Summary
Polarisering-baserte Total Internal Reflection fluorescens mikroskopi (pTIRFM) muliggjør sanntidsdeteksjon av dynamikk cellemembranen. Denne artikkelen beskriver gjennomføringen av pTIRFM for studiet av membran ombygging under regulert eksocytose. Teknikken er generalizable til andre prosesser i cellebiologi som direkte eller indirekte involverer endringer i membranen form.
Abstract
For å få ny innsikt i dynamikken i eksocytose, fokuserer vår gruppe på endringene i lipidbilag form som må være nøyaktig regulert under fusjon av vesikkel og plasmamembraner. Disse raske og lokaliserte forandringer oppnås ved dynamiske interaksjoner mellom lipider og spesialiserte proteiner som styrer membranen krumning. Fraværet av slike interaksjoner ville ikke bare ha ødeleggende konsekvenser for vesikkelfusjon, men en rekke andre cellulære funksjoner som innebærer kontroll av membran form. I de senere årene, har identiteten til en rekke proteiner med membran forme egenskaper er bestemt. Det som gjenstår mangler er et veikart om når, hvor og hvordan de fungerer som fusion og innhold utgivelsen fremgang.
Vår forståelse av de molekylære hendelser som gjør at membran ombygging har historisk sett vært begrenset av mangel på analytiske metoder som er følsomme for membran kurvatur eller har tidsmessig oppløsning til Track raske endringer. PTIRFM oppfyller begge disse kriteriene. Vi diskuterer hvordan pTIRFM er implementert for å visualisere og tolke raske, submikron endringer i innretningen av chromaffin cellemembraner under tett kjerne vesikkel (DCV) fusjon. De kromaffinceller vi bruker er isolert fra storfe binyrene. Membranen er farget med en lipofil carbocyanine fargestoff, 1,1 '-dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindodicarbocyanine, 4-klorbenzensulfonat, og gjorde. DID intercalates i membranplanet med en "fast" orientering, og er derfor følsom for polarisering av det flyktige feltet. DID-farget cellemembranen er sekvensielt spent med ortogonal polarisasjon av en 561 nm laser (p-pol, s-pol). A 488 nm laser er brukt for å visualisere vesikkel bestanddeler og tidsøyeblikket fusjon. Exocytose utløses av lokalt perfusjon celler med en depolariserende KCl-løsning. Analysen er utført frakoblet ved hjelp av spesialskrevet programvare for å forstå hvordan gjordeutslippsintensitet endringene er knyttet til fusjon pore dilatasjon.
Introduction
Riktig utførelse av eksocytose krever ekstreme endringer i membranen bilayer form til å være nettopp orkestrert. Før fusjon, lokal bøyning av plasmamembranen under granule oppstår, blant annet for å redusere energibarrieren for interaksjon av bilayers. Senere, som membraner fusjonere, områder med høy kurvatur genereres og må stabiliseres. Til slutt må smeltet membraner være bøyd ut av sin opprinnelige form til å utvide fusion pore og muliggjøre innhold utgivelsen en. Fordi membraner alene er usannsynlig å gjennomgå slike dramatiske og koordinerte endringer, proteiner er nødvendige for å megle hendelser. Men hvordan de handle for å påvirke endringer i membranen topologi under fusjonsprosessen er fortsatt veldig mye et åpent spørsmål.
Utmerket in vitro modeller eksisterer for å visualisere membran kurvatur. Bruken av negativ-flekken EM, for eksempel, har vært viktig for å forme dagens molekylære modeller for handlingene til to store menneskehandel proteins - synaptotagmin og dynamin (for anmeldelser, se Chapman 2 og Henshaw 3). De fleste sanntidsanalyser av eksocytose ikke oppdage kurvatur direkte. I stedet er kurvatur utledes fra analyser som rapporterer for kinetikken til lumenal last utgivelsen 4-8 eller endringer i membranen området 9-11. PTIRFM bygger bro mellom in vivo og in vitro studier ved å muliggjøre direkte, real-time målinger av endringer i membran micromorphology.
PTIRFM, i en nonimaging modus, ble utviklet av Axelrod og kolleger for å måle orienteringen av OD-PE inkorporert i en modell-membran 12.. Teknikken ble deretter brukt til å visualisere dynamiske endringer i levende celler merket med Dii og FM1-43 13-18. I pTIRFM, er to flyktige felt polarisasjoner anvendt til sekvensielt å eksitere et membran-forankret probe: p-polarisering (i planet av forekomst), og s-polarisasjon (vinkelrett på planet for forekomst). Forut for avbildning, sonden - i dette tilfellet, gjorde - er kort tilsatt til det ekstracellulære medium og tillates å intercalate i plasmamembranen til cellene som skal studeres. I regioner der membranen er nonparallel til dekkglass (som i en membran krusning eller innrykk), det gjorde også vil være nonparallel. Derfor vil slike områder bli opphisset ved p-pol strålen. Den p-pol strålen vil mindre effektivt opphisse gjorde i membran regioner som stort sett parallelt med dekkglass. Pixel-til-pixel ratio bilder (P / S) rapportering om utslipp fra sekvensiell p-og s-pol eksitasjon av DID vil derfor spesielt fremheve områder av membran deformasjon. I teorien, P / S-forhold bilder er følsom overfor selv små vinkler av plasma membran avvik fra dekkglass, med amplituden av de endringer forutses av datasimuleringer 18. P / S-bilder er også uavhengig av fluoroforen avstand fra dekkglass overflate og lokale fluoroforenkonsentrasjon. Lokal fluoroforen konsentrasjon er i stedet gitt av bildene som rapporterer om piksel-til-piksel summen av P-utslipp og 2 ganger S partiklene (P +2 S). P 2 S målingen er følsom for den nøyaktige geometrien i innrykket, med en viss, liten eller ingen endring er mulig. Dette kan bli vist av datasimuleringer som modell overganger av en fusjon pore fra en tidlig (dvs. med en smal hals) til en senere tilstand 16,18. P 2 S av en fusjonert vesikkel festet til plasma membran via en smal hals (og med mer gjorde nær grenseflaten) er anslått til å være større, for eksempel, enn den til en kondensert vesikkel med et mye større porer (hvor DID er innenfor dimmest del av den flyktige felt).
