Summary
프로토콜 정보는 두 번째 고조파 발생 나노 입자와 생체 표지 인간 배아 줄기 세포 제공됩니다. 다 광자 현미경과 심장 클러스터로 분화하여 hESC의 조사에 대한 방법론도 제시된다.
Abstract
이 시각 실험에서, 프로토콜 정보는 두 번째 고조파 발생 나노 입자 (HNPs)와 인간 배아 줄기 세포의 체외 라벨 (hESC의) 제공됩니다. 후자는 최근 다중 광자 이미징을위한 생체 시료 라벨 도입 프로브의 새로운 가족입니다. HNPs는 여기 파장에 아무런 제한이 제 고조파 발생의 비선형 광학적 프로세스에 의해 여기 광의 주파수를 두배로 할 수있다.
다 광자 (장기 공기 - 액체 문화로 유지) 심장 클러스터로 hESC의 차별화를위한 방법론을 기반으로 상세하게 제공됩니다. 특히, 3D로 심장 조직을 구타의 3D 모니터링 동안 고립 HNPs의 강렬한 두 번째 고조파 (SH) 배출을 극대화하는 방법에 대한 증거가 표시됩니다. 3D 변위 패턴을 검색 결과 이미지의 분석은 또한 상술된다.
Introduction
비선형 현미경 시스템은 고유의 입체 단면 처리 능력 덕분에, 점점 근적외선의 이광자 흡수 밴드를 가진 광 안정 형광체에 대한 수요를 유발 하였다. 단지 지난 몇 년에, 형광 기반의 라벨 (염료, 양자 점, 최대 변환 나노 입자), 다른 이미징 방법은 레이블과 같은 본질적으로 비선형 나노 입자의 새로운 가족의 사용을 악용 한, 즉 개발을 보완하는 특히 다 광자 현미경을 위해 개발 된 고조파 나노 입자 (HNPs). 무기 noncentrosymmetric 결정에 따라 이러한 레이블은 여기 주파수의 SH를 생성 광학 대비를 발휘 : 근적외선 펄스 여기 빛의 일부를 변환하여 예를 볼 푸른 빛으로 (λ = 800 nm의) (λ / 2 = 400 nm의) . 최근 과거에 여러 저자는 철 요오드 철 (IO를 포함하여, 다른 재료를 테스트 한
이 시각 실험에서, 프로토콜 세부 사항은 작용 화 HNPs으로 인간 배아 줄기 세포의 체외 라벨 (hESC의) 제공됩니다. 콜로이드 현탁액의 합성 및 제조는 이전 책에서 및 참조 거기에 16에서 설명하고이 범위에있다. (장기 공기 - 액체 문화로 유지) 심장 클러스터에 다 광자 현미경과 분화에 의해 hESC의 조사에 대한 방법론이 제시된다. 인간의 ESC 서스펜션의 식민지 조각의 EB 형성하거나 그림 1A에 도시 된 바와 같이, 대안, Aggrewell 판을 사용하여 사채에 단일 세포의 응집을 강제하거나 두 가지 방법으로 소위 배아 체 (교환 사채) 내에서 차별화 할 수 있도록 할 수 있습니다 . 폴리 테트라 플루오로 에틸렌에 심장 세포의 클러스터를 치고 배양 (PTFE) 다공성 필터 FAC추가 연구 (활동 전위의 예를 들어 전기 생리학 측정)에 대한 자신의 장기적인 유지 관리를 ilitates.
