Summary
Dettagli del protocollo sono previste per l'etichettatura di cellule staminali embrionali umane in vitro con la seconda nanoparticelle generano armoniche. Metodologie di indagine hESC mediante microscopia multi-fotone e la loro differenziazione in gruppi cardiache sono anche presentati.
Abstract
In questo esperimento visualizzato, dettagli del protocollo sono previste per l'etichettatura in vitro di cellule staminali embrionali umane (hESC) con nanoparticelle di generazione di armoniche secondo (HNPS). Questi ultimi sono una nuova famiglia di sonde recentemente introdotte per l'etichettatura di campioni biologici per l'imaging multi-fotone. HNPS sono in grado di raddoppiare la frequenza della luce di eccitazione dal processo ottica non lineare di generazione di seconda armonica senza alcuna restrizione sulla lunghezza d'onda di eccitazione.
Multi-fotone metodologie per la differenziazione hESC nei cluster cardiaci (mantenuti culture aria-liquido lungo termine) basato sono presentati in dettaglio. In particolare, viene mostrata la prova su come massimizzare l'intenso seconda armonica (SH) emissione di HNPS isolati durante il monitoraggio 3D di battere tessuto cardiaco in 3D. L'analisi delle immagini risultanti per recuperare modelli 3D displacement è anche dettagliata.
Introduction
Sistemi di microscopia non lineari, grazie alle loro intrinseche capacità di sezionamento tre dimensioni, hanno sempre innescato la richiesta di fluorofori foto-stabile con bande di assorbimento a due fotoni nel vicino infrarosso. Solo negli ultimi due anni, per completare lo sviluppo di etichette a base di fluorescenza (coloranti, quantum dots, la conversione di nanoparticelle), una metodologia di imaging diverso ha sfruttato l'uso di una nuova famiglia di nanoparticelle intrinsecamente non lineari come etichette, cioè nanoparticelle armonica (HNPS) che sono stati specificamente sviluppati per microscopia multi-fotone. Queste etichette, basati su cristalli noncentrosymmetric inorganici, esercitano contrasto ottico generando la SH della frequenza di eccitazione: per esempio convertendo una frazione di luce di eccitazione pulsata vicino infrarosso (λ = 800 nm) in luce blu visibile (λ / 2 = 400 nm) . Diversi autori nel recente passato hanno testato diversi materiali, tra cui iodato di ferro Fe (IO
In questo esperimento visualizzato, dettagli del protocollo sono previste per l'etichettatura in vitro di cellule staminali embrionali umane (hESC) con HNPS unfunctionalized. La sintesi e la preparazione di sospensioni colloidali è dettagliato in una precedente pubblicazione e riferimenti ivi 16 ed è oltre la portata di questo lavoro. Metodologie di indagine hESC mediante microscopia multi-fotone e la loro differenziazione in gruppi cardiaci (mantenuti culture aria-liquido lungo termine) sono presentati. ESC umana può essere lasciato per differenziare entro cosiddetti corpi embrionali (EBS) in due modi diversi, sia per la formazione di frammenti EB colonie in sospensione o, in alternativa, l'aggregazione di singole cellule nel EBs utilizzando la piastra Aggrewell forzati, come illustrato nella Figura 1A . Coltura battendo ammassi di cellule cardiache in politetrafluoroetilene (PTFE) filtri porosi facilitates loro mantenimento a lungo termine per ulteriori studi (per esempio misurazioni elettrofisiologiche dei potenziali d'azione).
La sorgente di eccitazione del microscopio a scansione dovrebbe essere in grado di fornire impulsi ultracorti (con durata dell'impulso minore di 300 fsec al campione) per raggiungere la potenza di picco necessaria per effettuare l'imaging seconda armonica di HNPS. Per esempio, il fsec-source più utilizzato per l'imaging sono accordabili Ti: zaffiro laser. In alternativa, altri laser ultraveloci possono essere impiegati, ad esempio, erbio ione 17, cromo forsterite 18 Ti: zaffiro pompato infrarossi oscillatori parametrici ottici. Il microscopio può essere dotata di un obiettivo con preferibilmente una piuttosto alta apertura numerica. Molto importante, prima della misura, e ogni volta che l'obiettivo viene sostituito, è obbligatorio per minimizzare la dispersione presenti nel set-up (lenti) ottimizzando le impostazioni dell'impulso laser pre-compressore al lavorolunghezza d'onda di scelta. Questo procedimento, descritto nel protocollo, assicura che l'impulso laser è il più vicino possibile alla trasformazione durata limitata (cioè più breve possibile) in corrispondenza del piano focale e massimizza la risposta di esempio non lineare.