I denne artikkelen diskuterer vi hvordan pTIRFM er implementert og benyttes til å studere de raske, lokaliserte endringer i membranen form som oppstår under fusion pore dilatasjon. Mens bare ett program er eksplisitt discussed, metodene er generaliseres til en rekke andre celle biologiske prosesser som direkte eller indirekte involverer membran ombygging.
Protocol
En. PTIRF System Setup
Den pTIRFM Teknikken er bygget på en invertert mikroskop plattform. Laserstråler dirigeres gjennom en sidebelysningen port og en nonpolarizing sidevendt filter kube, og deretter fokusert på bakre fokalplan en 60X 1,49 NA TIRF objektiv. Ytterligere to objektiver (1,6 x og 2x) i utslippsbane mellom mikroskop og EMCCD kamera gi en endelig pikselstørrelse på ca 80 nm. Laserstråler blir guidet ved hjelp av programvarestyrte galvano speil for rask bytting mellom epi-og total intern refleksjon (TIR) belysning. Protokollen er beskrevet nedenfor forutsetter at optikk for TIRF er allerede plassert på lufta tabellen i optimale posisjoner for fluoroforen eksitasjon og bildebehandling. Den beskriver hvordan polarisering optikk er lagt til en eksisterende TIRF mikroskop satt opp for å gjøre det mulig avbildning av cellemembranen deformasjoner. En skjematisk av vårt laboratorium optiske set-up for å generere både TIR og polarization-baserte TIR er vist i figur 1A. Protokollen forutsetter bruk av en 488 nm laser for eksitasjon av fluorescerende vesikkel proteiner og en 561 nm laser for avbildning av carbocyanine fargestoff, gjorde.
- Strøm på alle mikroskop komponenter, lasere, og datamaskiner.
- Lede en stråle fra 488 nm laser i tilbake fokalplanet (BFP) av 1,49 NA linse som vist i figur 1A. Ved at laserstrålen er fokusert på BFP, vil det fremstå kollimert og fremstår som små veldefinert sted i taket rett over målet.
- Juster X galvanospeil (speilet ligger i den tilsvarende prøveplanet), slik at laserstrålen beveges utenfor aksen, og kommer ut fra hensynet til progressivt brattere vinkler til målet normalt.
- Deretter bekrefter at TIR er oppnådd. Tilsett 10 pl av fluorescerende mikrosfærer til en 1 ml volum av PSS i en glass-bunn fatet. Kun fluorescens fra sfærer på bunnen of fatet, nærmest TIR-grensesnitt skal påvises. Påvisning av flytende mikrosfærer viser at vinkelen mellom innfallende lys og objektiv normalt er utilstrekkelig.
Seksjonen nedenfor beskriver oppsett av optiske komponenter som er nødvendige for polarisering-basert bildebehandling. - Ved hjelp av den innrettede 488 nm strålen som en guide, justere plasseringen av den rå 561 nm laserstrålen slik at den reiser langs en identisk optisk bane. Den 561 nm laser vil bli brukt for avbildning av carbocyanine fargestoff, gjorde.
- Sett inn en avvikende linse og speil nedstrøms for 561 nm laser. Ved hjelp av speilene, juster strålen slik at den coaligned ved 488 nm strålen og flekken er i fokus på taket når galvanospeil er i "0"-stilling.
- Sentrer en kvart bølge plate (QW) i strålebanen umiddelbart nedstrøms for laseråpningen. Bruk en QW som enten er akromatisk eller innstilt til eksitasjon bølgelengde.En QW vil sirkulært polarisere noen lineært polarisert lys som kommer inn i en 45 ° vinkel med den optiske aksen. Noen optiske komponenter, slik som polarisasjons kuber, har en dempning vridning mot en akse for polarisering. Den QW kan roteres for å kompensere for denne skjevhet. Denne justering vil resultere i en elliptisk polarisert stråle. En QW er nødvendig fordi laserstrålen i seg selv er svært lineært polarisert (vertikalt) som det framgår fra åpningen.
- Plasser en polarisering kube (PC1) nedstrøms for elliptisk polarisert strålen. Polariseringen kuben reflekterer den vertikale (y-) komponenten i det elektriske feltet og passerer de horisontale (x) komponent. Polariseringen kuben er plassert på en liten sette trinn for å lette etterfølgende justering av polariseringsstrålebaner.
- Bruk en andre polariserende kube (PC2) og speil (figur 1A) for å sette sammen bjelker.
- Plasser en lukker mellom den første polarisering kube (PC1) og den vertikale component speil. Sett en annen lukker mellom den horisontale komponent speil og andre polarisering kube (PC2). Disse skodder er kontrollert av bildebehandlingsprogrammer slik at brukeren kan raskt velge mellom bjelke polarisasjonene.
