هدف الغمر بالماء (شريط النطاق: 50 ميكرون). تنتشر HNPs جيدا في جميع أنحاء EB كله والكتلة القلب، والسماح للتحليل الحركة.
الشكل 4 (أ) الإطار فرد الفيلم من الكتلة الضرب وتحليل اتجاهي للفي الطائرة HNPs التشريد (إشارة SH هو مبين في السوداء). أطوال الأسهم تتوافق مع استطالة القصوى من التذبذبات. (ب) تحويل فورييه من التذبذبات تبين أن مصادر الطاقة النووية ضمن نفس الكتلة القلب، وتردد هو ثابت لفي (الخط الأسود) والخروج من الطائرة الحركة (خط منقط برتقالي) ويتوافق مع 0.4 هرتز. (C) منحنى المعايرة تستخدم لتحويل باور كثافة في الإزاحة المحورية (انظر القسم 5 من البروتوكول الاضافيocol). الدوائر: datapoints التجريبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تطبيق تكنولوجيا النانو لأبحاث الخلايا الجذعية هو حقل جديد نسبيا ولكن التوسع السريع. كما أشار إلى ذلك العديد من المقالات مراجعه عن هذا الموضوع، واستخدام الجسيمات النانوية يمكن تطبيقها على إنجاز المهام البحثية المختلفة، بدءا من خلية تتبع (سواء في التجارب المختبرية والحية)، إلى التسليم داخل الخلايا من البروتينات والجينات، وخلق ليس أقلها البيئات الخلوية بيوميمتيك لالتفضيلية التحفيز / تثبيط تمايز مسارات محددة 19،20. النهج الموصوفة في هذا البروتوكول يقتصر على تتبع بصري و، على الرغم من إمكانية استخدام الأشعة تحت الحمراء الإثارة يؤدي إلى زيادة عمق الاختراق فيما يتعلق مضان التقنيات التي تعتمد؛ لا يمكن تمديد التصوير الضوئي لكامل الجسم، وبالتالي يجب أن تستكمل الكشف المغناطيسي 21. وأظهرت أعمال نشرت السابق عدة طرق لتقييم هيكل وحركة مجموعات الخلايا القلبية، فيوضع العلامات بغرض اختتامها بواسطة الأصباغ الفلورية 22، 23،24 نقاط الكم، وأكسيد الحديد فائقة ممغطس النانوية 25، ويصل التحويل جزيئات الفلورسنت 26-28. وترتبط مزايا HNPs فيما يتعلق بهذه nanoprobes مع غياب التبييض على مدى فترات طويلة من الزمن، وزيادة انتشار التصوير، والطول الموجي tunability لزيادة التباين فيما يتعلق تألق ذاتي. وسم الخلية متفرق غريبة (أي في الشكل 3D نعول حوالي 160 مصادر الطاقة النووية في 100 ميكرون الجانب مكعب) التي يتم الحصول عليها عن طريق هذا النهج تبين أن تكون مناسبة بشكل جيد للغاية لتعقب خلية تقلصات في مجموعات القلب 3D الإنسان ESC مشتقة في مكانية عالية القرار.
اختيار المواد متناهية الصغر لا يقتصر على PEG المغلفة KNbO 3، ولكن يمكن أن تشمل عائلة غنية من الجسيمات النانوية عرض هياكل الكريستال noncentrosymmetric، والتي ربما يمكن إدراج functionaliti أخرىوفاق (المغناطيسي، المشعة) السماح الكشف المتعدد الوسائط. علاوة على ذلك، يمكن زيادة هذه HNPs بين functionalized PEG المغلفة لتكون موجهة تحديدا ضد الحواتم أو البروتينات ملزمة من أجل استهداف انتقائي مجموعات سكانية فرعية معينة من الخلايا. من ناحية أخرى، فإن النهج التصوير المقترح هنا يتطلب مجهر المسح مجهزة مصدر الليزر فائق السرعة. وحتى متابعة الطبيعية التي يمكن تصور من هذا العمل هو رصد دمج الخلايا المسمى في 3D الحيوية وهياكل السقالات في المختبر، والى مزيد من أنسجة الأم، لمتابعة التأسيس وظيفة الخلايا التي تم زرعها على مدى فترات طويلة.