L'obiettivo dell'analisi dell'immagine descritto alla fine del protocollo è di identificare e tracciare in movimenti 3D HNPS associati alle contrazioni ritmiche di battere cluster cardiaci. Inseguimento nanoparticelle nel piano dell'immagine è semplicemente realizzato identificando le loro posizioni in fotogrammi di film successivi. Per estrarre le informazioni sul movimento assiale, una prima taratura della risposta intensità lineare in funzione dello spostamento assiale è obbligatoria. Si noti che per misurazioni a lungo termine, un controllo interferometrico attivo della posizione assiale campione è necessario per mantenere la validità della curva di calibrazione in presenza di derive termiche e / o meccaniche.
I HNPS utilizzati qui per traccellule e battendo all'interno degli aggregati sono basati su ossido di niobato di potassio (KNbO 3), ma altri nanomateriali lineari disponibili sono esaminati in dettaglio nel lavoro di Staedler et al 16.
Le efficienze ottici non lineari della maggior parte dei nanomateriali esaminati finora sono molto simili. La scelta per KNbO 3 era essenzialmente motivata dalla buona stabilità della soluzione colloidale e la sua buona biocompatibilità, testato su diverse linee cellulari umane anche a concentrazione piuttosto elevata e lunghi tempi di esposizione 16.
Data la novità del nanomateriale impiegato per questo lavoro, le principali caratteristiche del HNPS rispetto a / luminescenti bio-marcatori fluorescenti sono mostrati in una breve animazione computer originale realizzato dagli autori.
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Protocol
1. Cultura e Espansione del CES umano
- Preparare il mezzo di propagazione delle cellule (chiamata PM) contenente Knockout DMEM integrato con il 20% Knockout siero, 1% MEM non-aminoacidi essenziali, 1% di L-glutammina 200 mm, 1% penicillina-streptomicina e 3,5 microlitri β-mercaptoetanolo.
- Scongelare ESC umane (hESC) in 8 ml di PM medio e centrifugare le 5 min a 115 xg per scartare DMSO-integrato medio di congelamento.
- Aggiungere 1 ml di PM mezzo contenente 10 mM roccia inibitore per impedire l'apoptosi e migliorare la sopravvivenza cellulare dopo lo scongelamento (solo 24 ore di incubazione).
- Aggiungere fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF) al PM alla concentrazione desiderata (4-10 ng / ml) per il mantenimento della pluripotenza.
- Piatto il hESC sul umana irradiati prepuzio cellule di alimentazione (γHFF) (Figura 1A), precedentemente placcato ad una concentrazione di 2 x 10 4 cellule / cm 2.
- Cambiare medio giornaliero e, se necessario, rimuovere parti di colonies iniziando a differenziarsi per aspirazione usando una forma allungata taglio deciso pipetta Pasteur.
- Una volta a settimana, colonie passaggio enzimaticamente:
- Rimuovere medie e lavare le colonie con 2 ml di PBS.
- Rimuovere PBS e incubare con 0.5 ml per pozzetto di caldo collagenasi IV a 1 mg / ml per 10 min a 37 ° C, 5% CO 2.
- Raccogliere i frammenti colonia in 2 ml nuovo PM e centrifugare a 115 xg per 3 min.
- In alternativa, le colonie possono essere diversi passaggi meccanicamente mediante raschiatura:
- Rimuovere medie e lavare le colonie con 2 ml di PBS.
- Raschiare manualmente colonie utilizzando lo strumento raschietto rullo StemPro EZPassage (Figura 1B).
- Raccogliere frammenti colonia e poi centrifugare per 3 min a 115 xg per rimuovere il surnatante.
- Frammenti piastra su γHFF o li elaborano per la differenziazione in corpi embrionali (EBS).
2. ESC Differenziazione umanoProtocollo
- Preparare il terreno di differenziamento (DM) utilizzando Knockout DMEM supplementato con siero Hyclone 2%, 1,0% MEM non-aminoacidi essenziali, 1,0% di L-glutammina 200 mm, 1% penicillina-streptomicina, 3,5 microlitri β-mercaptoetanolo.
- Rimuovere medie e lavare le colonie con 2 ml di PBS.
- La formazione EB di frammenti colonia in sospensione:
- Rimuovere PBS e incubare con 0.5 ml per pozzetto di caldo collagenasi IV a 1 mg / ml per 10 min a 37 ° C, 5% CO 2.