- Bruk et polarisasjonsfilter for å kontrollere det elektriske feltet orientering i hver strålegangen. Et polariseringsfilter vil bare tillate overføring i tråd med filterets aksen.
- Kontroller at de vertikale og horisontale komponenter av laserstrålen er rettet inn med hverandre og 488 nm trålen. Gjør justeringer. De tre bjelker bør alle være fokusert på BFP og fremstå kollimert fra målet til samme sted på taket. Dette stedet kan være preget av en X til rette for fremtidig innretting.
- Plasser en dråpe nedsenking olje på målet. Sett fatet inneholder fluorescerende sfærer (se trinn 4 ovenfor) på målet.
- Tast TIR ved å flytte X galvano speil. I TIR, den vertikale komponenter;t av bjelken er den s-pol og den horisontale komponenten av strålen nå er p-pol. Justere den relative intensitet mellom bjelkene ved å rotere QW plate. Vis hvert polarisert flyktige feltet med en rodamin prøve, som er spådd å bli tilfeldig orientert. Roter QW plate å matche den gjennomsnittlige piksel intensiteter. Om nødvendig, legg en nøytral tetthet filter i en polarisert strålegangen for å dempe sin intensitet.
2. Chromaffin Cell Isolation
En prosedyre for å isolere friske kromaffinceller fra kalven binyrene er gitt nedenfor. Det er tilpasset fra tidligere publiserte protokoller ved Wick, Senter et al. 19 og O'Connor, Mahata et al. 20. Etter isolering, celler blir elektroporert med plasmid (er) av interesse ved hjelp av en electroporation system. Dette systemet resulterer i 20-30% av cellene som uttrykker de ønskede fluorescerende proteiner. Vanligvis er 70% av cellene overlever de utvalgteroporation prosessen. Detaljer av PSS-og mediekomponenter er gitt i Tabellene 2, 3 og 4..
- To dager før celle prep, behandler 35-mm optisk kvalitet med glassbunn (0,17 mm tykk) retter med 1 ml poly-D-lysin (0,1 mg / ml), etterfulgt av 1,25 ml bovin-kollagen. La retter lufttørke i vevskultur panseret.
- Skaffe storfe binyrene fra slakteriet. Hold kjertler på is mens de blir transportert tilbake til laboratoriet. Den bovine binyrene kan være innkapslet i et tykt lag av fett. Bruk kirurgisk saks for å fjerne overflødig fett og utsett adrenal vene åpningen. Perfuse venen med prep-PSS gjentatte ganger til kjertelen er renset for blod.
- Deretter sakte pipette 2 ml av TH-PSS løsning i venen åpningen inntil kjertelen svulmer. Inkuber oppblåst kjertler ved 37 ° C i 15 min. Gjenta TH-PSS behandling og ruge igjen.
- Skjær gjennom ytre binyrebarken rundt kanten av kjertelen med scissors og skrelle kjertelen hverandre for å eksponere medulla. Bruk en skalpell til å forsiktig skrape og skille medulla fra kortikale vev.
- Finhakk medulla med et par av skalpellblader for 5-10 min.
- En endelig fordøyelse trinn er nødvendig for å isolere individuelle kromaffinceller. Hell hakket cellesuspensjonen i en spinner kolbe. Delvis å fylle kolben med et 2:1 forhold av TH-PSS (30 ml) for å TL-PSS (15 ml) og inkuber i 30 min ved 37 ° C mens denne roterer med omtrent 100 rpm.
- Separer de individuelle kromaffinceller fra ufordøyd vev ved filtrering gjennom en 400 pm mesh. Samle filtratet. Sentrifuger ved 200 x g for å pelletere cellene og resuspender i iskald PSS.
- Filter cellene gjennom en 250 mikrometer mesh, pellet, og til slutt resuspender i elektroporering buffer (se trinn 2.9).
- Telle celler ved hjelp av en hemocytometer og forberede for transfeksjon.
- Transfektere celler med electroporation system ifølgeprodusentens anbefalinger. De nøyaktige betingelser for elektroporering må bestemmes empirisk. Merk: Innstillingene som gir den beste balansen mellom transfeksjon effektivitet og celle overlevelse for denne utarbeidelse av storfe kromaffinceller er 1100 V, 40 msek, og en puls. Vi anslår at med disse forholdene, er 20-30% av celler transfektert. Omtrent 30% av cellene overlever ikke electroporation prosessen.
- Plate celler forsiktig på poly-D-lysin-og kollagen behandlet retter i 1 ml varmet electroporating media.
- Plasser retter i en 37 ° C inkubator (5% CO2). Tilsett 1 ml av 2x antibiotiske materiale til hver skål etter 6 timer. Endre media til vanlige medier neste dag.
- Kromaffinceller er vanligvis avbildes 2-5 dager etter elektroporering.
Tre. pTIRF Image Acquisition
- Strøm på imaging system og begynne oppkjøpet programvare.
- Kontroller at lasere er justert. Sjekk flyktigeFeltprofil hjelp sfærer.
- Klargjør global og lokal perfusjon system. Ren løsning reservoarer med filtrert avionisert H 2 O og fyll med basal og stimulerende PSS løsninger.