주사 현미경의 여진 원은 HNPs의 차 고조파 이미징을 수행하기 위해 필요한 최대 전력에 도달하기 위해 (샘플에서 300 FSEC보다 작은 펄스 시간) 초단 펄스를 제공 할 수 있어야한다. 예를 들어, 이미징에 사용되는 가장 일반적인 FSEC 소스는 가변 티 아르 : 사파이어 레이저. 사파이어 펌핑 적외선 광 파라 메트릭 발진기 : 또는 다른 초고속 레이저는 인스턴스 에르븀 이온 17, 크롬 포스 테 라이트 (18) 또는 티를 위해, 이용 될 수있다. 현미경은 바람직 다소 높은 개구 수 대물 탑재 될 수있다. 아주 중요한 것은, 앞서 측정 한 목적이 대체 될 때마다, 그것은이 운동에 레이저 펄스 사전 압축기의 설정을 최적화하여 셋업 (렌즈)의 분산액의 존재를 최소화하기 위해 필수선택의 파장. 프로토콜에 설명이 절차는, 레이저 펄스가 초점면에서 한정된 지속 기간을 변형 (즉, 최단 등)에 최대한 가깝게하고 샘플 비선형 응답을 최대화하는 것을 보장한다.
프로토콜의 끝 부분에 설명 된 이미지 분석의 목적은 파악하고 심장 클러스터를 상회의 리듬 수축과 관련된 3D HNPs의 움직임에 추적 할 수 있습니다. 이미지면에서 추적 나노 입자는 단순히 연속 동영상 프레임에서 자신의 위치를 파악하여 실현된다. 축 방향 이동에 대한 정보를 추출하기 위해, 축 방향 변위의 함수로서 비선형 강도 응답의 사전 보정이 필수적이다. 장기 측정 샘플 축 위치의 활성 간섭계 컨트롤을주지는 열 및 / 또는 기계적 감도의 존재 검량선의 유효성을 유지하는 것이 요구된다.
TRAC에 여기에 사용 HNPs집합 내의 전자 박동 세포는 니오븀 산 칼륨 산화물 (KNbO 3)을 기반으로하지만, 다른 가능한 비선형 나노 물질은 Staedler 등 (16)의 작품에서 자세히 검토하고 있습니다.
지금까지 조사 된 나노 물질의 대부분의 비선형 광학 효율이 매우 비교할 수 있습니다. KNbO 3의 선택은 본질적으로 콜로이드 용액의 좋은 안정성과도 상당히 높은 농도와 긴 박람회 16 배에서 몇 사람의 세포주의 좋은 생체 적합성에 의해 좌우되었다.
이 작업에 사용되는 나노 물질의 새로운 감안할 때, 형광 / 발광 바이오 마커에 비해 HNPs의 주요 특성은 저자에 의해 실현 짧은 원래 컴퓨터 비디오 애니메이션에 표시됩니다.
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Protocol
1. 문화와 인간 ESC의 확장
- 준비 녹아웃 DMEM을 함유하는 (PM이라고 함) 세포 증식 배지는 20 % 녹아웃 혈청, 1 % MEM 비 필수 아미노산, 1 % L-글루타민 200 mM의 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 및 3.5 μL의 β-머 캅토 에탄올이 보충.
- 8 ML의 PM 매체에서 인간의 ESC (hESC의)를 해동 및 DMSO 첨가 된 동결 매체를 폐기 115 XG에서 그들에게 5 분 원심 분리기.
- (만 24 시간 배양)를 해동시 세포 사멸을 방지하고 세포 생존을 개선하기 위해 10 mM의 바위 억제제를 포함하는 PM 매체의 1 ML을 추가합니다.
- 능성의 유지에 필요한 농도 (4-10 NG / ㎖)에서 PM에 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF)를 추가한다.
- 이전 / ㎠ 2 × 10 4 세포의 농도로 도금 피더 세포 포피 조사 인간의 hESC의 (γHFF) (그림 1A)를, 플레이트.
- 필요한 경우 C의 일부를 제거, 중간 매일 변경olonies는 긴 크게 잘라 파스퇴르 피펫을 사용하여 흡인 차별화하기 시작했다.
- 효소 주 통로 식민지 번 :
- 매체를 제거하고 2 ML PBS와 식민지를 씻어.
- PBS를 제거하고 37 ° C, 5 % CO 2에서 10 분 동안 1 ㎎ / ㎖에서 따뜻한 콜라게나 제 IV 잘 당 0.5 ㎖로 그들을 품어.
- 2 ㎖ 3 분 115 XG에 새로운 PM 원심 분리기에 식민지 조각을 수집합니다.