ميزة استخدام مرشحات السليكوون تحمل المجاميع 3D، كما في حالتنا، هو إمكانية لإجراء قياسات متعددة على مدى أيام وأسابيع، ويمكن استعادة المرشحات مرة أخرى على إدراج بهم يدعم دون مخاطر التلوث. الأهم من ذلك، أيضا تمكين المرشحات السليكوون تقييم المتكررة من وعاء العملentials باستخدام صفائف متعددة القطب.
عتبات تلف الخلايا لإثارة متعدد الفوتون في المستقبل القريب من الأشعة تحت الحمراء تم تحديد سابقا إلى أقل من 1 TW / سم 2 بواسطة كونيغ وآخرون 29. في دراستنا، وذلك باستخدام الهدف 0.75 NA 20X، تظل كثافة المطبقة في إطار TW / سم 2 (0.26 TW / سم 2) وعلى المدى القصير بكسل مدة بقاء (0.1 μsec) بالمقارنة مع العمل كونيغ (80 μsec) يضمن إمكانية للحفاظ على عينة حية والتفريق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
والكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أنوه تمويل جزئي من FP7 مشروع بحث مشروع INTERREG الرابع فرانس سويسرا NAOMI NAMDIATREAM الأوروبية (NMP4-LA-2010-246479، http://www.namdiatream.eu) و.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope Incubator | OKO LAB | UNO package (top stage) | 37 °C, 5% CO2, moisturized |
| Multiphoton microscope | Nikon | AR1-MP | |
| Fast scanning, four nonphotomultiplier descanned detectors | |||
| Filters SHG and autofluorescence | Semrock | FF01-360/12-25 | |
| FF01-395/11-25 | |||
| FF02-485/20-25 | |||
| Microscope objectives | Nikon | ||
| CFI Plan Fluor 10X | NA 0.30, WD 16 mm | ||
| CFI Plan Apo 20X | NA 0.75, WD 1.0 mm, VC | ||
| CFI Apo 40X | NA 1.25, WD 0.18 mm λS, Nano-Crystal Coat | ||
| Rhock inhibitor | Sigma | Y-27632 | |
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829 | |
| Knockout Serum | Invitrogen | 10828 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 1140 | |
| L-glutamine 200 mM | Invitrogen | 25030 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| Roller scraper tool | StemPro EZPassage, Invitrogen | 23181-010 | |
| StemPro Accutase | Gibco | S11105-01 | |
| Aggrewell system | StemCell Technologies | 27845 | |
| Hyclone serum | Thermo Scientific | SH30070.03 | |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| 6-well plates | Falcon | 353046 | |
| 24-well plates | Nunclon | 142475 | |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) filters | Millipore | NA76/25 | |
| Inserts | Millipore | PICM03050 |
References
- Bonacina, L., et al. Polar Fe(IO3)3 nanocrystals as local probes for nonlinear microscopy. Applied Physics B-Lasers and Optics. 87, 399-403 (2007).
- Nakayama, Y., et al. Tunable nanowire nonlinear optical probe. Nature. 447, 1098-1101 (2007).
- Aufray, M., et al. New Synthesis of Nanosized Niobium Oxides and Lithium Niobate Particles and Their Characterization by XPS Analysis. J Nanosci Nanotechno. 9, 4780-4785 (2009).
- Hsieh, C. L., Grange, R., Pu, Y., Psaltis, D. Three-dimensional harmonic holographic microcopy using nanoparticles as probes for cell imaging. Opt Express. 17, 2880-2891 (2009).
- Pantazis, P., Maloney, J., Wu, D., Fraser, S. E. Second harmonic generating (SHG) nanoprobes for in vivo imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 14535-14540 (2010).
- Baumner, R., et al. Evanescent-field-induced second harmonic generation by noncentrosymmetric nanoparticles. Opt Express. 18, 23218-23225 (2010).