- Før bildebehandling kromaffinceller, må du kontrollere at p-pol og s-pol excitations belyse samme region av synsfeltet og at belysning intensitet er omtrent tilsvarende. For å gjøre dette, fylle et glass-bunn parabolen med to ml PSS inneholder rhodamin på en endelig konsentrasjon på 10 mM. Sekvensielt opphisse rodamin prøven med p-pol og s-pol lys og ta bildene. I praksis vil P-og S-utslipp fra den gikk er normalisert til gjennomsnittet av P-og S-rodaminmolekyler utslipp. Se bildeanalyse og Diskusjons seksjoner for ytterligere detaljer.
- Nå gå videre til farging storfe kromaffinceller med gjorde. Skyll kultur media fra fatet inneholder kromaffinceller og erstatte med 2 ml av basal-PSS. Legg 10 mL av 10 mM gjorde (fortynnet i etanol)direkte til fatet som inneholder cellene. Forsiktig agitere parabolen for 2-10 sek og fjerne den gjorde + PSS løsning.
- Vask fatet 3-4x med basal-PSS for å fjerne eventuelle gjenværende gjorde. Cellene er nå farget og ferdig til bruk.
- Legg en dråpe immersjonsolje til målet. Sett fatet inneholder DID-farget kromaffinceller på toppen av målet.
- Vise parabolen enten gjennom objektiv eller på kameraet, finne en celle som er tilført med protein av interesse og farget med gjorde. En godt farget celle oppviser et P-utslipp som levende belyser kanten av cellen; S utslipp bør være omtrent jevn over hele cellen fotavtrykk (dvs. det område av cellen som er festet til glasset og fotografert i TIRF).
- Plasser den lokale perfusjon nålen slik at den er omtrent 100 mikrometer bort fra cellen.
- Fokus på cellemembranen og aktivere autofokus hardware umiddelbart før celle stimulering / image oppkjøpet. </ Li>
- Begynn image oppkjøpet. Perfuse cellene i 10 sekunder med en basal-løsning og deretter i 60 sek med en depolariserende 56 mM KCl-løsning. Hente bilder mens raskt forskaling mellom 561 nm p-pol, 561 nm s-pol (for å overvåke endringer i P og S utslipp av gjorde) og 488 nm eksitasjon (til bildet transfektert vesikkel probe). Eksempler på bilder ervervet under eksperimentene er vist i figur 2 og figur 3.
4. Bildeanalyse
Beregninger for bildebehandling kan utføres med ImageJ, men utnytte skript i et fleksibelt programmeringsspråk som IDL eller Matlab kan øke analyse gjennomstrømning ved å automatisere oppgaven. To typer bilder må beregnes å skaffe topologisk informasjon fra rå utslippsbilder -. P / S og P 2 S P / S rapporterer om lokale membran deformasjoner mens P 2 S summen rapporterer om den totale membran fargestoff i en gitt regionav feltet.
- Alle bildene skal være bakgrunnen trekkes. Velg en off-celle ROI, måle gjennomsnittlig pikselintensiteten i avkastningen, og deretter trekke denne verdien fra alle piksler i bildet stabelen.
- For å beregne P / S, dele hver "P" utslippsrammen ved den etterfølgende "S" utslippsramme (pixel-til-pixel). P / S varierer med de relative intensiteter av p-og s-pol excitations, skjevheter i optiske system, og interferensstriper. For å redusere disse effektene, normalisere P / S forholdstall fra innhentet fra DID utslipp forholdet innhentet med en løsning som inneholder 10 mM rhodamin 18.
- Exocytose av individuelle DCVs fremgår av en plutselig forandring i intensiteten av et fluorescerende vesikkelproteinet, slik som Synaptotagmin-1 pHluorin (figur 2B). Oppfatte endringer i P / S og P 2 S ved gjennomsnitt pikslene i et 240 nm radius ROI sentrert over lokal økning av P / Sratio på områder av eksocytose. Når fusjon skjer uten en tydelig økning i P / S, er ROI sentrert over regionen i fikserings DCV.
- Datasimuleringer kan utføres for å tolke P / S og P 2 S membran intensitetsendringer i form av enkle geometrier av en strekke fusion pore. For detaljer om simuleringer, se Anantharam et al. 18
Representative Results
Konvensjonelle og polarisert TIRFM bildeteknikker er implementert på den samme luften tabellen. Konfigurasjonen av de optiske elementer er like, med den store forskjell at magnetiseringsstrømmen lyset er polarisert (figur 1A). Polarisert lys fortrinnsvis begeistrer fluoroforene med absorpsjon dipoler i polariseringen retning. Således, for pTIRFM for å være effektiv til å overvåke membran topologiske endres, må sonden som brukes intercalate i membranen med en fast retning. Fluorescerende carbocyanine fargestoffer (DII, gjorde) intercalate inn lipid bilayers i en orientert mote med overgangs dipoler i membranen planet (Figur 1B). P-polarisert lys (figur 1C) av DID-merket membraner selektivt begeistrer dekk-skrå fluoroforene (RED i figur 1B og 1D).
Overstrømmende membranmerking av kromaffinceller oppnås etter abrief inkubasjon med gjorde. Figur 2A viser et eksempel på en cellemembran som er beiset godt. En sunn, tilhenger celle vil stille tydelige forskjeller i P-og S-utslipp. P utslipps bildet viser en lysere cellerammen i forhold til resten av cellen. S utslipp bildet viser omtrent uniform fluorescens over cellen fotavtrykk. Beregnet pixel-til-pixel P / S og P 2 S bilder er følsomme for membran kurvatur og fargestoff konsentrasjon, henholdsvis. Den chromaffin cellen vist har også blitt transfektert med Synaptotagmin-1 pHluorin (SYT-1) til å merke sekretoriske vesikler (Fig. 2B).