- Raccogliere i frammenti colonia in 2 ml nuovo DM e centrifugare a 115 xg per 3 min.
- Li coltura in sospensione in ultra-bassa allegato 6 pozzetti (2 ml per pozzetto) per 4 giorni (Figura 1C).
- Raccogliere e piastra EBS neoformati su 0,1% piastre da 24 pozzetti rivestiti di gelatina (circa 3 EBs / pozzetto) (Figura 1D).
- In alternativa, forzata aggregazione di singole cellule nel EBs usando la piastra Aggrewell:
- Rimuovere PBS edissociare le colonie nelle singole cellule utilizzando accutase (0,5 ml / pozzetto).
- Centrifugare le cellule e risospendere in DM a 1.2 x 10 6 / ml.
- Aggiungere 2 ml per camera Aggrewell per 1 giorno (Figura 1B ').
- Raccogliere EBs neoformati (Figura 1C ') e piatto su 0,1% piastre da 24 pozzetti rivestiti di gelatina (circa 3 EBs / pozzetto).
- Cambiare DM ogni 2-3 giorni fino alla comparsa di battere gruppi di cardiomiociti (15-30 giorni).
3. Culture 3D aria-liquido di battere cluster e di etichettatura con HNPS
- Identificare e analizzare manualmente grappoli di battere cardiomiociti (Fig. 1D), di solito compaiono dopo 2-4 settimane di cultura, con una forma allungata drasticamente tagliato pipetta Pasteur.
- Deposito 4 filtri in PTFE per inserto che verranno messi su una piastra da 6 pozzetti (Figura 1F).
- Aggiungere 1 ml di terreno DM in cima each bene.
- Aggiungi un cluster sezionato batte su ogni filtro PTFE (Figura 1E), massimo 4/well, cioè 24 aggregati per piastra (Figura 1F ').
- Cambiare medio DM ogni 2-3 giorni.
- Per etichettare i cluster, rimuovere il filtro PTFE contenente il cluster pestaggio e metterlo su 3,5 centimetri di vetro piatto fondo (170 micron di spessore).
- Aggiungere 1 ml di HNP ad una concentrazione di 50 ug / ml per 30 min.
4. Imaging ottico non lineare
- Preparazione del campione. Dopo l'etichettatura HNP (vedi punto 3.6), trasferire sia intere che differenziano primi HeBS o cluster battito cardiaco (sezionati su comparsa di contrazione), su filtri in PTFE su un piatto fondo di vetro di spessore 170 micron compatibile con la distanza di lavoro di obiettivi di apertura numerici elevati. In alternativa, applicare un rivestimento in diretta di battere cluster per il piatto fondo di vetro pre-rivestite con 0,1% di gelatina.
- Campioni di trasferimento ad unall-in-one microscopio dotato di camera di incubazione assicurare temperatura stabile, umidità e CO 2 controllo su periodi di tempo prolungati.
- Ispezione iniziale, immagine dopo che il campione attraverso l'imaging a grande campo sotto illuminazione a luce bianca per identificare strutture di interesse all'interno EBs dissociati o cluster battitori attivi che saranno selezionati per ulteriori accertamenti.
- Se autofluorescenza cellulare da NADH e SH da HNPS devono essere acquisite simultaneamente, impostare una lunghezza d'onda di eccitazione laser più corta (cioè 720 nm) per abbinare l'assorbimento molecolare. Utilizzare una stretta filtro passa-banda spettrale centrato a metà della lunghezza d'onda di eccitazione (cioè, λ = 360 ± 10 nm) per rilevare SH, e un altro per rilevare autofluorescenza.
- Innanzitutto eseguire, bassa risoluzione veloce, scansione tridimensionale per ricostruire la morfologia complessiva del cluster cardiaca e selezionare un piano dell'immagine all'interno del volume cluster con vari visibile HNPs.
- Se necessario, modificare la lunghezza d'onda di eccitazione liberamente abbinare meglio le proprietà ottiche del campione o per evitare photobleaching, danni fotografia e all'immagine più in profondità i tessuti con una lunghezza d'onda IR (ad esempio, 790 nm) e sostituire il secondo filtro armonico di conseguenza (ad esempio, 395 nm ). Ottimizzare le impostazioni del pre-compressore impulso laser alla lunghezza d'onda di lavoro di scelta massimizzando il secondo segnale armonico di HNPS depositati sul campione.
