Summary
プロトコルの詳細は、 インビトロ第二高調波発生ナノ粒子でヒト胚性幹細胞を標識するために設けられている。多光子顕微鏡および心臓のクラスタへの分化によるヒトES細胞の研究のための方法論も提示されています。
Abstract
この可視化実験では、プロトコルの詳細は、第二高調波発生ナノ粒子（のHNP）を用いてヒト胚性幹細胞（hESC）のインビトロでの標識化のために設けられている。後者は最近、多光子イメージングのための生物学的サンプルを標識するために導入されたプローブの新しいファミリーである。 HNPは、励起波長に制限なく第二高調波発生の非線形光学過程により励起光の周波数を2倍にすることができる。
心臓クラスタ（長期的な気液培養として維持されている）へのhESC分化のための多光子ベースの方法論が詳細に提示されています。具体的には、3Dで心臓組織を破っての3次元監視中に孤立のHNPの強烈な第二高調波（SH）排出量を最大化する方法についての証拠が示されている。 3D変位パターンを取得する結果の画像の分析も詳述されている。
Introduction
非線形顕微鏡検査システムは、その固有の三次元セクショニング能力のおかげで、ますます近赤外における二光子吸収帯を有する光安定なフルオロフォアの需要を引き起こした。唯一ここ数年で、蛍光ベースの標識（アップコンバートナノ色素、量子ドット）の開発を補完するために、異なるイメージング手法は、ラベル、 すなわちとして本質的に非線形のナノ粒子の新規なファミリーの使用を利用してきた具体的には、ナノ粒子高調波多光子顕微鏡法のために開発されている（たHNP）。無機非中心対称の結晶に基づくこれらの標識は、励起周波数のSHを生成する光学的コントラストを発揮する：近赤外パルス励起光の一部を変換することにより、例えば、可視青色光に（λ= 800 nm）を（λ/ 2 = 400 nm）を。最近の過去のいくつかの著者は、鉄、ヨウ素酸鉄（IOを含め、様々な材料をテストした
この可視化実験では、プロトコルの詳細は、非官能化のHNPを有するヒト胚性幹細胞（hESC）をインビトロで標識するために設けられている。コロイド懸濁液の合成と製造は、以前の出版物およびその中の参考文献16に詳述されてこの仕事の範囲を超えています。 （長期的な空気液体培養として維持）心臓クラスタに多光子顕微鏡法およびその分化によるヒトES細胞の研究のための方法論を提示する。ヒトESCは、懸濁液中のコロニー断片のEBの形成によって、または図1Aに示すように、代替的に、Aggrewell板を用いたEBへの単一細胞の凝集を強制いずれか二つの異なる方法で、いわゆる胚様体（EB）内で分化するようにさせことができる（PTFE）、ポリテトラフルオロエチレンで心臓細胞の拍動クラスターを培養多孔質フィルタファク（活動電位の例電気生理学的測定のための）さらなる研究のための長期的なメンテナンスをilitates。
走査顕微鏡の励起源のHNPは、第二高調波イメージングを実行するのに必要なピークパワーを達成するために、（サンプル300フェムト秒より小さいパルス持続時間を有する）超短パルスを送達することができるべきである。例えば、画像化に使用される最も一般的なFSECソースは、調整可能なTiは以下のとおりです。サファイアレーザー。サファイアポンピング赤外線光パラメトリック発振器：あるいは、他の超高速レーザは、インスタンスエルビウムイオン17、クロムフォルステ18またはTiのために用いることができる。顕微鏡は、好ましくは、かなり高い開口数の対物レンズを装備することができる。非常に重要なことは、測定に先立って、及び対物が交換されるたびに、現用のレーザパルス予備圧縮器の設定を最適化することにより、セットアップ（レンズ）における分散を最小に存在することが必須である選択した波長。この手順は、プロトコルの詳細は、レーザパルスは焦 点面におけるフーリエ限られた期間（ すなわち、最短のような）にできるだけ近く、試料非線形応答を最大にすることを保証する。
プロトコルの最後に記載された画像解析の目的は、特定し、心臓のクラスタを破ってのリズミカルな収縮に関連した3次元のHNPの動きに追従することです。像平面内のトラッキングナノ粒子は、単に、連続する動画フレーム内の位置を識別することによって実現される。軸方向の動きの情報を抽出するために、軸方向変位の関数として非線形強度応答の事前のキャリブレーションが必須です。長期的な測定のために、試料の軸方向位置の能動光干渉制御は、熱および/または機械的なドリフトの存在下での検量線の有効性を維持するために必要であることに留意されたい。