Den chromaffin cellen blir stimulert med 56 mM KCl å depolarize cellemembranen og utløse eksocytose. En rekke av farge fluorescerende SYT-en pHluorin flekker plutselig blitt tydelig som DCVs sikringen (Figur 2B, høyre panel). En hvit boks er trukket rundt en fusjon hendelse (Figur 2B, høyre panel). Denne sammensmeltingen hendelsen is analysert i figur 2C og 2D. Figur 2C viser frame-by-frame endringer i SYT-1-pHluorin, P / S, og P 2 S bilde intensiteter. Fluorescensintensiteten av SYT-1 avtar raskt som proteinet diffunderer bort fra fusjonsside (figur 2D). De skår som representerer det smeltede vesikkel / plasma membran kompleks avtar ved en relativt lavere hastighet (Merk grafene i figur 2D). Illustrasjonen (2E) viser en tolkning av disse målingene.
Den raske og lokaliserte membran deformasjoner som er vist i figur 2, er et resultat av stimulus-fremkalt Ca 2 +-innstrømning. Dette er vist i figur 3A. En chromaffin celle er tilført med den genetiske Ca 2 + indikator GCaMP5G 21,22 og stimulert med 56 mM KCl. Membranen depolarisering fører til en signifikant økning i fluorescens GCaMP5G (
/ Files/ftp_upload/51334/51334fig1.jpg "/>
Figur 1. Illustrasjoner for pTIRFM teknikk. A) En skjematisk for å kombinere konvensjonelle med polarisering baserte TIRF avbildning er vist. En kvart-bølge (QW) plate er plassert i fronten av et 561 nm-safir laser til elliptisk polariserer laserstrålen. En polariserende kuben (PC1) blir brukt til å separere polarisasjonene til lineære vertikale (v) og de horisontale (h) komponenter. De vertikale og horisontale komponenter blir p-pol og S-pol eksitasjon bjelker, henholdsvis ved TIR overflate. De p-pol og s-pol banene er uavhengig ales (S1 og S2). De er saman med speil og en andre polariserende kube (PC2). De blir med den 488 nm bjelke (også uavhengig skodder og S3) via en bjelke styring element bestående av et speil og nonpolarizing dichroic speil (DC). Linser (L) blir brukt til å ekspandere og å fokusere strålene. Kombinerte 488 nm og 561 nm-bjelker blir styrt til en sidebelysningen port av mikroskopet via Galvanospeil meter (GM). De fokuserer til baksiden fokalplanet (BFP) av tittel. Fotoner som sendes ut fra fluoroforene er fanget på en EMCCD kamera koblet til en PC. B) gjorde merking er utført av kort ruger celler med fargestoff og vaske flere ganger for å fjerne overflødig. DID intercalates i membranen med sin overgang dipol momentene omtrent i membranplanet. C) Den innfallende lys polarisert i planet for forekomsten (p-pol) skaper et flyktig felt som er hovedsakelig polarisert normalt på grenseflaten, som vist. D) Belysning av en DID-merket membran med p-polarisert lys vil selektivt opphisse de fluoroforene som er dekkglass-skrå (RED). Hvis dette var en s-polarisert flyktige feltet, vil de fluoroforer som er parallelle med dekkglass bli eksitert i stedet (SORT).
Figur 2. Trong> Overvåking cellemembranen deformasjoner med pTIRFM. A) Raw P og S utslippsbilder sammen med beregnet P / S og P 2 S utslipps Bildene vises. Scale bar, 3,2 mikrometer. B) En chromaffin celle uttrykker SYT-en pHluorin er depolarized med KCl. En rekke av farge fluorescerende flekker (høyre panel) viser fusjon av individuelle DCVs. Scale bar, 3,2 mikrometer. C) Frame-by-frame bilder av en sammensmelting SYT-en pHluorin DCV. Times (Bildene ovenfor) er i løpet av sekunder. Tid 0 betegner ramme før fusjon av DCV. Tilsvarende P / S og P 2 S utslipps bildene er også vist. . Scale bar er en mikrometer D) Grafer for bilder i C. Stiplet linje er på tide 0 -. Fusjon ramme E) En mulig tolkning av resultatene i C og D er vist. blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Deformasjoner er et resultat av stimulus-fremkalt Ca 2 + tilstrømningen. A) En chromaffin celle tilført med GCaMP5G er depolarized med 56 mM KCl. Den resulterende økningen i GCaMP5G fluorescens betyr en økning i subplasmalemmal Ca 2 + nivåer. B) Frame-by-frame bilder av 30 x 20 pikslers område av celle i A. Times Bildene ovenfor er i sekunder. Hvite pilspisser indikerer en region av P / S økning og P 2 S nedgang. Cytosolic GCaMP5G protein er utelukket fra regionen av fikserings DCV. Scale bar, en mikrometer. C) Grafer for bildene som vises i B. D) En mulig tolkning av resultatene i B og C er vist.3highres.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| iXon3 EMMCD Kamera | Andor | 897 | |
| IX81 invertert mikroskop | Olympus | Sidemontert Filtercube Assembly | |
| 43 Series Ar-Ion Laser | CVI Milles Griot Laser Optics | 543-AP-A01 | Tunbare til 488 nm |
| Sapphire 561 LP Diode Laser | Samstemt | 561 nm | |
| Skanning Galvo Mirror System | Thorlabs | GVS102 | |