- Per monitorare in tempo reale le contrazioni cardiache del cluster, impostare lo scanner ottico microscopio in modo più veloce come modo risonante, consentendo l'acquisizione ad alta velocità di immagini bidimensionali.
- Scegliere le impostazioni come miglior compromesso tra contrasto dell'immagine e velocità di acquisizione, come ad esempio:
- Media Scan: 4
- Pixel tempo di sosta: 0.1 msec
- Tasso Image: 3.75 fotogrammi al secondo (fps)
- Potenza laser viene regolata in base alla focale punto sizzare e velocità di scansione. 50 mW (misurata all'ingresso dell'obiettivo) è un valore tipico per 0,1 msec pixel tempo di sosta e il piano APO 20X NA 0.75 obiettivo preservare la vitalità cellulare.
5. Image Analysis
- Procedura di calibrazione assiale. Selezionare un singolo HNP depositato su un substrato nudo. Regolare il fuoco (cioè la posizione assiale della nanoparticella) per massimizzare l'intensità SH. Variare in modo controllato la posizione assiale della fase microscopio avere la curva di taratura relativa intensità SH in funzione del HNP disassato rispetto al piano focale. L'output di questa procedura di calibrazione per il 0,75 dell'obiettivo Piano APO 20X NA è riportato in Figura 4C.
- Selezionare HNPS presenti in tutti i fotogrammi video e determinare i loro movimenti periodici. Questa procedura può essere facilmente automatizzato, ad esempio mediante un codice personalizzato in cerca di massimo segnale macchie di intensità in una regione definita di interesse ecollegandoli tra i diversi fotogrammi (un esempio di codice scritto in Matlab R2009 b utilizzando la funzione 'puntelli regione "del Toolbox Image Processing è presentato).
- Valutare la quantificazione dei out-of-plane spostamenti, associati HNPS non continuo rintracciabili muove lungo l'asse ottico, convertendo le loro modulazioni di intensità per tutto differenti cornici in spostamento assiale utilizzando la curva di taratura nella Fase 5.1. Si noti che questa procedura permette di accedere ai movimenti assiali, ma non può essere utilizzata per determinare la direzione assoluta (verso l'alto o verso il basso).
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Representative Results
Prima di valutare l'attività di battitura da confocale, è stata eseguita una accurata caratterizzazione della risposta ottica non lineare dei filtri in PTFE, da soli o in presenza di HNPS ad alta concentrazione (1 mg / ml). Si è assicurato che: i) il substrato nudo due fotoni di fluorescenza eccitata è molto debole e non può impedire misurazione relativi campioni biologici, e ii) l'emissione SH da HNPS isolato può essere facilmente acquisita da immagini attraverso il substrato in modo epi-rilevamento (Figura 2). L'obiettivo era di avere i controlli di riferimento per la quantificazione dello spostamento 3D.
In Figura 3, vengono visualizzati strutture cardiache HNP-etichettati ed EBS. Il rosso (figura 3A), giallo (figure 3B e 3C) e verdi (Figura 3D) colori corrispondono a NADH autofluorescenza, mentre le intense macchie SH blu derivano da isolato HNP. È interessante Point l'ottimo contrasto ottico ottenibili con questa tecnica e all'etichetta relativamente scarsa rispetto ad altri metodi basati su nanoparticelle, come punti quantici o up-conversione nanoparticelle. Nel presente studio, avendo molto intensi etichette isolato era vantaggioso per traccia di diversi movimenti di particelle individuali indipendenti e ricostruendo movimento collettivo delle strutture derivate da cellule staminali.
La Figura 3B illustra una vista fetta di un cluster battito cardiaco HNP marcato. Tali strutture 3D possono poi essere registrati ad alta velocità per controllare il pattern contrazione dell'aggregato cellula-HNP come riportato in film 1. In questo caso, per mantenere alto tasso velocità di acquisizione per risolvere il moto NP, la sensibilità globale acquisizione non era sufficiente per la registrazione di autofluorescenza cellulare con emissione SH da HNPS.
L'applicazione di analisi di immagine descritta nella Sezione 5 del protoCol applicato al complesso di fotogrammi dei filmati consente l'estratto delle informazioni sulle movimento individuale HNP (direzione, nel piano e fuori dal piano di spostamento, frequenza). Il risultato di questa analisi (Figura 4) indica che, all'interno dello stesso cluster cardiaca, la frequenza è costante in-movimento e out-of-plane (vedi trasformata di Fourier in Figura 4B) e spostamenti sono dell'ordine di pochi micrometri (le lunghezze delle frecce che indicano gli spostamenti esemplari di cinque NP in Figura 4A corrispondono alla allungamento massimo delle oscillazioni).