Tracのためにここに使用されるのHNP集計以内に電子破っ細胞は、ニオブ酸カリウム酸化物（のKNbO 3）に基づいていますが、他の利用可能な非線形ナノ材料はStaedler ら 16の研究で詳細に検討される。
これまでに調査し、ナノ材料のほとんどの非線形光学効率が非常に匹敵する。のKNbO 3のための選択は、基本的にコロイド溶液でも、かなり高濃度と長い博覧時間16で、いくつかのヒトの細胞系でテストされ、その優れた生体適合性の良好な安定性によって動機づけられた。
この作業のために使用ナノ材料の新規性を考えると、蛍光/発光のバイオマーカーに比べてのHNPの主な特徴は、著者が実現短い元のコンピュータビデオアニメーションで表示されます。
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Protocol
1。文化と人間のESCの拡大
- 20％ノックアウト血清、1％MEM非必須アミノ酸、1％L-グルタミン200 mMの、1％ペニシリン - ストレプトマイシン、および3.5μlのβ-メルカプトエタノールを補充したノックアウトDMEMを含有する（PMとも呼ばれる）、細胞増殖培地を調製する。
- 8ミリリットル午後媒体に人間のESC（hESCの）を解凍し、DMSOを補充凍結培地を廃棄するように115×gでそれらを5分遠心する。
- 解凍の際にアポトーシスを防止し、細胞生存を改善するために岩の10mM阻害剤を含むPM培地1 mLを加え（わずか24時間のインキュベーション）。
- 多能性の維持のために所望の濃度（4〜10 ng / mlの）でのPMに塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）を添加する。
- 以前に2×10 4細胞/ cm 2の濃度で播種し、フィーダー細胞（γHFF）（ 図1A）、照射されたヒト包皮上プレートのhESC。
- 毎日培地交換や、必要なときに、Cの部分を除去細長いシャープにカットし、パスツールピペットを用いて吸引により差別化を始めolonies。
- 週に一度、通路コロニー酵素的に：
- 培地を除去し、2ミリリットルのPBSでコロニーを洗う。
- PBSを除去し、37℃、5％CO 2で10分間、1 mg / mlのコラゲナーゼの温IVのウェルあたり0.5mlでそれらをインキュベートする。
- 3分間115×gで2ミリリットル新PMおよび遠心機でコロニーの断片を収集します。
- 代わりに、コロニーはこすることによって、機械的に継代することができる。
- 培地を除去し、2ミリリットルのPBSでコロニーを洗う。
- 手動STEMPRO EZPassageローラースクレーパーツール（ 図1B）を使用してコロニーをこすり。
- コロニーの断片を収集し、上清を除去するために115×gで3分間遠心分離器。
- プレート断片γHFFまたは胚様体（EB）への分化のためにそれらを処理します。
2。人間のESC分化プロトコル
- 調製ノックアウトDMEMを用いて分化培地（DM）を2％のハイクローン血清、1.0％MEM非必須アミノ酸、1.0％L-グルタミン200 mMの、1％ペニシリン - ストレプトマイシン、3.5μlのβ-メルカプトエタノールを補充した。
- 培地を除去し、2ミリリットルのPBSでコロニーを洗う。
- 懸濁液中のコロニーフラグメントのEB形成：
- PBSを除去し、37℃、5％CO 2で10分間、1 mg / mlのコラゲナーゼの温IVのウェルあたり0.5mlでそれらをインキュベートする。
- 3分間115×gで2ミリリットル新しいDMおよび遠心機でコロニーの断片を収集します。
- 4日間（ 図1C）超低付着6 -ウェルプレート（ウェルあたり2ml）中の懸濁液で培養して。
- 収集し、0.1％ゼラチンでコーティングされた24ウェルプレート（約3のEB /ウェル）（ 図1D）に新たに形成されたEBプレート。
- あるいは、Aggrewell板を用いてEBを単一細胞への凝集を強制。
- PBSを削除し、をAccutase（0.5ミリリットル/ウェル）を使用して、単一細胞にコロニーを解離する。
- DMでの遠心分離と再懸濁細胞1.2×10 6 / mlで。