- 또한, 식민지 긁어 기계적으로 계대 할 수 있습니다
- 매체를 제거하고 2 ML PBS와 식민지를 씻어.
- 수동 StemPro EZPassage 롤러 긁는 도구 (그림 1B)를 사용하여 식민지를 다 쳤어요.
- 식민지 조각을 수집하고 뜨는을 제거하기 위해 115 XG에서 3 분 동안 원심 분리 한 후.
- γHFF 또는 플레이트 조각은 배아 체 (교환 사채)로 차별화를 처리합니다.
2. 인간의 ESC 차별화프로토콜
- 준비 녹아웃 DMEM을 사용하여 차별화 매체 (DM)는 2 % HyClone 사 혈청, 1.0 % MEM 비 필수 아미노산, 1.0 %의 L-글루타민 200 밀리미터, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신, 3.5 μL의 β-머 캅토 에탄올과 보충.
- 매체를 제거하고 2 ML PBS와 식민지를 씻어.
- 서스펜션의 식민지 조각의 EB 형성 :
- PBS를 제거하고 37 ° C, 5 % CO 2에서 10 분 동안 1 ㎎ / ㎖에서 따뜻한 콜라게나 제 IV 잘 당 0.5 ㎖로 그들을 품어.
- 2 ㎖ 3 분 115 XG에 새로운 DM 원심 분리기에 식민지 조각을 수집합니다.
- 사일 (그림 1C) 용 초저 첨부 6 - 웰 플레이트 (물론 당 2 ㎖) 현탁액 문화를.
- 수집하고 0.1 % 젤라틴 코팅 24 - 웰 플레이트 (약 3 사채 /도) (그림 1D)에 새로 설립하는 교환 사채를 접시.
- 또한, Aggrewell 판을 사용하여 사채로 단일 세포의 집계를 강제 :
- 제거 PBS와accutase (0.5 ㎖ /도)를 사용하여 단일 세포로 식민지를 떼어 놓다.
- 1.2 × 10 6 / ㎖에서 DM의 원심 분리기와에 resuspend 세포.
- 일일 (그림 1B ')에 대한 Aggrewell 챔버 당 2 ML을 추가합니다.
- 새로 형성된 사채 (그림 1C ')를 수집하고 0.1 % 젤라틴 코팅 24 - 웰 플레이트 (약 3 사채 / 웰)에 그들을 접시.
- 심근 (15-30 일)가 클러스터를 상회의 모양까지 2-3 일마다 DM을 변경합니다.
HNPs와 클러스터 및 라벨링 잔 3. 공기 - 액체 3D 문화
- 확인하고 수동으로 일반적으로 긴 크게 잘라 파스퇴르 피펫을 사용하여, 문화 2 ~ 4 주 후에 나타나는 치는 심근 (그림 1D)의 클러스터를 해부하다.
- 6 잘 플레이트 (그림 1 층)에 배치됩니다 삽입 당 보증금 4 PTFE 필터.
- EAC의 상단에 DM 매체의 1 ML을 추가합니다시간 잘.
- 각 PTFE 필터 (그림 1E)에 하나의 해부 치고 클러스터, 최대 4/well, 플레이트 (그림 1 층 ') 당 즉, 24 집계를 추가합니다.
- 2-3 일마다 DM 매체를 변경합니다.
- 클러스터 레이블을 지정하려면 (170 μm의 두께) 박동 클러스터를 포함하는 PTFE 필터를 제거하고 3.5 cm의 유리 바닥 접시에 넣어.
- 30 분 동안 50 ㎍ / ml의 농도로 HNP 1 ㎖를 추가.
4. 비선형 광학 이미징
- 샘플 준비. HNP 라벨 (단계 3.6 참조)를 사용하여 높은 개구 목표의 작동 거리와 호환되는 170 μm의 두께 유리 바닥 접시 위에 PTFE 필터에 전체 분화 초기 HEBS 또는 (수축 모양에 따라 절개) 심장 박동 클러스터 중 하나를 전송 한 후. 또한, 유리 바닥 접시 0.1 % 젤라틴으로 미리 코팅에 클러스터를 상회의 직접 코팅을 적용합니다.