Figura 1. Differenziazione delle hESC nei cluster battenti cardiaca e di etichettatura con nanoparticelle HNPS per la seconda la microscopia l'imaging armonico. Undifferentiatecolonie d hESC (A) erano o 1) ridurre in pezzi più piccoli con lo strumento StemPro EZPassage (B) e lasciare in sospensione per formare EB irregolari (C), o 2) dissociate in singole cellule e a cluster utilizzando il sistema Aggrewell (B ') per formare EB regolari (C'). Entrambi i tipi di EB (C o C ') sono state coltivate per 2 giorni di sospensione e quindi rispettati i piatti gelatina rivestite. Battere grappoli di cardiomiociti (D) sono stati poi sezionato manualmente utilizzando un bisturi e coltivate su filtri in PTFE (E) depositato su inserti per consentire culture 3D aria-liquido (F e F ') (una scala per pannelli A, B, B'. , C e C ': 100 micron, per pannelli D ed E:. 250 micron) Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Caratterizzazione ottica Figura 2. Substrato PTFE. (A) campo immagine luminosa di filtro PTFE da solo. (B) l'immagine a due fotoni del filtro PTFE, che mostra una fluorescenza debole rispetto all'intensità piuttosto alto laser applicata per questa misura di controllo (13 mW). (C e D) Dopo aver aggiunto il substrato nudo una goccia d'acqua contenente HNPS a concentrazione 1 mg / ml, la loro emissione SH può essere facilmente acquisita attraverso il filtro a laser intensità relativamente bassa (2 mW). In D, viene mostrata una immagine 3D di nanoparticelle distribuite sul filtro. (barre di scala: 50 micron).
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Figura 3. Multiphoton imaging HNP etichettato strutture cardiache e di EBS. (A) Il segnale di fluorescenza a due fotoni di un cluster di battitura viene visualizzato in rosso e il segnale SH dai HNPS è mostrata in blu. I colori corrispondono all'intensità misurata dai quattro fotomoltiplicatori nondescanned dotati di diversi filtri spettrali. (Blu 395 ± 11 nm, verde 485 ± 20 nm, giallo 531 ± 40 nm, e il rosso 607 ± 70 nm). Questo gruppo è stato ripreso direttamente attraverso il filtro poroso PTFE con un obiettivo 10X con lunghezza d'onda di eccitazione di 720 nm e una potenza media di 8,8 mW. (B) Una vista fetta di una struttura cardiaca etichettato HNP estratto da un z-stack. (C) L'EB immaginata attraverso le PTFE (barre di scala per A, B e C: 100 micron). (D) Un 3D immagine di un EB marcato con HNPS, ricostruito da Z-scan utilizzando un apochromantica 40X NA 1.25 obiettivo immersione in acqua (barra della scala: 50 micron). Le HNPS sono ben distribuiti intorno all'intera EB e il cluster cardiaco, permettendo l'analisi movimento.
Figura 4. (A) singolo fotogramma del film del cluster pestaggio e l'analisi vettoriale delle in-plane HNPS spostamenti (segnale SH mostrato in nero). Le lunghezze delle frecce corrispondono alla allungamento massimo delle oscillazioni. (B) trasformata di Fourier di oscillazioni NP dimostrano che all'interno dello stesso cluster cardiaca, la frequenza è costante in-(linea nera) e fuori dal piano di movimento (arancione linea tratteggiata) e corrisponde al 0,4 Hz. (C) Calibrazione curva utilizzata per convertire l'intensità HNP in spostamento assiale (vedere la Sezione 5 del protocol). Circles: datapoints sperimentali.