- 1日（ 図1B '）のためAggrewell室当たり2ミリリットルを追加します。
- 新たに形成されたEB（ 図1C '）を収集し、0.1％ゼラチンでコーティングされた24ウェルプレート（約3のEB /ウェル）上にプレート。
- 心筋細胞（15-30日）のクラスタを破っての登場まで、2〜3日ごとにDMを変更します。
3。のHNPを持つクラスタとラベリングを打つの気液3D培養物は、
- 特定し、手動で打つ心筋細胞（ 図1D）のクラスターを分析、通常は細長いシャープにカットパスツールピペットを用いて、文化の2-4週間後に現れる。
- 6ウェルプレート（ 図1F）に配置されます挿入あたりの預金4 PTFE製フィルター。
- EACの上DM培地1mlを追加H井戸。
- プレートあたりすなわち 24凝集（ 図1F '）、各PTFEフィルター（ 図1E）、最大4/wellでクラスタを破って解剖さ1を追加します。
- 2〜3日ごとにDM培地を変更します。
- クラスタにラベルを付けるには、（170ミクロン厚）拍動クラスターを含むPTFEフィルターを取り外し、3.5センチガラスボトムディッシュの上に置いた。
- 30分間の50μg/ mlの濃度でHNPの1ミリリットルを加える。
4。非線形光学イメージング
- サンプル調製。 HNPの標識後（ステップ3.6を参照）、高開口数対物レンズの作動距離に対応して170ミクロン厚のガラスボトムディッシュ上でのPTFEフィルター上（収縮外観上に解剖さ）は、初期HEBSまたは心臓の鼓動のクラスタを差別化のどちらか全体を転送します。代わりに、0.1％ゼラチンで予めコーティングされたガラスボトムディッシュに暴行クラスタの直接コーティングを適用します。
- への転送サンプルオールインワンの安定した温度、湿度、長期間にわたって、CO 2制御を確実にチャンバーをインキュベートを備えた顕微鏡。
- 初期検査の後に、分化したEBまたはさらなる調査のために選択される活性拍動クラスター内の対象物の構造を同定するための白色光照明下での広視野画像化を介して、画像サンプル。
- セルNADHからの自家蛍光とのHNPからSHが同時に取得する必要がある場合は、分子吸収に合わせて短いレーザー励起波長（ すなわち 720 nm）を設定します。半分の励起波長を中心とする1狭帯域バンドパスフィルタを使用して、スペクトル（ すなわち 、λ= 360±10nm）をSHを検出するために、もう一つは自己蛍光を検出すること。
- まず心臓クラスタの全体的な形態を再構築し、いくつかの目に見えるHNPとクラスタボリューム内の画像平面を選択するための高速、低解像度、3次元スキャンを行うS。
- 必要に応じて、最高のサンプルの光学特性に合わせて自由に励起波長を変更したり、IR波長（ すなわち 、790 nm）を有する組織に深く光退色、光損傷やイメージにを避けるために（ すなわち 、395 nmのそれに応じて第二高調波フィルターを交換）。試料上に堆積したHNPの第二高調波信号を最大化することにより、選択した動作波長のレーザーパルス予備圧縮の設定を最適化します。
- リアルタイムで心臓クラスタ収縮を監視する二次元画像の高速取得を可能にする、そのような共振モード等の最速モードで顕微鏡光学スキャナを設定する。
- 画像コントラストおよび取得速度との間の最良の妥協などの設定を選択してください、のような：
- スキャン平均：4
- 画素滞留時間：0.1秒
- 画像レート：毎秒3.75フレーム（fps）
- レーザパワーは、焦点のに応じて調整されるIZEと走査速度。 50 MW（対物レンズの入射で測定）は、0.1秒のピクセル滞留時間、細胞生存率を維持する計画APO 20X NA 0.75目的の典型的な値である。
5。画像解析
- アキシャル校正手順。ベア基板上に堆積された単一のHNPを選択します。 SH強度を最大にするために（ナノ粒子の軸方向の位置IE）ピントを合わせます。焦点面からオフセットHNPの関数としてSH強度を関連付ける較正曲線を得るために、顕微鏡ステージの軸方向位置制御された方法で変化する。プランAPO 20X NA 0.75対物について、この較正手順の出力は、 図4Cに報告されている。
- すべてのビデオフレームに存在するのHNPを選択し、その定期的な運動を決定する。この手順は、容易に定義された関心領域内の最大信号強度のスポットを求めて、カスタムコードによって、例えば、自動化することができる異なるフレーム間でこれらを接続する（画像処理ツールボックスの '領域の小道具を'関数を使用してbをMatlabのR2009で書かれたサンプルコードが提供されている）。