| VC 3 Channel Focal Perfusjonssystem | ALA Scientific Instruments | ALA VC3X4PP | |
| QMM Quartz MicroManifold | ALA Scientific Instruments | ALA QMM-4 | <td>|
| 10 psi trykkregulator | ALA Scientific Instruments | ALA PR10 | |
| Manipulator | Burleigh | TS 5000-150 | |
| Montert Achromatic Quarter-Wave Plate | Thorlabs | AQWP05M-600 | |
| 420-680 nm Polariserings beamsplitter Cube | Thorlabs | PBS201 | |
| Seks Station Neutral Density Wheel | Thorlabs | FW1AND | |
| Stepper-motor drevet SmartShutter | Sutter Instruments | IQ25-1219 | |
| HQ412lp dichroic Filter | Chroma | NC255583 | Tiltrer 488 nm og 561 nm bjelker |
| Coated Plano-konkave linse | Edmund Optics | PCV 100mm VIS 0 | Divergerer 488 nm bjelke | Coated Plano-konkave linse | Edmund Optics | PCV 250mm VIS 0 | Divergerer 561 nm bjelke |
| Coated Plano-konveks linse | Edmund Optics | PCX 125mm VIS 0 | Fokuserer både bjelker |
| Coated Plano-konveks linse | Edmund Optics | PCX 50mm VIS 0 | Sementert å filtrere kube montering |
| z488/561rpc dichroic | Chroma | z488/561rpc | Filtercube dichroic |
| z488/561_TIRF Emission Filter | Chroma | z488/561m_TIRF | Filtercube utslipp |
| UIS2 60X Objective | Olympus | UPLSAPO 60XO | NA 1,37 |
| Neon Transfection System | Invitrogen | MPK 5000 | |
| MetaMorph Imaging Software | Molecular Devices | ||
| DII Membran Dye | Invitrogen | V-22885 | For justering formål |
| TH Liberase | Roche | 5401135001 | |
| TL Liberse | Roche | 5401020001 | |
| DNAse I Type IV fra storfe | Sigma | D5025 | |
| Hemocytometer | Fisher | 0267110 | |
| Visste Membran Dye | Invitrogen | D-7757 | |
| Rhodamin | Invitrogen | R634 | |
| 0,22 mikrometer Membran sprøyte Filter Unit | Millipore | SLGS033SS | |
| Fluoresbrite polykromatisk Red microspheres | Polysciences | 19507 | 0,5 um |
| Neddyppingsolje Sigma | 56822 | ||
| LabVIEW | National Instruments | Styrer Galvo speil | |
| Spinner Flask | Bellco | 1965-00250 |
Tabell 1. pTIRF Mikros utstyr.
| Innhold | Prep-PSS | Basal-PSS | Stim-PSS |
| NaCl | 145 mM | 145 mM | 95 mM |
| KCl | 5,6 mM | 5,6 mM | 56 mM |
| MgCl 2 | - | 0,5 mM | 0,5 mM |
| CaCl 2 | - | 2,2 mM | 5 mM |
| HEPES | 15 mM | 15 mM | 15 mM |
| pH | 7.4 | 7.4 | 7.4 |
| Glukose | 2,8 mM | 5,6 mM | 5,6 mM |
| Pen-Strep | 1x | - | - |
Tabell 2. Perfusjons og chromaffin celle prep løsninger.
| Innhold | Electroporating Media | Normal Plating Media | 2x Antibiotika Media |
| 1x DMEM/F-12 | 1 ml / plate | 2 ml / plate | 1 ml / plate |
| FBS | 10% | 10% | 10% |
| Cytosine Arabinofuranoside (CAF) | - | 1 mL / ml fra 10 mM lager | - |
| Penicillin | - | 100 enheter / ml 200 enheter / ml | |
| Streptomycin | - | 100 pg / ml | 200 pg / ml |
| Gentamycin | - | 25 mikrogram / ml | 50 pg / ml |
Tabell 3. Chromaffin Cell Media.
| Innhold | TH-PSS | TL-PSS |
| Liberase TH | 2 ml | - |
| Liberase TL | - | 0,85 ml |
| Prep-PSS | 98,0 ml | 84,0 ml |
| DNase | 8,75 mg | 7,4 mg |
Tabell 4. TH-PSS og TL-PSS Solutions.
Discussion
Polarisering basert TIRFM oppdager raske, submikroskopiske endringer i membran topologi. Implementering av teknikken er relativt enkelt, særlig hvis TIRF optikk er allerede på plass. Alt som trengs er en kvartbølge plate, to polariserende kuber, og skodder for å skille p-pol og s-pol belysning stier. Den nøyaktige plassering av disse komponentene på bordet er vanligvis diktert av tilgjengelig plass.
For å oppnå membran topologisk informasjon, bør den fluorescerende probe anvendes intercalate med en fast eller kjent retning. Denne teknikk, som er beskrevet i denne artikkelen, forutsetter bruk av carbocyanine fargestoffer, men også andre fargestoffer, slik som FM1-43 14, kan også anvendes. Membranen farging prosedyren i seg selv er grei. Dyrkede celler krever bare en meget kort eksponering (mindre enn 10 sekunder) i en liten mengde av Dii / gjorde for å oppnå strømmende merking av membranen. Legge overflødig fargestoff fører til lysspredning Aggregaterates på glasset som avtar bildekvalitet. Over-rugende celler med fargestoff fører til fargestoff intern som har skadelige effekter på bildekvalitet og muligens celle levedyktighet. Hvis en celle er farget godt, vil det være klart skille i P-og S-utslipps bilder. Som vist i figur 2A, vil P-utslipp levende fremheve områder av membranen som er dekk skrå (dvs. kantene av cellen footprint) mens S emisjonsintensiteten vil være omtrent jevn over hele cellen fotavtrykk. Dersom et klart skille mellom P og S er ikke åpenbar, da er det mulig at cellen er dårlig festet til substratet eller cellemembranen ikke er sunt, og cellen blir ikke brukt for eksperimenter.
