Summary
偏光ベース全内部反射蛍光顕微鏡（pTIRFM）は、細胞膜動態のリアルタイム検出を可能にする。この記事では、調節性エキソサイトーシスの間に膜のリモデリングの研究のためpTIRFMの実装について説明します。技術は、直接的または間接的に、膜形状の変化を伴う細胞生物学における他のプロセスに一般化である。
Abstract
エキソサイトーシスのダイナミクスに新たな知見を得るために、我々のグループは、正確に小胞と原形質膜の融合の間に調節されている必要があり、脂質二重層形状の変化に焦点を当てています。これらの迅速かつ局所的な変化は、脂質及び膜の曲率を制御する特殊なタンパク質間の動的な相互作用によって達成される。このような相互作用が存在しない場合にのみ、小胞融合に壊滅的な結果を持っているが、膜形状の制御を伴う他の細胞機能のホストではないでしょう。近年では、膜成形特性を有する多くのタンパク質の同一性が決定されている。何が不足して残っていることはいつ、どこで、どのように融合し、コンテンツのリリース進捗状況として機能のロードマップである。
膜のリモデリングを可能にする分子事象の理解は、歴史的に曲率を膜またはTracのに時間分解能を持っているに敏感な分析方法の不足によって制限されていた急速な変化をk個。 PTIRFMは、これらの基準の両方を満たしている。私たちは、pTIRFMが高密度コア小胞（DCV）融合時のクロム親和細胞膜の配向性が急速に、サブミクロンの変化を視覚化し、解釈するために実装されている方法について説明します。我々が使用するクロム親和性細胞は、ウシ副腎から単離される。膜は、親油性カルボシアニン色素で染色し、1,1 ' - ジオクタデシル-3,3,3'、3'-tetramethylindodicarbocyanine、4 - クロロベンゼンスルホン酸、またはDIDれる。 「固定」向きで膜面内でのインターカレーを行なったし、エバネッセント場の偏することに敏感である。染色されなかった細胞膜は、561 nmレーザー（p偏、S偏）の直交偏光で順次励起される。 488nmレーザーは、融合の瞬間ベシクル成分および時間を可視化するために使用される。エキソサイトーシスは、局所的脱分極KCl溶液で細胞を灌流によって誘発される。解析は、どうやったのかを理解するためのカスタム書かれたソフトウェアを使用してオフラインで実行されている発光強度の変化は、融合細孔拡張に関する。
Introduction
エキソサイトーシスの適切な実行を正確編成されるように膜二重層形状の極端な変化を必要とします。融合の前に、顆粒の下で原形質膜の局所的な曲げは、二重層の相互作用のためのエネルギー障壁を低減するために部分的に生じる。膜は、マージ、後に、曲率の高い領域が生成され、安定化されなければならない。最後に、融合した膜は融合孔を拡大し、コンテンツのリリース1を有効にするには、彼らの初期形状から曲げられている必要があります。一人で膜はこのような劇的な協調変化を受ける可能性は低いであるため、タンパク質は、イベントを仲介するために必要である。しかし、どのように彼らが融合プロセスの間に膜トポロジーの変化に影響を与えるように作用することは非常に多くの未解決の問題のまま。
インビトロモデルにおける優れた、膜の曲率を可視化するために存在する。ネガティブ染色EMの使用は、例えば、二つの主要な人身pのアクションのために現在の分子モデルを整形するために重要であったroteins -シナプトタグミンとダイナミン（レビューのために、チャップマン2とヘンショー3を参照）。エキソサイトーシスのほとんどリアルタイムのアッセイは、直接の曲率を検出しない。その代わりに、湾曲は内腔の貨物リリース4-8または膜面積9月11日の変化の動態について報告したアッセイから推測されます。 PTIRFMは、膜の微細形態の変化の直接的なリアルタイム測定を可能にすることによってin vivoおよびin vitro試験の間のギャップを埋める。
PTIRFMは、非結像モードでは、モデル膜12内に組み込まれたNPD-PEの配向を測定するために、アクセルロッドらによって開拓された。技術は、次いで、DIIおよびFM1-43で標識された13-18生細胞の動的変化を視覚化するために適用した。 （入射面に垂直な方向）（入射面内）のp偏光とs偏光：pTIRFMでは、2つのエバネッセント場の偏光を順次膜に埋め込まれたプローブを励起するために使用されている。イメージングの前に、プローブが - この場合には、DID - 簡単に細胞外培地に添加され、研究されるべき細胞の原形質膜内にインターカレートさせる。膜は（膜フリルやインデントのように）カバーガラスに非平行である地域では、インクルードも非平行になりました。したがって、このような領域は、p偏光により励起可能であろう。 p偏光が少なく効果的に大部分がカバーガラスに平行であるメンブレン領域で行った励起する。ピクセル対ピクセル比画像（P / S）ですので、特に膜変形の領域をハイライト表示されますDIDの順次P-及びS-POL励起からの放射に関するレポート。理論的には、P / S比の画像が感受性であるコンピュータシミュレーション18によって予測の変化の振幅がカバーガラスから原形質膜偏差の小さな角度である。P / S画像はまた、カバーガラス表面からのフルオロフォアの距離に独立しており、そして地元の蛍光団濃度。ローカルフルオロフォア濃度の代わりにP放出と2回S放出（P +2 S）のピクセル対ピクセル和について報告した画像によって提供される。 P 2 S測定は、いくつかの、ほとんど、あるいは全く変化が可能で、インデントの正確な幾何学的に敏感である。これは（ つまり、狭い首）の早期から、後の状態16,18への融合細孔のモデルの遷移コンピュータシミュレーションによって示すことができる。 P狭い首を経由して、細胞膜に付着し融合した小胞の2、S（と、より、インタフェースに近いDID）（はるかに広い毛穴との融合小胞のそれよりも、例えば、大きいことが予測される場合DID）エバネッセント場の最も暗い部分の中にある。