- Le Xuan, L., et al. Photostable second-harmonic generation from a single KTiOPO4 nanocrystal for nonlinear microscopy. Small. 4, 1332-1336 (2008).
- Sandeau, N., et al. Defocused imaging of second harmonic generation from a single nanocrystal. Opt Express. 15, 16051-16060 (2007).
- Johnson, J. C., et al. Near-field imaging of nonlinear optical mixing in single zinc oxide nanowires. Nano Lett. 2, 279-283 (2002).
- Kachynski, A. V., Kuzmin, A. N., Nyk, M., Roy, I., Prasad, P. N. Zinc oxide nanocrystals for nonresonant nonlinear optical microscopy in biology and medicine. J Phys Chem C. 112, 10721-10724 (2008).
- Bonacina, L. Nonlinear Nanomedecine: Harmonic Nanoparticles toward Targeted Diagnosis and Therapy. Mol Pharmaceut. 10, 783-792 (2013).
- Dempsey, W. P., Fraser, S. E., Pantazis, P. SHG nanoprobes: advancing harmonic imaging in biology. Bioessays. 34, 351-360 (2012).
- Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nat Biotechnol. 21, 1356-1360 (2003).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. 2-Photon Laser Scanning Fluorescence Microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
- Magouroux, T., et al. High-Speed Tracking of Murine Cardiac Stem Cells by Harmonic Nanodoublers. Small. 8, 2752-2756 (2012).
- Staedler, D., et al. Harmonic Nanocrystals for Biolabeling: A Survey of Optical Properties and Biocompatibility. Acs Nano. 6, 2542-2549 (2012).
- Extermann, J., et al. Nanodoublers as deep imaging markers for multi-photon microscopy. Optics Express. 17, 15342-15349 (2009).
- Chen, I. H., et al. Wavelength dependent damage in biological multi-photon confocal microscopy: A micro-spectroscopic comparison between femtosecond Ti : sapphire and Cr : forsterite laser sources. Opt. Quantum Electron. 34, 1251-1266 (2002).
- Ferreira, L., Karp, J. M., Nobre, L., Langer, R. New opportunities: The use of Nanotechnologies to manipulate and track stem cells. Cell Stem Cell. 3, 136-146 (2008).
- Kaur, S., Singhal, B. When nano meets stem: The impact of nanotechnology in stem cell biology. J Biosci Bioeng. 113, 1-4 (2012).
- Hong, H., Yang, Y. N., Zhang, Y., Cai, W. B. Non-Invasive Imaging of Human Embryonic Stem Cells. Curr Pharm Biotechno. 11, 685-692 (2010).
- Tumbar, T., et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin. Science. 303, 359-363 (2004).
- Shah, B. S., Clark, P. A., Moioli, E. K., Stroscio, M. A., Mao, J. J. Labeling of mesenchymal stem cells by bioconjugated quantum dots. Nano Lett. 7, 3071-3079 (2007).
- Zimmer, J. P., et al. Size series of small indium arsenide-zinc selenide core-shell nanocrystals and their application to in vivo imaging. J Am Chem Soc. 128, 2526-2527 (2006).
- Vallee, J. P., et al. Embryonic stem cell-based cardiopatches improve cardiac function in infarcted rats. Stem Cells Transl Med. 1, 248-260 (2012).
- Idris, N. M., et al. Tracking transplanted cells in live animal using upconversion fluorescent nanoparticles. Biomaterials. 30, 5104-5113 (2009).
- Haase, M., Schafer, H. Upconverting nanoparticles. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 5808-5829 (2011).
- Cheng, L., et al. Multifunctional Upconversion Nanoparticles for Dual-Modal Imaging-Guided Stem Cell Therapy under Remote Magnetic Control. Adv Funct Mater. 23, 272-280 (2013).
- Konig, K., So, P. T. C., Mantulin, W. W., Gratton, E. Cellular response to near-infrared femtosecond laser pulses in two-photon microscopes. Optics Letters. 22, 135-136 (1997).