Våre tidligere studier som beskriver pTIRFM utnyttet Dii som fluorescerende membran sonde. Her bruker vi gjorde fordi det er egnet for dual-farge bildebehandling eksperimenter som benytter GFP / pHluorin som den andre fluoroforen. Vi opphisse gjorde with en 561 nm laser i stedet for 640 nm laser (som er nærmere dens magnetisering topp), fordi fluoroforen blekemidler mer hurtig ved 640 nm. Til tross for det faktum at 561 nm laser er på halen av DID publiserte magnetisering spektrum, blir fluorescens effektivt avgis. En annen fordel med 561 nm laser er at det interesserer både Dii og gjorde slik at vi kan bruke samme polarisering oppsett for begge sonder. Legg merke til at retningen av fluoroforen i membranen vil påvirke tolkningen av membranen topologi. For eksempel, hvis en fluorofor ble orientert med sin overgangs dipoler vinkelrett på membranplanet (i stedet for parallelt, eller nesten parallelt, slik tilfellet er med Dii eller gjorde), deretter nonplanar membran regioner vil være lettere markert med S i stedet P-utslipp.
Vi har også beskrevet metoder for isolering og elektroporering av bovin adrenal kromaffinceller. Storfe chromaffin celle er en utmerket secretory modell. Den har fordelen av å være lett å vedlikeholde i kultur, som reagerer på en rekke secretogogues, og er i besittelse store sekretoriske vesikler som er lett visualisert med konvensjonell lysmikroskopi. For å uttrykke fluorescerende proteiner, blir cellene elektroporert i suspensjon før plating på kollagen-behandlet kultur retter. I vår erfaring, er uttrykk effektivitet mye høyere med elektroporering enn med enten Ca 2 +-fosfat eller Lipofectamine reagenser. Ulempen med elektroporering er at det krever flere celler (så mange som ikke overlever i prosessen), og kostbare kommersielle reagenser. Av grunner som er uklart for oss, inneholder ikke hver membran gjorde. I tillegg er bare en brøkdel av cellene på fatet transfektert. Finne celler som er transfektert OG er farget godt med gjorde kan være tidkrevende og det er derfor optimalisere forholdene for beising og elektroporering er vel verdt innsatsen.
I sammendrag, er dette enrtikkel beskriver hvordan pTIRFM er implementert for å overvåke de raske og lokaliserte membran deformasjoner som oppstår under fusjon av tette kjerne vesikler i storfe kromaffinceller. Selv om bare en påføring er diskutert, er teknikken ideelt egnet for studier av andre biologiske prosesser som involverer endringer i membranform, inkludert endocytose, cytokinese, og celle motilitet.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen er støttet av en nasjonal Scientist Development Grant (13SDG14420049) til AA fra American Heart Association og oppstart midler fra Wayne State University. Vi står i gjeld til Dr. Ronald W. Holz og Dr. Mary Bittner for å gi råd om de storfe binyrene forberedelser og Dr. Daniel Axelrod for hjelp med pTIRFM oppsett og nyttige kommentarer til manuskriptet. SYT-en pHluorin ble brukt med tillatelse fra Dr. Gero Miesenbock (University of Oxford). GCAMP5G ble innhentet gjennom Addgene. Vi takker James T. Taylor, Tejeshwar Rao, Rachel L. Aikman, og Praneeth Katrapti med hjelp på å optimalisere ulike trinnene i prosedyrene som er beskrevet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| iXon3 EMMCD Camera | Andor | 897 | |
| IX81 Inverted Microscope | Olympus | Side-mounted Filtercube Assembly | |
| 43 Series Ar-Ion Laser | CVI Milles Griot Laser Optics | 543-AP-A01 | Tunable to 488nm |
| Sapphire 561 LP Diode Laser | Coherent | 561nm | |
| Scanning Galvo Mirror System | Thorlabs | GVS102 | |
| VC3 Channel Focal Perfusion System | ALA Scientific Instruments | ALA VC3X4PP | |
| QMM Quartz MicroManifold | ALA Scientific Instruments | ALA QMM-4 | |
| 10 PSI Pressure Regulator | ALA Scientific Instruments | ALA PR10 | |
| Manipulator | Burleigh | TS 5000-150 | |
| Mounted Achromatic Quarter-Wave Plate | Thorlabs | AQWP05M-600 | |
| 420-680nm Polarizing Beamsplitter Cube | Thorlabs | PBS201 | |
| Six Station Neutral Density Wheel | Thorlabs | FW1AND | |
| Stepper-motor Driven SmartShutter | Sutter Instruments | IQ25-1219 | |
| HQ412lp Dichroic Filter | Chroma | NC255583 | Joins 488nm and 561nm beams |
| Coated Plano-Concave Lens | Edmund Optics | PCV 100mm VIS 0 | Diverges 488nm beam |
| Coated Plano-Concave Lens | Edmund Optics | PCV 250mm VIS 0 | Diverges 561nm beam |
| Coated Plano-Convex Lens | Edmund Optics | PCX 125mm VIS 0 | Focuses both beams |
| Coated Plano-Convex Lens | Edmund Optics | PCX 50mm VIS 0 | Cemented to filter cube assembly |
| z488/561rpc Dichroic | Chroma | z488/561rpc | Filtercube dichroic |
| z488/561_TIRF Emission Filter | Chroma | z488/561m_TIRF | Filtercube emission |
| UIS2 60x Objective | Olympus | UPLSAPO 60XO | NA 1.37 |
| Neon Transfection System | Invitrogen | MPK 5000 | |
| MetaMorph Imaging Software | Molecular Devices | ||
| DiI Membrane Dye | Invitrogen | V-22885 | For Alignment Purposes |
| TH Liberase | Roche | 5401135001 | |
| TL Liberse | Roche | 5401020001 | |
| DNAse I Type IV from bovine | Sigma | D5025 | |
| Hemocytometer | Fisher | 0267110 | |
| DiD Membrane Dye | Invitrogen | D-7757 | |
| Rhodamine | Invitrogen | R634 | |
| .22 μm Membrane Syringe Filter Unit | Millipore | SLGS033SS | |
| Fluoresbrite Polychromatic Red Microspheres | Polysciences | 19507 | 0.5 microns |
| Immersion Oil | Sigma | 56822 | |
| LabVIEW | National Instruments | Controlls galvo mirrors | |
| Spinner Flask | Bellco | 1965-00250 |
References
- Chernomordik, L. V., Zimmerberg, J., Kozlov, M. M. Membranes of the world unite! Cell Biol. 175, 201-207 (2006).