この記事では、我々はpTIRFMが実装され、融合細孔拡張中に発生する膜状の急速な、局所的な変化を研究するために利用される方法について説明します。唯一つのアプリケーションは、明示的にディですがscussed、本方法は、直接的または間接的に、膜のリモデリングが関与する他の細胞の生物学的プロセスの様々な一般化である。
Protocol
1。 PTIRFシステムのセットアップ
pTIRFM技術は倒立顕微鏡プラットフォーム上に構築されています。レーザビームがサイド照明ポートと無偏側に面するフィルターキューブを介して導かれ、次いで60X 1.49 NA TIRF対物レンズの後焦点面に集束される。顕微鏡とEMCCDカメラ間の発光パス内の二つの追加のレンズ（1.6Xと2X）は、約80nmの最終的なピクセルサイズを与える。レーザビームは、落射、全内部反射（TIR）照明との間の高速スイッチングを制御するためのソフトウェアガルバノミラーを用いて案内される。以下に説明されたプロトコルは、TIRF用の光学系は既に蛍光体の励起およびイメージングのための最適な位置にエアテーブル上に配置されていることを前提としています。なお、偏光光学系は、細胞膜変形の撮像を可能にするために、既存のTIRF顕微鏡セットアップに追加する方法が記載されている。 TIRとpolarizatの両方を生成するための我々の研究室の光学セットアップの概略イオン系TIRは、 図1Aに示されている。プロトコルはカルボシアニン色素のイメージングのための蛍光小胞タンパク質の励起用488 nmのレーザーを使用し、561 nmのレーザーを想定して、やった。
- すべての顕微鏡部品、レーザー、およびコンピュータの電源を入れます。
- 図1Aに示すように、1.49 NAレンズの後焦点面（BFP）に488nmレーザーからのビームを向ける。レーザビームがBFPに焦点を当てている場合には、コリメート出現し、直接対物上の天井に小さな明確に定義されたスポットとして現れる。
- Xガルバノミラー（等価試料面内に配置ミラー）を調整するようにレーザビームが軸から外れて移動し、対物正常に徐々に急峻な角度で、対物レンズから出射される。
- 次に、TIRが達成されることを確認します。ガラスボトムディッシュのPSSの1ミリリットルの容積に蛍光マイクロスフェアの10μlを加える。 O底のマイクロスフェアからの蛍光のみ皿fは、TIRインターフェースに最も近い、検出されるべきである。浮遊微小球の検出は、入射光と対物法線間の角度が不十分であることを示している。
以下のセクションでは、偏光ベースのイメージングのために必要な光学部品のセットアップについて説明しています。 - それは、同一の光路に沿って走行しているので、ガイドとして整列488nmの光を用いて、生の561 nmのレーザービームの位置を調整する。 561 nmのレーザーは、カルボシアニン色素の画像化のために使用されなかった。
- 561 nmのレーザーの下流発散レンズやミラーを挿入します。それは488nmのビームスポットでcoalignedされるようにミラーを用いて、ビームを調整するガルバノミラーが「0」位置にあるときに、天井に焦点が合っている。
- レーザ開口部のすぐ下流のビーム経路内に四分の一波長板（QW）をセンタリング。無彩色又は励起波長に調整のどちらかであるQWを使用してください。QWは、円光軸と45度の角度で入る任意の直線偏光を偏光します。このような偏光キューブなどのいくつかの光学部品は、偏光の一方の軸に向かって減衰バイアスを有する。 QWは、このバイアスを補償するために回転させることができる。この調整は、楕円偏光になります。それは開口部から現れるように、レーザービーム自体が非常に直線的に（垂直に）偏光されるので、QWが必要である。
- 楕円偏光の下流偏光キューブ（PC1）を配置します。偏光キューブは、電場の垂直（y）の成分を反射し、水平方向（x）の成分を通過させる。偏光キューブは、偏光ビーム経路の後続の位置合わせを容易にするために、小さな並進ステージ上に載置される。
- ビームを再結合するために第2の偏光キューブ（PC2）とミラー（ 図1A）を使用してください。
- 第一の偏光キューブ（PC1）と垂直CO間のシャッターを配置mponentミラー。水平成分ミラーと第二の偏光キューブ（PC2）との間の第2のシャッターを配置します。これらのシャッターは、急速に、ビームの偏光との間でユーザが選択することを可能にする画像化ソフトウェアによって制御される。
- 各ビーム経路内の電界の向きを確認するために、偏光フィルタを使用する。偏光フィルタは、フィルタの軸に沿って伝送できるようになります。