- 로 전송 샘플올인원 안정 온도, 습도 및 시간의 연장 기간 동안 CO 2 제어를 보장하는 실을 배양 장착 현미경.
- 초기 검사, 이미지 후 백색광 조명 아래 넓은 필드 영상을 통해 샘플은 추가 조사를 위해 선택됩니다 차별화 된 사채 또는 활성 박동 클러스터 내에서 그 구조를 식별합니다.
- 세포 NADH의 형광도 및 HNPs에서 SH 동시에 취득 할 수있는 경우, 분자 흡수에 맞게 짧은 레이저 여기 파장 (즉, 720 nm의)을 설정합니다. 반 여기 파장에 중심 한 협 대역 통과 스펙트럼 필터 사용 (즉, λ = 360 ± 10 ㎚) SH를 검출하고, 또 다른 하나는 형광도를 검출하도록.
- 첫째 심장 클러스터의 전체 형태를 재건하고 여러 가지 볼 수 HNP와 클러스터 볼륨 내에서 이미지 평면을 선택하는 빠르고, 낮은 해상도, 입체 검사를 수행의.
- 필요한 경우 유용한 샘플의 광학 특성을 일치하도록 자유롭게 여기 파장을 변경하거나 IR 파장 (즉, 790 nm 정도)을 가진 조직을 깊은 광표백, 사진 손상 및 화상에 않도록하고 (즉, 395 nm의 따라서 제 고조파 필터 교체 ). 샘플에 증착 HNPs의 제 고조파 신호를 최대화함으로써 선택의 작동 파장에서 레이저 펄스 사전 압축기의 설정을 최적화.
- 실시간으로 심장 클러스터의 수축을 모니터링 두 가지 차원 영상의 고속 획득을 허용, 같은 공진 모드와 빠른 모드에서 현미경 광학 스캐너를 설정합니다.
- 같은 이미지의 대비와 수집 속도 사이의 최고의 타협으로 설정을 선택합니다 :
- 스캔 평균 : 4
- 픽셀 체류 시간 : 0.1 마이크로 초
- 이미지 속도 : 초당 4,125 프레임 (fps)
- 레이저 파워는 초점 스팟의에 따라 조정이지는 스캔 속도. (목적의 입구에서 측정) 50 mW의 0.1 마이크로 초 화소의 정지 시간 및 세포 생존 능력을 보존 계획 APO 20X NA 825 목적의 전형적인 값입니다.
5. 이미지 분석
- 축 보정 절차. 베어 기판에 증착 된 단일 HNP를 선택합니다. SH 강도를 극대화 (나노 입자의 축 방향 위치, 즉) 초점을 조정합니다. HNP의 함수로서 SH 강도 관한 검량선을 얻었다 현미경 스테이지의 축 방향 위치는 초점 평면으로부터 오프셋 제어 된 방식으로 변화한다. 계획 APO 20X NA 825 목적이 보정 절차의 출력은 그림 (c)에보고됩니다.
- 모든 비디오 프레임에 존재 HNPs를 선택하고 자신의주기적인 움직임을 결정한다. 이 절차는 쉽게 그 정의 된 영역에서 최대 신호 강도 반점을 추구하는 사용자 지정 코드로 예를 들어, 자동화 할 수 있습니다다른 프레임 사이를 연결 (이미지 처리 도구 상자의 '지역의 소품'기능을 사용하여 B를 Matlab을 R2009로 작성된 예제 코드은 제공됩니다).
- 비 연속적 추적 HNPs 단계 5.1에서 확립 검량선을 이용하여 축 방향 변위로 다른 프레임에 걸쳐 자신의 강도 변조를 변환함으로써, 광축을 따라 이동과 연관된 면외 변위의 정량 평가. 이 절차는 축 방향의 움직임에 대한 액세스를 제공하지만, 절대적인 방향 (위 또는 아래)를 결정하는데 이용 될 수 없습니다.