- Chapman, E. R. How does synaptotagmin trigger neurotransmitter release. Annu. Rev. Biochem. 77, 615-641 (2008).
- Hinshaw, J. E. Dynamin and its role in membrane fission. Annu. Cell Dev. Biol. 16, 483-519 (2000).
- Lang, T., et al. Ca2+-triggered peptide secretion in single cells imaged with green fluorescent protein and evanescent-wave microscopy. Neuron. 18 (6), 857-863 (1997).
- Steyer, J. A., Horstman, H., Almers, W. Transport, docking and exocytosis of single secretory granules in live chromaffin cells. Nature. 388, 474-478 (1997).
- Allersma, M. W., Wang, L., Axelrod, D., Holz, R. W. Visualization of regulated exocytosis with a granule-membrane probe using total internal reflection microscopy. Mol. Biol. Cell. 15, 4658-4668 (2004).
- Toomre, D., Steyer, J. A., Keller, P., Almers, W., Simons, K. Fusion of constitutive membrane traffic with the cell surface observed by evanescent wave microscopy. J. Cell Biol. 149, 33-40 (2000).
- Schmoranzer, J., Goulian, M., Axelrod, D., Simon, S. M. Imaging constitutive exocytosis with total internal reflection fluorescence microscopy. J. Cell Biol. 149, 23-32 (2000).
- Heinemann, C., Chow, R. H., Neher, E., Zucker, R. S. Kinetics of the secretory response in bovine chromaffin cells following flash photolysis of caged Ca2. Biophys. J. 67, 2546-2557 (1994).
- Heidelberger, R., Heinemann, C., Neher, E., Matthews, G. Calcium dependence of the rate of exocytosis in a synaptic terminal. Nature. 371 (6497), 513-515 (1994).
- Chow, R. H., Klingauf, J., Heinemann, C., Zucker, R. S., Neher, E. Mechanisms determining the time course of secretion in neuroendocrine cells. Neuron. 16, 369-376 (1996).
- Thompson, N. L., McConnell, H. M., Burhardt, T. P. Order in supported phospholipid monolayers detected by the dichroism of fluorescence excited with polarized evanescent illumination. Biophys. J. 46, 739-747 (1984).
- Sund, S. E., Swanson, J. A., Axelrod, D. Cell membrane orientation visualized by polarized total internal reflection fluorescence. Biophys. J. 77, 2266-2283 (1999).
- Zenisek, D., Steyer, J. A., Feldman, M. E., Almers, W. A membrane marker leaves synaptic vesicles in milliseconds after exocytosis in retinal bipolar cells. Neuron. 35, 1085-1097 (2002).
- Anantharam, A., Axelrod, D., Holz, R. W. Real-time imaging of plasma membrane deformations reveals pre-fusion membrane curvature changes and a role for dynamin in the regulation of fusion pore expansion. J. Neurochem. , 10-1111 (2012).
- Anantharam, A., et al. A new role for the dynamin GTPase in the regulation of fusion pore expansion. Mol. Biol. Cell. 22, 1907-1918 (2011).
- Anantharam, A., Axelrod, D., Holz, R. W. Polarized TIRFM reveals changes in plasma membrane topology before and during granule fusion. Cell Mol. Neurobiol. 30, 1343-1349 (2010).
- Anantharam, A., Onoa, B., Edwards, R. H., Holz, R. W., Axelrod, D. Localized topological changes of the plasma membrane upon exocytosis visualized by polarized TIRFM. J. Cell. 188, 415-428 (2010).
- Wick, P. W., Senter, R. A., Parsels, L. A., Holz, R. W. Transient transfection studies of secretion in bovine chromaffin cells and PC12 cells: generation of kainate-sensitive chromaffin cells. J. Biol. Chem. 268, 10983-10989 (1993).
- O'Connor, D. T., et al. Primary culture of bovine chromaffin cells. Nat. Protoc. 2, 1248-1253 (2007).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca2+ composed of a single green fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).