- レーザービームの垂直方向と水平方向の構成要素が互いに488 nmのビームの位置が合っていることを確認します。必要に応じて調整を行います。 3ビームは、すべてBFPに焦点を当て、天井上の同じスポットに客観からの平行出現する必要があります。この場所は、将来の位置合わせを容易にするためにXでマークすることができる。
- 目的にイマージョンオイルの滴を配置します。客観的に（上記の手順4を参照）蛍光マイクロスフェアを含む皿を置きます。
- Xガルバノミラーを移動させることにより、TIRを入力してください。 TIR、垂直componen中ビームのTは、S-POLで、ビームの水平成分は現在、P-POLである。 QWプレートを回転させることによって、ビーム間の相対的な強さを調整します。ランダムに配向されると予測されているローダミンサンプル、各偏光エバネッセント場を表示します。平均ピクセル強度に合わせて、QWプレートを回転させます。必要に応じて、その強度を減衰させるために一方の偏光路内に減光フィルタを追加する。
2。クロマフィン細胞の単離
仔ウシ副腎髄質から健康な細胞を単離するための手順を以下に提供される。それはウィック、Senter ら 19及びオコナーによって以前に公表されたプロトコールから適合され、Mahata ら 20の単離後、細胞をエレクトロポレーションシステムを用いて、目的のプラスミド（単数または複数）で電気穿孔されている。所望の蛍光タンパク質を発現する細胞の20〜30％で、このシステムが得られる。典型的には、細胞の70％が生き残るエレクトroporationプロセス。 PSSおよびメディアコンポーネントの詳細は、表2,3、および4に設けられている。
- 二日間、細胞準備の前に、1.25ミリリットルのウシのコラーゲンが続く1ミリリットルポリ-D-リジン（0.1ミリグラム/ ml）で35 mmの光学品質ガラスボトム（厚い0.17ミリメートル）の料理を扱う。組織培養フード内で空気乾燥の料理にしておきます。
- 食肉処理場から牛副腎を取得します。彼らは研究室に戻って運ばれている間、氷上で腺を保つ。ウシ副腎、脂肪の厚い層に包まれてもよい。余分な脂肪を除去し、副腎静脈開口部を露出させ、外科はさみを使用してください。腺が血をパージされるまで取-PSSと静脈を灌流。
- 次に、ゆっくり腺が膨潤するまで静脈口にTH-PSS溶液2 mlをピペット。 15分間37℃で膨張した腺をインキュベートする。 TH-PSS処理を繰り返して、再度インキュベートする。
- sの腺のエッジの周り外側副腎皮質を切断cissorsと髄質が露出するように離れて腺の皮をむく。優しくこすりおよび皮質組織から髄質を分離するために、メスを使用しています。
- 5〜10分間、メスの刃一対の髄質をミンチ。
- 最終的な消化ステップは、個々のクロム親和性細胞を単離することが必要である。スピナーフラスコに切り刻み、細胞懸濁液を注ぐ。部分的にTL-PSS（15ml）中のTH-PSS（30ml）中の2:1の比率でフラスコに充填し、約100rpmで回転させながら37℃で30分間インキュベートする。
- 400μmのメッシュを通して濾過することにより、未消化の組織から個々のクロマフィン細胞を分離。ろ液を収集します。細胞をペレットに200×gで遠心分離し、氷冷したPSSの中で再懸濁します。
- 250ミクロンメッシュ、ペレットを通して細胞をフィルタリングし、最後に（ステップ2.9参照）エレクトロポレーション緩衝液に懸濁します。
- 血球計数器を用いて細胞をカウントし、トランスフェクションのための準備。
- に応じてエレクトロポレーションシステムを用いて細胞をトランスフェメーカーの推奨。エレクトロポレーションのための正確な条件は、経験的に決定されなければならない。注：牛クロム親和性細胞のこの準備のためのトランスフェクション効率と細胞生存率の最適なバランスを提供する設定は1100 V、40ミリ秒、および1パルスである。私たちは、これらの条件で、細胞の20〜30％がトランスフェクトされると推定している。細胞の約30％は、エレクトロポレーションプロセスを生存しない。
- 優しくポリ-D-リジンおよびコラーゲン上のプレートの細胞を温めたエレクトロポレーションメディアの1ミリリットル中に料理を処理した。
- 37℃のインキュベーター内に皿を置き（5％CO 2）。 6時間後に、各皿に2倍の抗生物質培地1mlを加える。次の日、通常のメディアにメディアを変更します。
- クロム親和性細胞は、典型的には、エレクトロポレーション後2〜5日結像される。
3。 pTIRF画像取得
- イメージングシステムの電源をオンにし、収集ソフトウェアを起動します。
- レーザーが合っていることを確認します。エバネセントを確認してください微小球を使用してフィールドのプロファイル。
- グローバルとローカルの灌流システムを準備します。フィルタ処理、脱イオンH 2 Oでクリーンなソリューションの貯水池や、基礎とPSSソリューションを刺激で満たされる。