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Representative Results
이전 촛점 촬상함에 고해 활성을 평가하기에, PTFE 필터의 비선형 광학 응답의 신중한 특성화 고농도 (1 ㎎ / ㎖)에서 단독으로 또는 HNPs의 존재 하에서도 수행 하였다. ⅰ) 상기 베어 기판 이광자 여기 형광이 미약하며 관련 생물학적 시료 측정을 방지 할 수 있고, ⅱ) 절연 HNPs로부터 SH 방출 쉽게 에피 검출 모드에서 상기 기판을 촬상하여 취득 할 수있다 : 그것은 것이 보장되었다 (그림 2). 목표는 3 차원 변위의 정량화에 대한 참조 컨트롤을하는 것이 었습니다.
그림 3에서, HNP-표지 심장 구조와 교환 사채가 표시됩니다. 강렬한 푸른 SH 명소 격리 HNP에서 줄기 동안 빨강 (그림 3A), 노란색 (그림 3B 및 3C) 및 녹색 (그림 3D) 색상, NADH의 형광도에 해당합니다. 그것은 포에 흥미양자점과 같은 또는 상향 변환 나노 입자를 다른 나노 입자 기반 방법에 비해이 기술과 상대적으로 스파 스 라벨에 의해 달성 할 수있는 아주 좋은 광학 대조를 int로. 본 연구에서는 매우 강렬한 고립 된 레이블을 갖는 여러 개의 독립적 인 개별 입자의 움직임을 추적하고 줄기 세포에서 파생 된 구조의 집단적인 움직임을 재구성하기에 유리했다.
그림 3b는 HNP 표지 심장 박동 클러스터의 조각보기를 보여줍니다. 이러한 3 차원 구조는 다음이 경우, NP의 움직임을 확인하는 높은 수집 속도 비율을 유지하기 위해 영화 1에보고. 휴대 HNP 집합체의 수축 패턴을 모니터링하는 고속으로 기록 할 수 있고, 전체적인 취득 감도가 충분하지 HNPs에서 SH 방출과 함께 세포의 형광도를 기록.
이미지 분석의 응용 프로그램은 킬로그램의 섹션 5에 설명동영상 프레임의 앙상블에 적용 COL 개별 HNP 움직임 (방향, 평면 및 면외 변위, 주파수)에 대한 정보를 추출 할 수 있습니다. 이 분석 (도 4)의 결과에서와 면외 운동 (푸리에도 4b에 변환 참조) 동일한 심장 클러스터 내에서, 주파수가 일정하고 변위가 수 마이크로 미터의 차수이다 것을 나타낸다 (도 4a에 오 NP에의 예시적인 변위를 나타내는 화살표의 길이는 진동의 최대 신장에 대응).
그림 1. 심장 박동 클러스터로의 hESC의 분화와 차 고조파 이미징 현미경. Undifferentiate에 대한 HNPs 나노 입자와 라벨D의 hESC의 식민지 (A)는 1) StemPro EZPassage 도구 (B)를 사용하여 작은 조각으로 삭감 불규칙한 사채 (C)을 형성 정학하게, 또는 2) 단일 세포로 해리와 Aggrewell 시스템 (B를 사용하여 다시 클러스터 중 하나를했다 ) ') 일반 사채 (C를 형성하는'. 교환 사채 (C 또는 C ')의 두 가지 유형의 정지에 2 일 동안 배양 한 후 젤라틴 코팅 접시에 부착. 심근 (D)의 클러스터를 잔은 수동 공기 - 액체 3D 문화 (F와 F ')을 할 수 있도록 삽입에 증착 된 PTFE 필터에 메스 배양 (E)를 사용하여 해부했다. (패널 A의 스케일 바, B, B' , C와 C ': 100 μm의, 패널 D와 E를 위해 :. 250 μm의) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
혼자 PTFE 필터의 그림 2. PTFE 기판의 광학 특성. (A) 밝은 필드 이미지. 이 제어 계측 (13 MW)에 적용 다소 높은 레이저 강도에 비해 약한 형광을 표시하는 PTFE 필터의 (B) 두 개의 광자 이미지. (C 및 D) 상기 베어 기판에 1 ㎎ / ㎖ 농도에서 HNPs 함유 물 방울을 첨가 한 후, 그 SH 방출 간단 비교적 낮은 레이저 강도 (2 MW)에서 필터를 통해 획득 될 수있다. D에서, 필터에 확산 나노 입자의 3D 이미지가 표시됩니다. (스케일 바 : 50 ㎛).