- ステップ5.1において確立された検量線を用いて軸方向の変位に異なるフレームにわたってそれらの強度変調に変換することにより、光軸に沿って移動する非連続的にトレーサブルのHNPに関連付けられた面外変位の定量化を評価する。この手順は、軸方向の動きへのアクセスを与えるが、絶対的な方向（上方または下方）を決定するために使用できないことに注意してください。
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Representative Results
共焦点イメージングによる叩解活性を評価する前に、PTFEフィルタの非線形光学応答の慎重な特徴付けは、単独で、または高濃度（1 mg / ml）でのHNPの存在下でのいずれかで実施した。 I）ベア基板2光子励起蛍光は非常に弱く、関連する生物学的サンプルを測定防ぐことはできないと、ii）単離されたHNPからのSH発光を容易にエピ検出モードで基板を介して画像化することで取得することができる：それはことを確実にした（ 図2）。目的は、3次元変位の定量化のための基準のコントロールを持っていることでした。
図3では、HNP-ラベルされた心臓の構造としたEBが表示されます。強い青色SHスポットは、単離されたHNPに由来しながら赤色（ 図3A）、イエロー（ 図3Bおよび3C）と、緑（ 図3D）の色は、NADH自己蛍光に相当する。それは、POすることは興味深いこの手法と量子ドットまたはアップコンバージョンナノ粒子のような他のナノ粒子ベースの方法と比較して比較的疎なラベリングによって達成可能な、非常に良好な光学コントラストをint型。本研究では、非常に強烈な単離されたラベルを有するいくつかの独立した個々の粒子の動きを追跡し、幹細胞由来の構造体の集合的運動を再構成するために有利であった。
図3Bは、HNP-ラベルされた心臓の鼓動クラスタのスライスビューを示している。 ムービー1に報告されているように、このような3D構造は、次いで、細胞HNP集合体の収縮パターンを監視するために高速で記録することができ、この場合、NP運動を解決するために、高い取得速度レートを維持するために、全体的な捕捉感度が十分ではなかったのHNPからのSH放出に伴う細胞の自家蛍光を記録する。
プロトのセクション5で説明した画像解析の適用ムービーフレームのアンサンブルに適用されるcolは、個々のHNPの動き（方向、面内及び面外変位、周波数）についての情報の抽出を可能にします。この分析の結果（ 図4）は、同じクラスタ内の心臓、周波数内及び面外の運動に対して一定である（フーリエ図4Bに変換参照）および変位は数μmのオーダーであることを示す（ 図4Aの5つのNPの例示的な変位を示す矢印の長さは、振動の最大の伸びに相当する）。
図1。心臓拍動のクラスタと第二高調波イメージング顕微鏡用のHNPナノ粒子で標識へのhESCの分化。UndifferentiateDのhESCコロニー（A）は、1）STEMPRO EZPassageツール（B）を使用して小片に切られて、不規則なのEB（C）を形成するために、懸濁液中でみましょうか、2）単一の細胞に分離し、Aggrewellシステム（Bを用いた再クラスタ化のいずれかであった'））は、正規のEB（Cを形成するために」。 EBは（CまたはC '）の両方のタイプは、懸濁液中で2日間培養した後、ゼラチンコートディッシュに付着した。心筋細胞（D）のクラスタを破っては、手動で空気-液体3D培養物（FおよびF '） を可能にするようにインサート上に堆積PTFEフィルター上メス培養（E）を用いて解剖した。（パネルAのスケールバー、B、B' 、CとC '：100ミクロン、パネルDとEの場合：250μm）をこの図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図2。PTFE基板の光学特性評価。単独のPTFEフィルター（A）の明視野像。このコントロール測定（13ミリワット）を申請し、かなり高いレーザー強度に比べて弱い蛍光を表示するPTFEフィルター、（B）の二光子画像。 （CおよびD）ベア基板に1 mg / mlの濃度でのHNPを含む水滴を加えた後、そのSH放出を容易に比較的低いレーザー強度（2ミリワット）でフィルターを介して取得することができる。 Dは、フィルタ上に広げたナノ粒子の3次元画像が示されている。 （スケールバー：50μm）を。