- クロム親和性細胞を画像化する前に、P-polおよびS-POL励起は視野の同じ領域を照らす照明強度がほぼ同等であることをことを確認してください。これを行うために、10mMの最終濃度のローダミンを含有する2mlのPSSを有するガラスボトムディッシュを埋める。順次P-polおよびS-POL光でローダミンサンプルを励起して画像を取り込む。実際には、DIDからPおよびS排出量はPとSローダミン排出量の平均値に正規化される。詳細は画像解析と考察のセクションを参照してください。
- 今やったウシクロム親和細胞を染色に進みます。クロマフィン細胞を含むディッシュから培養液をすすぎ、基底-PSSの2ミリリットルと交換してください。 10 mMと10μl加え（エタノールで希釈）DID直接細胞を含む料理に。静かに2月10日秒間の料理を攪拌し、DID + PSS溶液を除去します。
- 残留を除去するための基礎-PSSと、皿3〜4倍をした洗います。セルは現在、染色し、使用する準備が整いました。
- 客観的にイマージョンオイルの滴を追加します。対物レンズの先端た上で染色されたクロム親和性細胞を含む皿を置きます。
- 対物レンズを通して、またはカメラのいずれかの皿を見て、目的のタンパク質トランスフェクトし、DIDで染色された細胞を見つける。よく染色された細胞は、鮮やかに、セルのエッジを強調するP発光を示す; S放出は、細胞のフットプリント（ガラスに付着し、TIRFで画像化されたセルのすなわち地域）全体で略均一にする必要があります。
- それはおよそ100ミクロン離れてセルからなるように、地元の灌流針を配置します。
- 細胞膜に焦点を当て、すぐに細胞刺激/画像取得の前にオートフォーカスハードウェアを有効にします。</李>
- 画像収集を開始します。基礎溶液を用いて10秒間細胞を灌流した後、脱分極56のKCl溶液で60秒間。急速に561 nmのp偏間シャッタながら画像を取得、561 nmのS-POL（Pの変化やDIDのS放出を監視するため）および（画像トランスフェクトベシクルプローブに）488nm励起。実験中に取得された画像の例を図2および図3に示す。
4。画像解析
画像処理用の計算は、ImageJを用いて行ってもよいが、そのようなIDLやMatlabのような柔軟なプログラミング言語内のスクリプトを利用して大幅にタスクを自動化することによって、分析のスループットを増加させることができる。 2種類の画像は、生の放射画像から位相的な情報を得るために計算されなければならない- 。、P / SとP 2 S、P 2 Sの合計が所定の領域内の総膜色素を報告しながら、P / Sはローカル膜の変形について報告フィールドの。
- すべての画像は、背景は差し引かれるべきである。オフ - セルROIを選択ROI内の平均ピクセル強度を測定し、次いで、画像スタック内の全ての画素からその値を減算する。
- 、P / Sを計算し、その後の「S」排出枠（画素間）でそれぞれ「P」排出枠を分割する。、P / Sは、PとS-POL励起の相対強度、中の偏りに応じて変化する光学系と、干渉縞。これらの影響を低減することから得られるからP / S比を正規化し、10mMのローダミン18を含有する溶液を用いて得られた比に発光しなかった。
- 個々のDCVSのエキソサイトーシスは、シナプトタグミン1 pHluorin（ 図2B）などの蛍光小胞タンパク質の強度の急激な変化から明らかである。 P / Sの局所的増大する上に中心が240nm半径ROI内のピクセルを平均化することによってP / S及びP +2 Sの変化を決定するエキソサイトーシスのサイトでの比率。融合は、P / Sで明らかに増加させることなく発生すると、ROIが定着DCVの領域にわたって中央に表示されます。
- コンピュータシミュレーションは、拡張する融合細孔の単純な幾何学的形状の観点からP / S及びP +2 S膜強度変化を解釈するために行うことができる。シミュレーションの詳細は、Anantharam らを参照してください。18
Representative Results
従来の偏TIRFMイメージング技術は、同じエアテーブル上に実装される。光学要素の構成は、励起光が偏光される主な違い（ 図1A）と、同様である。偏光を優先的偏光方向の吸収双極子を有するフルオロフォアを励起する。 pTIRFMが膜トポロジの変更を監視するのに有効であるためにこのように、使用されるプローブは、固定された配向膜中にインターカレートしなければならない。蛍光カルボシアニン色素膜面（ 図1B）の遷移双極子配向した方法で脂質二重層にインターカレート（DIIは、DID）。 DID標識された膜のP偏光照明（ 図1C）は、選択的にカバースリップ斜め蛍光プローブ（ 図1Bおよび1Dに赤）を励起する。
クロマフィン細胞のあふれんばかりの膜標識はAB後に達成されるDIDに=リーフインキュベーション。 図2Aはよく染色され、細胞膜の例を示しています。健康で、接着細胞は、PとSの排出量の明確な違いを示すことになる。 P発光イメージは、細胞の他の部分に関して明るいセルの枠線が表示されます。 S放出画像は、セルのフットプリントにわたって略均一な蛍光を示す。算出された画素から画素P / S及びP +2 S画像がそれぞれ、膜曲率および色素濃度に敏感である。示さクロム親和細胞も分泌小胞（ 図2B）を標識するためにシナプトタグミン1 pHluorin（SYT-1）でトランスフェクトされている。