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HNP의도 3. 다 광자 이미징. 심장 구조 및 사채를 라벨 (A) 고동 클러스터의 이광자 형광 신호는 적색으로 표시되며 HNPs로부터 SH 신호는 청색으로 도시되어있다. 색은 다른 스펙트럼 필터를 탑재 사 nondescanned photomultipliers 의해 측정 강도에 대응한다. (블루 395 ± 11 nm의 녹색, 485 ± 20 nm의 노란색, 531 ± 40 nm의, 그리고 빨간색 607 ± 70 nm 정도). 이 클러스터는 720 nm의 8.8 ㎿가 평균 전력의 여기 파장을 가진 10X의 목적으로 PTFE 다공성 필터를 통해 직접 이미지화했다. (B) Z-스택에서 추출 된 HNP 레이블 심장 구조의 조각보기. (C) EB는 PTFE를 통해 이미징 (A, B 및 C에 대한 스케일 바 : 100 μm의). apoch를 사용하여 Z-검사에서 재구성 HNPs으로 표시 EB의 (D) 3D 이미지,이 romatic 40X NA 1.25 침수 목적 (스케일 바 : 50 ㎛). HNPs 잘 움직임 분석을 허용, 전체 EB와 심장 클러스터에 퍼져있다.
그림 4. 박동 클러스터 및 평면 HNPs 변위 (검은 색으로 표시 SH 신호)의 vectorial 분석의 영화 (A) 개별 프레임. 화살표의 길이는 진동의 최대 신장에 대응한다. (B) 푸리에 같은 심장 클러스터 내에서 주파수에 대해 일정 보여주는 NP에 진동의 변환 기능 (블랙 라인)과 운동 (오렌지 점선)의 평면 아웃 0.4 Hz로 대응한다. 축 방향 변위에 HNP 강도를 변환하는 데 사용 (C) 교정 곡선 (제자의 섹션 5를 참조하십시오ocol). 원 : 실험 데이터 포인트.
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Discussion
줄기 세포 연구에 나노 기술의 응용 프로그램은 비교적 새로운하지만 빠르게 확장 필드입니다. 주제에 대한 다양한 리뷰 기사에서 지적한 바와 같이, 나노 입자의 사용은 적어도 창조의 단백질 및 유전자의 세포 내 전달에, (시험 관내 및 생체 내에서 모두) 추적 세포에 이르기까지 다양한 연구 작업을 수행하기 위해 적용 할 수있는 특정 분화 우선 자극 / 억제를위한 생체 모방 세포 환경은 19, 20를 경로. 적외선 음원의 사용 가능성을, 형광 기반 기술에 대하여 증가 된 투과 깊이에 이르게되지만이 프로토콜에서 설명한 방법은, 광 추적 및 제한된다; 광학 영상은 몸 전체로 확장 될 수 없으므로 자기 검출부 (21)에 의해 보완 될 것이다. 이전 출판 작업은 몇 가지 방법이있는, 심장 세포 클러스터의 구조와 움직임을 평가했다형광 염료 (22), 양자 점 (23, 24)에 의해 cluding에 라벨은 슈퍼 성체의 산화철 나노 입자 (25), 최대 변환 형광 입자를 26 ~ 28. 이러한 나노 프로브에 대한 HNPs의 장점은 오랜 시간 동안 증가 이미징 침투, 형광도에 대한 대비가 증가에 대한 파장 조정 기능을 통해 표백의 부재와 연관되어 있습니다. 이 방법에 의해 얻은 독특한 스파 스 셀 라벨 (즉, 그림 3D에서 우리는 100 μm의 측면 큐브에서 약 160 NPS를 계산) 잘 높은 공간에 3D 인간의 ESC 파생 심장 클러스터에서 세포의 수축을 추적하는 데 가장 적합한 것으로 밝혀 해상도.