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図3 HNPの多光子イメージングは、心臓の構造を標識し、EBを、（A）叩解クラスターの二光子蛍光信号は赤色で表示されたHNPからSH信号は青色で示されている。色は異なるスペクトルフィルタを装備した4ノンデスキャン光電子増倍管で測定された強度に対応しています。 （ブルー395±11nmで、緑色の485±20nmで、黄色の531±40 nmであり、赤の607±70 nm）を。このクラスターは、720 nmの励起波長および8.8 mWの平均電力で10倍を目的としたPTFE多孔質フィルタを介して直接画像化した。 （B）は zスタックから抽出されたHNPラベル心臓構造のスライスビュー。 （C）AN EBは、PTFEを通して画像（A、B、Cのためのスケールバー：100μm）を。 （D）のHNPで標識されたEBの3D画像、apochを用いてのzスキャンから再構成されたromatic 40X NA 1.25水浸対物レンズ（スケールバー：50μm）を。のHNPはよく運動解析を可能にし、全体EBおよび心臓クラスタを中心に広がっている。
図4叩解クラスタおよび面内のHNP変位（黒で示さSH信号）のベクトル解析の映画の（A）個別フレーム。矢印の長さは、振動の最大の伸びに対応しています。 （B）フーリエ変換は、同じ心臓クラスタ内の、周波数内（黒線）および面外運動（オレンジ点線）が一定であり、0.4 Hzに対応することを示すNPは振動のフーリエ。軸方向の変位にHNP強度に変換するために使用（C）校正曲線（PROTのセクション5を参照してください。ocol）。サークル：実験データポイント。
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Discussion
幹細胞研究するナノテクノロジーの応用は比較的新しいが、急速に拡大する分野である。主題の種々の総説によって指摘されたように、ナノ粒子の使用は、タンパク質および遺伝子の細胞内送達には、（ インビトロおよびインビボの両方で ）追跡セルに至るまで、異なる研究タスクを達成するために適用することができる、少なくともしないの作成特定の分化経路19,20の優先的な刺激/抑制のためのバイオミメティック細胞環境。赤外励起を使用する可能性は、蛍光ベースの技術に関連して増加した侵入深さをもたらすが、このプロトコルに記載のアプローチは、光学追跡に制限され、;光学イメージングは、全身に拡張することはできませんので、磁気検出21によって補完されるべきである。以前発表された研究では、心筋細胞クラスターの構造や動きを評価するためにいくつかのアプローチを示した22蛍光色素、量子ドット23,24によって標識cluding、超常磁性酸化鉄は、26〜28ナノ粒子25、及びアップコンバージョン蛍光体粒子。これらのナノプローブに関してのHNPの利点は、長期間にわたって漂白の欠如に関連している、、自家蛍光についての増加は対照用の波長可変性をイメージングへの浸透を増加させた。このアプローチによって得られる独特の疎細胞標識（ すなわち 、図3Dに我々は100ミクロン側キューブの約160 NPSをカウント）が高い空間での3D人間ESC由来心筋クラスタ内のセルの収縮をトレースするには非常によく適していることが判明解像度。
ナノ材料の選択は、PEG-被覆されたKNbO 3に限定されるものではなく、おそらく他のfunctionalitiを組み込むことができる非中心対称の結晶構造を表示するナノ粒子の豊富なファミリーを包含することができるエス（磁気放射性）マルチモード検出を可能にする。さらに、このようなPEG-被覆されたのHNPは、さらに具体的に選択的に特定の細胞亜集団を標的とするために、エピトープまたは結合タンパク質に対して指向されるように官能化することができる。一方、ここで提案撮像手法は、超高速レーザ源を備えた走査型顕微鏡を必要とする。この作品から考えることができる自然なフォローアップが混入し、長期間にわたって移植細胞の機能に従うことを、in vitroで 、さらにネイティブの組織への3次元生体材料および足場構造に標識細胞の統合を監視している。