クロム親和性細胞は、細胞膜を脱分極し、エキソサイトーシスをトリガーするために56 mMのKClで刺激される。鮮やかな蛍光SYT-1 pHluorinスポットの数が急にDCVSヒューズ（ 図2B、右パネル）として明らかになる。白いボックスは1融合事象（ 図2B、右パネル）の周りに描かれている。この融合事象iは図2C及び2Dにおいて分析。■。 図2Cは、SYT-1-pHluorin、P / S、及びP +2 Sの画像強度におけるフレーム単位の変化を示す。タンパク質は、融合部位（ 図2D）から離れるように拡散するSYT-1の蛍光強度は急速に低下する。融合した小胞/細胞質膜複合体を表す字下げは比較的遅い速度（ 図2Dのグラフ注）で減少する。イラスト（ 図2E）は、これらの測定の1の解釈を示している。
図2に示され、迅速かつ局在化した膜の変形は、刺激誘発性Ca 2 +流入の結果である。これは、 図3Aに示されている。クロマフィン細胞は、遺伝のCa 2 +指示薬GCaMP5G 21,22でトランスフェクションし、56 mMのKClで刺激される。膜脱分極は、（GCaMP5G蛍光の有意な増加を引き起こす
/ files/ftp_upload/51334/51334fig1.jpg "/>
図1。 pTIRFM技術のためのイラスト。 A）偏光ベースTIRFイメージング、従来組み合わせるための概略が示されている。四分の一波長（QW）プレートは、楕円レーザビームを偏光さ561 nmのサファイアレーザの前方に配置されている。偏光キューブ（PC1）は線形（v）の垂直方向と水平方向の（h）の成分に偏光を分離するために使用される。垂直および水平成分は、TIR面で、それぞれp-polおよびS-POL励起ビームになる。 P-polおよびS-POLパスは独立して（S1およびS2）をシャッターしている。これらは、ミラーと第二の偏光キューブ（PC2）と再結合する。これらは、ビームステアリングミラー素子からなるダイクロイックミラーを無偏（DC）を介して（また、独立して、シャッターS3）488nmのビームに参加。レンズ（L）は、ビームを拡大し、集束するために使用される。組み合わせた488-nmおよび561 nmの光は、ガルバノ経由顕微鏡のサイド照明ポートに操舵される計ミラー（GM）。彼らは、客観の後焦点面（BFP）に焦点を当てています。フルオロフォアから放出される光子）がPC。Bに接続されたEMCCDカメラで捕捉されなかった標識を簡単に過剰を除去し、洗浄を繰り返し色素で細胞をインキュベートすることによって行われる。おおよその膜面内での遷移双極子モーメントを有する膜内にインターカレートした。C）発生率（p偏）の面に偏光した入射光は、図示のように、界面に垂直な主に偏光されるエバネッセント場を生成する。D） p偏光で標識されなかった膜の照明を選択的にカバーガラス斜め（RED）は、それらのフルオロフォアを励起する。これは、s偏光のエバネッセント場であった場合には、カバーガラスに平行なフルオロフォアは、それらの代わりに（BLACK）で励起されるであろう。
図2。 pTIRFMで細胞膜変形を監視 > trong。 A）を算出P / S及びP +2 S放出画像と共に下流P及びSの発光画像が示されている。スケールバー、3.2以下である。B）SYT-1 pHluorinを発現しているクロム親和細胞をKClで脱分極されている。明るく蛍光スポット（右パネル）の数は、個々のDCVSの融合を示している。溶断SYT-1 pHluorin DCVのスケールバー、3.2以下である。C）コマの画像。 （画像上）の時間は秒単位です。時間0は、DCVの融合前のフレームを指定します。対応するP / S及びP +2 S発光画像も示されている。 。。融合フレームE）をCとDの結果の一つの可能な解釈が示されている-スケールバーは1μmであるD）のグラフで点線ラインの画像では、時間0である。 「ブランク>この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図3。変形は、刺激誘発性Ca 2 +流入の結果である。 A）GCaMP5Gでトランスフェクトされたクロマフィン細胞を56 mMのKClで脱分極している。 GCaMP5G蛍光が増えるので、subplasmalemmalのCa 2 +レベルの上昇を意味します。B）画像上のAのタイムズのセルの30×20画素領域のコマの画像が数秒である。白い矢印は、P / S増加とP 2 S減少する領域を示している。細胞質ゾルGCaMP5Gタンパク質は定着DCVによって領域から除外される。 Bに示した画像のスケールバーは1μm。C）グラフD）B及びCの結果の一つの可能な解釈が示されている。3highres.jpg "ターゲット=" _blank ">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
| iXon3 EMMCDカメラ | アンドール | 897 | |
| IX81倒立顕微鏡 | オリンポス | サイドマウントFiltercube総会 | |
| 43シリーズのArイオンレーザ | CVIメレスグリオミレスレーザーオプティクス | 543-AP-A01 | 488 nmまで同調可能 |
| 561 LPダイオードレーザーサファイア | コヒーレント | 561 nmの | |
| ガルボミラーシステムのスキャン | ソーラボ | GVS102 | |