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Discussion
L'applicazione delle nanotecnologie alla ricerca sulle cellule staminali è un settore relativamente nuovo, ma in rapida espansione. Come sottolineato da vari articoli di rassegna sull'argomento, l'uso di nanoparticelle può essere applicato per realizzare diversi compiti di ricerca, che vanno dalla cella di inseguimento (sia in vitro che in vivo), alla consegna intracellulare di proteine e geni, non ultimo la creazione di ambienti cellulari biomimetici per preferenziale stimolazione / inibizione del differenziamento specifiche vie 19,20. L'approccio descritto in questo protocollo è limitata a tracciamento ottico e, anche se la possibilità di utilizzare eccitazione infrarossi porta ad una maggiore profondità di penetrazione rispetto alla fluorescenza tecniche basate; imaging ottico non può essere estesa a tutto il corpo e dovrebbe quindi essere integrato da rilevamento magnetico 21. Precedente lavoro pubblicato ha mostrato diversi approcci per valutare la struttura e il movimento di gruppi di cellule cardiache, inetichettatura cluding da coloranti fluorescenti 22, punti quantici 23,24, ossido di ferro super paramagnetico nanoparticelle 25, e le particelle fluorescenti up-conversion 26-28. I vantaggi di HNPS rispetto a questi nanosonde sono associati con assenza di sbiancamento per lunghi periodi di tempo, maggiore penetrazione di imaging, di lunghezza d'onda sintonizzabilità per una maggiore differenza rispetto al autofluorescenza. La particolare etichettatura cellule sparse (cioè in Figura 3D contiamo circa 160 NPs in un micron cubo di lato 100) che si ottiene da questo approccio risulta essere molto adatto a tracciare le contrazioni delle cellule in cluster cardiaci ESC-derivate umane 3D ad alta spaziale risoluzione.
La scelta del nanomateriale non è limitato a PEG rivestite KNbO 3, ma può comprendere una ricca famiglia di nanoparticelle che mostrano strutture cristalline noncentrosymmetric, che può eventualmente incorporare altri functionalities (magnetico, radioattivo) che consente il rilevamento multi-modale. Inoltre, tali HNPS PEG-rivestiti possono essere ulteriormente funzionalizzati essere specificamente diretti contro epitopi o proteine leganti al fine di mirare selettivamente sottopopolazioni cellulari specifici. D'altra parte, il metodo di immagini qui proposto richiede un microscopio a scansione equipaggiato con una sorgente laser ultraveloce. Un follow up naturale che può essere previsto da questo lavoro sta monitorando l'integrazione delle cellule marcate in biomateriali 3D e ponteggi in vitro e in seguito in tessuti nativi, a seguire la costituzione e la funzionalità delle cellule trapiantate per lunghi periodi.
Un vantaggio di utilizzare filtri in PTFE cuscinetto aggregati 3D, come nel nostro caso, è la possibilità di effettuare più misurazioni per giorni e settimane, come i filtri possono essere ripristinati sul loro inserimento sostiene senza rischi di contaminazioni. Ancora più importante, filtri in PTFE consentono anche la valutazione ripetitiva di pot azioneentials l'utilizzo di matrici multi-elettrodo.
Soglie di danno cellulare per il multi-fotone di eccitazione nel vicino infrarosso è stato precedentemente determinato a meno di 1 TW / cm 2 da König et al 29. Nel nostro studio, utilizzando un obiettivo 0,75 NA 20X, l'intensità applicata rimane sotto la TW / cm 2 (0,26 TW / cm 2) e il tempo di sosta pixel breve (0.1 msec) rispetto al lavoro di König (80 msec) garantisce la possibilità conservare il campione vivo e differenziazione.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare il finanziamento parziale del progetto di ricerca FP7 NAMDIATREAM europea (NMP4-LA-2010-246479, http://www.namdiatream.eu) e il progetto INTERREG IV Francia-Svizzera NAOMI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope Incubator | OKO LAB | UNO package (top stage) | 37 °C, 5% CO2, moisturized |
| Multiphoton microscope | Nikon | AR1-MP | |
| Fast scanning, four nonphotomultiplier descanned detectors | |||
| Filters SHG and autofluorescence | Semrock | FF01-360/12-25 | |
| FF01-395/11-25 | |||
| FF02-485/20-25 | |||
| Microscope objectives | Nikon | ||
| CFI Plan Fluor 10X | NA 0.30, WD 16 mm | ||
| CFI Plan Apo 20X | NA 0.75, WD 1.0 mm, VC | ||
| CFI Apo 40X | NA 1.25, WD 0.18 mm λS, Nano-Crystal Coat | ||
| Rhock inhibitor | Sigma | Y-27632 | |
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829 | |
| Knockout Serum | Invitrogen | 10828 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 1140 | |
| L-glutamine 200 mM | Invitrogen | 25030 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| Roller scraper tool | StemPro EZPassage, Invitrogen | 23181-010 | |
| StemPro Accutase | Gibco | S11105-01 | |
| Aggrewell system | StemCell Technologies | 27845 | |
| Hyclone serum | Thermo Scientific | SH30070.03 | |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| 6-well plates | Falcon | 353046 | |
| 24-well plates | Nunclon | 142475 | |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) filters | Millipore | NA76/25 | |
| Inserts | Millipore | PICM03050 |
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