나노 물질의 선택은 PEG-피복 KNbO 3에 한정되지 않고, 아마도 다른 functionaliti를 통합 할 수 noncentrosymmetric 결정 구조를 표시하는 나노 입자의 다양한 패밀리를 포함 할 수ES (자기 방사성) 다중 모드 감지를 허용한다. 또한, 이러한 PEG 코팅 HNPs 더 구체적으로 선택적으로 특정 세포 모집단을 대상으로하기 위해 항원 또는 결합 단백질에 대항하는 작용 할 수있다. 한편, 여기에서 제안 된 촬상 방식은 초고속 레이저 광원을 탑재 한 주사 현미경을 필요로한다. 이 작품에서 예상 할 수있는 자연적인 추적 관찰이 연장 된 기간 동안 이식 세포의 결합과 기능을 수행하기 위해, 시험 관내에서 추가로 기본 조직으로 3D 바이오 물질 및 비계 구조로 표시된 셀의 통합을 모니터링한다.
필터가 오염의 위험없이 지원 확대 그들의 인서트 복원 할 수있는 3D 집계 베어링 PTFE 필터를 사용하는 이점은, 우리의 경우에서와 같이, 일 주간 동안 다수의 측정을 수행 할 수있는 가능성이다. 더 중요한 것은, PTFE 필터는 (은) 액션 냄비의 반복적 인 평가를 가능하게다중 전극 배열을 사용 entials.
근적외선의 다중 광자 여기 대 세포 손상 임계 값은 이전에 니크 등 29 미만인 하나 TW / cm 2로 결정되었다. 우리의 연구에서, 825 NA 20X 목표를 사용하여 적용 강도는 코 니크의 작품 (80 마이크로 초)에 비해 TW / ㎠ (0.26 TW / ㎠) 및 짧은 화소 체류 시간 (0.1 마이크로 초)에서 유지 가능성을 보장합니다 살아 차별화 샘플을 보존하기.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
저자는 유럽 FP7 연구 프로젝트 NAMDIATREAM (NMP4-LA-2010-246479, http://www.namdiatream.eu) 및 INTERREG IV 프랑스 - 스위스 NAOMI 프로젝트에서 일부 자금을 인정하고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope Incubator | OKO LAB | UNO package (top stage) | 37 °C, 5% CO2, moisturized |
| Multiphoton microscope | Nikon | AR1-MP | |
| Fast scanning, four nonphotomultiplier descanned detectors | |||
| Filters SHG and autofluorescence | Semrock | FF01-360/12-25 | |
| FF01-395/11-25 | |||
| FF02-485/20-25 | |||
| Microscope objectives | Nikon | ||
| CFI Plan Fluor 10X | NA 0.30, WD 16 mm | ||
| CFI Plan Apo 20X | NA 0.75, WD 1.0 mm, VC | ||
| CFI Apo 40X | NA 1.25, WD 0.18 mm λS, Nano-Crystal Coat | ||
| Rhock inhibitor | Sigma | Y-27632 | |
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829 | |
| Knockout Serum | Invitrogen | 10828 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 1140 | |
| L-glutamine 200 mM | Invitrogen | 25030 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| Roller scraper tool | StemPro EZPassage, Invitrogen | 23181-010 | |
| StemPro Accutase | Gibco | S11105-01 | |
| Aggrewell system | StemCell Technologies | 27845 | |
| Hyclone serum | Thermo Scientific | SH30070.03 | |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| 6-well plates | Falcon | 353046 | |
| 24-well plates | Nunclon | 142475 | |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) filters | Millipore | NA76/25 | |
| Inserts | Millipore | PICM03050 |
References
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