| VCの3チャンネル焦点灌流システム | ALA科学機器 | ALA VC3X4PP | |
| QMMクォーツMicroManifold | ALA科学機器 | ALA QMM-4 | <TD>|
| 10 PSI圧力レギュレータ | ALA科学機器 | ALA PR10 | |
| マニピュレータ | バーリー | TS 5000-150 | |
| クロマティック四分の一波長板を搭載し | ソーラボ | AQWP05M-600 | |
| 420から680 nmの偏光ビームスプリッタキューブ | ソーラボ | PBS201 | |
| 六駅ニュートラルデンホイール | ソーラボ | FW1AND | |
| ステッピング·モータ駆動SmartShutter | サター楽器 | IQ25-1219 | |
| HQ412lpのダイクロイックフィルタ | 彩度 | NC255583 | 488 nmおよび561 nmの光を結合します |
| コーティングされた平凹レンズ | エドモンド·オプティクス | 原子炉格納容器100ミリメートルVIS 0 | 488 nmの光を発散する | コーティングされた平凹レンズ | エドモンド·オプティクス | 原子炉格納容器250ミリメートルVIS 0 | 561 nmの光を発散する |
| コーティングされた平凸レンズ | エドモンド·オプティクス | PCX 125ミリメートルVIS 0 | 両方のビームを集束させる |
| コーティングされた平凸レンズ | エドモンド·オプティクス | PCX 50ミリメートルVIS 0 | フィルターキューブアセンブリに接合 |
| z488/561rpc二色 | 彩度 | z488/561rpc | Filtercubeダイクロイッ |
| z488/561_TIRF発光フィルター | 彩度 | z488/561m_TIRF | Filtercube放出 |
| UIS2 60X目的 | オリンポス | UPLSAPO 60XO | NA 1.37 |
| ネオントランスフェクションシステム | インビトロジェン | MPK 5000 | |
| をMetaMorphイメージングソフトウェア | 分子デバイス | ||
| のDiI膜色素 | インビトロジェン | V-22885 | アライメントの目的のために |
| THリベ | ロッシュ | 5401135001 | |
| TL Liberse | ロッシュ | 5401020001 | |
| ウシからなDNase IタイプIV | シグマ | D5025 | |
| 血球計 | フィッシャー | 0267110 | |
| 膜色素はDID | インビトロジェン | D-7757 | |
| ローダミン | インビトロジェン | R634 | |
| 0.22μmの膜シリンジフィルターユニット | ミリポア | SLGS033SS | |
| Fluoresbrite多色レッドマイクロスフェア | ポリサイエンス | 19507 | 0.5ミクロン |
| 液浸油シグマ | 56822 | ||
| LabVIEWの | ナショナルインスツルメンツ | コントロールガルボミラー | |
| スピナーフラスコ | ベルコ | 1965から00250 |
表1。 pTIRF顕微鏡装置。
| 中身 | プレップ-PSS | 基礎-PSS | スティミュラス-PSS |
| NaClを | 145 mMの | 145 mMの | 95 mMの |
| 塩化カリウム | 5.6 mMの | 5.6 mMの | 56 mMの |
| 塩化マグネシウム | - | 0.5mMの | 0.5 mMの |
| 塩化カルシウム | - | 2.2 mMの | 5 mMの |
| HEPES | 15 mMの | 15 mMの | 15 mMの |
| pHは | 7.4 | 7.4 | 7.4 |
| グルコース | 2.8 mMの | 5.6 mMの | 5.6 mMの |
| ペニシリン - ストレプトマイシン | 1X | - | - |
表2。灌流およびクロム親和細胞プレップソリューションを提供しています。
| 中身 | エレクトロポレーションメディア | 通常のメッキメディア | 2X抗生メディア |
| 1X DMEM/F-12 | 1ミリリットル/プレート | 2ミリリットル/プレート | 1ミリリットル/プレート |
| FBS | 10パーセント | 10パーセント | 10パーセント |
| シトシンアラビノフラノシド（CAF） | - | 10 mMの在庫からの1μL/ mlの | - |
| ペニシリン | - | 100単位/ ml 200単位/ ml | |
| ストレプトマイシン | - | 100μg/ mlの | 200μg/ mlの |
| ゲンタマイシン | - | 25μg/ mlの | 50μg/ mlの |
表3。クロマフィン細胞培地。
| 中身 | TH-PSS | TL-PSS |
| THリベ | 2ミリリットル | - |
| リベTL | - | 0.85ミリリットル |
| プレップ-PSS | 98.0ミリリットル | 84.0ミリリットル |
| デオキシリボヌクレアーゼ | 8.75ミリグラム | 7.4ミリグラム |