3D凝集体を有するPTFEフィルターを使用することの利点は、我々の場合におけるように、フィルタは、その挿入時にバック復元できるように、数日から数週間にわたって複数の測定を実行するための可能性は、汚染のリスクなしに支持している。より重要なことに、PTFEフィルタも作用ポットの反復評価を可能にマルチ電極アレイを使用してentials。
近赤外多光子励起のための細胞の損傷閾値は、予めKoenig ら 29％未満1 TW / cm 2と判定された。我々の研究では、0.75 NA 20X対物レンズを用いて、印加強度がケーニッヒの仕事（80秒）と比較して、TW個/ cm 2（0.26 TW / cm 2）とし、短い画素滞留時間（0.1秒）の下に残る可能性を確実にする生きていると差別サンプルを保存すること。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
著者らは、欧州のFP7研究プロジェクトNAMDIATREAM（NMP4-LA-2010から246479、http://www.namdiatream.eu）とINTERREG IVフランス - スイスNAOMIプロジェクトから部分的な資金調達を承認したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope Incubator | OKO LAB | UNO package (top stage) | 37 °C, 5% CO2, moisturized |
| Multiphoton microscope | Nikon | AR1-MP | |
| Fast scanning, four nonphotomultiplier descanned detectors | |||
| Filters SHG and autofluorescence | Semrock | FF01-360/12-25 | |
| FF01-395/11-25 | |||
| FF02-485/20-25 | |||
| Microscope objectives | Nikon | ||
| CFI Plan Fluor 10X | NA 0.30, WD 16 mm | ||
| CFI Plan Apo 20X | NA 0.75, WD 1.0 mm, VC | ||
| CFI Apo 40X | NA 1.25, WD 0.18 mm λS, Nano-Crystal Coat | ||
| Rhock inhibitor | Sigma | Y-27632 | |
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829 | |
| Knockout Serum | Invitrogen | 10828 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 1140 | |
| L-glutamine 200 mM | Invitrogen | 25030 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| Roller scraper tool | StemPro EZPassage, Invitrogen | 23181-010 | |
| StemPro Accutase | Gibco | S11105-01 | |
| Aggrewell system | StemCell Technologies | 27845 | |
| Hyclone serum | Thermo Scientific | SH30070.03 | |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| 6-well plates | Falcon | 353046 | |
| 24-well plates | Nunclon | 142475 | |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) filters | Millipore | NA76/25 | |
| Inserts | Millipore | PICM03050 |
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