表4。 TH-PSSとTL-PSSソリューション。
Discussion
偏光ベースのTIRFMは、膜トポロジーの急激な、超顕微鏡の変更を検出します。テクニックを実装すると、全反射光学系は既に実施されている場合は特に、比較的簡単である。必要とされているのは、四分の一波長板、二枚の偏光キューブ、およびp-polおよびS偏照明経路を分離するためのシャッターである。テーブルの上にこれらのコンポーネントの正確な位置は、通常、利用可能なスペースによって決定されます。
膜位相情報を得るために、使用される蛍光プローブが固定または既知の向きにインターカレートするべきである。技術は、この資料に記載されているように、例えば、FM1-43 14を使用してもよいようなカルボシアニン色素が、他の染料の使用を前提としています。膜染色手順自体は簡単です。培養された細胞は、膜のあふれんばかりのラベルを取得するためにやったDII /少量のごく短時間の曝露（10秒未満）が必要です。過剰な染料を追加すると、光散乱aggregにつながる画像品質を低下させ、ガラス上のATE。染料とオーバーインキュベート細胞は、画質およびおそらく細胞生存率に対して有害な効果を有する内在化を染色するために導く。細胞が十分に染色されている場合は、PとS放出画像内の明確な区別があるでしょう。 図2Aに示すように、Sの発光強度は、セルのフットプリントにわたってほぼ均一であるが、P発光が鮮やかに（細胞足跡すなわちエッジ）カバースリップ斜めになっている、膜の領域を強調します。 PとSとの間の明確な区別が明確でない場合、それはセルが不十分基板または細胞膜に付着している可能性がある健康的ではなく、細胞は実験のために使用されない。
pTIRFMを記述する我々の以前の研究では、蛍光膜プローブとしてDIIを利用した。それは、他のフルオロフォアとしてGFP / pHluorinを用いるデュアルカラーイメージング実験に適しているので、ここでは、DID利用する。私たちは、DID WIを励起561 nmのレーザーではなく（その励起ピークに近い）640 nmのレーザー番目の640 nmにおけるより迅速に発蛍光漂白剤のため。 561 nmのレーザー励起スペクトルを公表しているのDIDのテール上にあるという事実にもかかわらず、蛍光を効率的に放出される。 561 nmのレーザーの別の利点は、DII、両方のプローブについて同じ偏光設定を使用するように問い合わせを可能にするDIDの両方を励起することである。膜内の蛍光体の向きが膜トポロジーの解釈に影響することに注意してください。 （DIIまたはなかった場合のように、むしろ平行、またはほぼ平行ではない）のフルオロフォアが膜面に垂直な遷移双極子配向した場合、次に、非平面の膜領域がより容易にSで強調表示はなくなりP放出。
また、ウシ副腎髄質細胞の単離およびエレクトロポレーションするための技術を記載している。牛クロム親和細胞は、優れたSですecretoryモデル。それは、文化の中で維持するために、分泌促進物質の様々に反応が容易であること、および容易に従来の光学顕微鏡を用いて可視化された大規模な分泌小胞を有するという利点があります。蛍光タンパク質を発現するために、細胞の前処理されたコラーゲン培養皿上にプレーティングした懸濁液にエレクトロポレーションする。我々の経験では、発現効率は、Ca 2 + -リン酸またはトランスフェクション試薬のどちらかよりもエレクトロポレーションとはるかに高い。エレクトロポレーションの欠点は、より多くの細胞（多くのようなプロセスを生存しない）と、高価な市販の試薬を必要とすることである。私たちには不明である理由のために、必ずしもすべての膜がDIDが組み込まれています。また、皿上の細胞の一部のみをトランスフェクトする。トランスフェクトされ、DIDとよく染色された細胞を見つけることは染色およびエレクトロポレーションは努力の価値があるための条件を最適化する理由である、時間がかかる場合があります。
要約すると、このArticleはpTIRFM、ウシクロマフィン細胞での高密度コア小胞の融合中に発生し、迅速かつ局所的な膜の変形を監視するために実装されている方法を説明します。つのアプリケーションのみがdiscussed Althoughさ、テクニックは理想的エンドサイトーシス分裂及び細胞運動含む膜状に変化を伴う他の生体プロセスの研究に適する。
Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
この研究は、ウェイン州立大学で米国心臓協会と起動ファンドからAAに国立科学開発グラント（13SDG14420049）でサポートされています。我々の原稿にpTIRFMのセットアップと有益なコメントの支援のためにウシ副腎準備に関するアドバイスを提供し、博士ダニエル·アクセルロッド博士ロナルド·W·ホルツ博士メアリービットナーにお世話になっている。SYT-1 pHluorinで使用されました博士下呂Miesenbock（オックスフォード大学）の許可。 GCAMP5GはAddgeneを通して得られた。我々は、説明した手順の様々なステップを最適化する上で助けを借りて、ジェームズ·T.テイラー、Tejeshwarラオ、レイチェルL.·エイクマン、およびPraneeth Katraptiに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| iXon3 EMMCD Camera | Andor | 897 | |
| IX81 Inverted Microscope | Olympus | Side-mounted Filtercube Assembly | |
| 43 Series Ar-Ion Laser | CVI Milles Griot Laser Optics | 543-AP-A01 | Tunable to 488nm |
| Sapphire 561 LP Diode Laser | Coherent | 561nm | |
| Scanning Galvo Mirror System | Thorlabs | GVS102 | |
| VC3 Channel Focal Perfusion System | ALA Scientific Instruments | ALA VC3X4PP | |
| QMM Quartz MicroManifold | ALA Scientific Instruments | ALA QMM-4 | |
| 10 PSI Pressure Regulator | ALA Scientific Instruments | ALA PR10 | |
| Manipulator | Burleigh | TS 5000-150 | |
| Mounted Achromatic Quarter-Wave Plate | Thorlabs | AQWP05M-600 | |
| 420-680nm Polarizing Beamsplitter Cube | Thorlabs | PBS201 | |
| Six Station Neutral Density Wheel | Thorlabs | FW1AND | |
| Stepper-motor Driven SmartShutter | Sutter Instruments | IQ25-1219 | |
| HQ412lp Dichroic Filter | Chroma | NC255583 | Joins 488nm and 561nm beams |
| Coated Plano-Concave Lens | Edmund Optics | PCV 100mm VIS 0 | Diverges 488nm beam |
| Coated Plano-Concave Lens | Edmund Optics | PCV 250mm VIS 0 | Diverges 561nm beam |
| Coated Plano-Convex Lens | Edmund Optics | PCX 125mm VIS 0 | Focuses both beams |
| Coated Plano-Convex Lens | Edmund Optics | PCX 50mm VIS 0 | Cemented to filter cube assembly |
| z488/561rpc Dichroic | Chroma | z488/561rpc | Filtercube dichroic |
| z488/561_TIRF Emission Filter | Chroma | z488/561m_TIRF | Filtercube emission |
| UIS2 60x Objective | Olympus | UPLSAPO 60XO | NA 1.37 |
| Neon Transfection System | Invitrogen | MPK 5000 | |
| MetaMorph Imaging Software | Molecular Devices | ||
| DiI Membrane Dye | Invitrogen | V-22885 | For Alignment Purposes |
| TH Liberase | Roche | 5401135001 | |
| TL Liberse | Roche | 5401020001 | |
| DNAse I Type IV from bovine | Sigma | D5025 | |
| Hemocytometer | Fisher | 0267110 | |
| DiD Membrane Dye | Invitrogen | D-7757 | |
| Rhodamine | Invitrogen | R634 | |
| .22 μm Membrane Syringe Filter Unit | Millipore | SLGS033SS | |
| Fluoresbrite Polychromatic Red Microspheres | Polysciences | 19507 | 0.5 microns |
| Immersion Oil | Sigma | 56822 | |
| LabVIEW | National Instruments | Controlls galvo mirrors | |
| Spinner Flask | Bellco | 1965-00250 |
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