Summary
وضعنا سابقا تقنية لزرع الأسلاك tetrode في المجمع المركزي للأدمغة صرصور الذي يسمح لنا لرصد النشاط في وحدات فردية من الصراصير المربوطة. نحن هنا تقديم نسخة معدلة من هذا الأسلوب الذي يسمح لنا أيضا تسجيل نشاط المخ في تحريك الحشرات بحرية.
Abstract
يتطلب اهتماما متزايدا في دور نشاط الدماغ في التحكم في المحركات الحشرات أن نكون قادرين على مراقبة النشاط العصبي في حين الحشرات أداء السلوك الطبيعي. وضعنا سابقا تقنية لزرع الأسلاك tetrode في المجمع المركزي للأدمغة الصراصير التي سمحت لنا لتسجيل نشاط الخلايا العصبية متعددة في نفس الوقت من حين تحولت صرصور المربوطة أو تغير سرعة المشي. في حين أن تقدما كبيرا، والأعمال التحضيرية المربوطة توفير الوصول إلى سلوكيات محدودة وغالبا ما تفتقر عمليات التقييم التي تحدث في التحرك بحرية الحيوانات. نقدم الآن نسخة معدلة من هذا الأسلوب الذي يسمح لنا لتسجيل من المجمع المركزي من التحرك بحرية الصراصير وهم يسيرون في الساحة والتعامل مع الحواجز من خلال تحويل، التسلق أو نفق. إلى جانب سرعة عالية الفيديو والقطع العنقودية، يمكننا الآن تتصل نشاط الدماغ لمعاملات شتى من حركة الحشرات يتصرف بحرية.
Introduction
توضح هذه المقالة نظام ناجح للتسجيل من الخلايا العصبية داخل المجمع المركزي (CC) من صرصور، discoidalis Blaberus، كما يمشي الحشرة في الساحة ويتعامل مع الأشياء التي تسبب ليستدير، نفق تحت، أو تسلق العقبات. كما يمكن توصيل الأسلاك إلى مشجعا لاستحضار النشاط في neuropil المحيطة بها مع التغيرات السلوكية يترتب على ذلك.
على مدى العقد الماضي قد وجهت اهتماما كبيرا في الأدوار التي تقوم بها مناطق الدماغ المختلفة في السيطرة على سلوك الحشرات. وقد وجهت الكثير من هذا التركيز نحو neuropils الدماغ خط الوسط التي يشار إليها مجتمعة ب مجمع المركزية (CC). وقد تم إحراز تقدم نتيجة لأصناف واسعة من التقنيات التي تستهدف أسئلة حول دور CC في السلوك. وتتراوح تلك التقنيات من التلاعب العصبية الوراثية، في المقام الأول في ذبابة الفاكهة، إلى جانب behaviتحليل عن طريق الفم 1-3، إلى تقنيات الكهربية التي ترصد النشاط العصبي داخل CC ومحاولة لربط هذا النشاط إلى المعايير ذات الصلة سلوكيا.
وتشمل تقنيات الكهربية داخل الخلايا من الخلايا العصبية تسجيل الفردية المحددة 4-9 وتسجيل خارج الخلية، وغالبا مع قناة تحقيقات متعددة 10،11. هذه التقنيات هما مجانية. تسجيل داخل الخلايا مع أقطاب حادة أو التصحيح خلية كاملة يوفر بيانات مفصلة جدا على الخلايا العصبية التي تم تحديدها، ولكن يقتصر على واحد أو اثنين من الخلايا في آن واحد، يتطلب حركة محدودة أو معدومة، ويمكن الحفاظ لفترات قصيرة نسبيا من الزمن. تسجيلات خارج الخلية يمكن بسهولة انشاء، لا تتطلب ضبط النفس، ويمكن الحفاظ على لساعات. مع tetrodes متعددة القنوات والقطع العنقودية، ويمكن تحليل أعداد كبيرة نسبيا من الخلايا العصبية في وقت واحد 9،12. بينما patc خلية كاملةح وقد استخدمت بنجاح في الحشرات المربوطة 13، ونحن نشعر أن هناك أيضا حاجة إلى التقنيات التي تسمح لنا لتسجيل النشاط العصبي في الدماغ لفترات طويلة من الوقت في التصرف بحرية الحشرات لأنها تعامل مع العوائق التي تحول دون حركة إلى الأمام.
الحاجة لتسجيل مثل هذه التحركات الحشرات ويرتد صعودا وهبوطا دفعنا نحو أساليب تسجيل خارج الخلية. لقد كان لدينا تسجيل نجاح جيدة في الأعمال التحضيرية ضبط النفس مع المتاحة تجاريا تحقيقات السيليكون 11 16 قنوات، ولكن صغر حجم كبير حتى الصراصير يعني أن تحقيقات يجب أن يتم تنظيمها قبالة الجسم. التي، إلى جانب حساسية للأسنان التحقيق، جعلها غير مناسبة لإعداد المشي الحر. في اثنين من المشاريع السابقة، استخدمنا حزم من الأسلاك غرامة تشكيل tetrode لإنجاز تسجيل خصائص مماثلة ولكن في ترتيب أكثر قوة. سمحت هذه الباقات tetrode لنا لتسجيل من الصراصير المربوطة ود تتصل النشاط حدة CC للتغيرات في سرعة المشي 14 وتحول السلوك الناتج من الاتصال antennal مع قضيب 10.
كما مفيدة كما كانت هذه الاستعدادات المربوطة وستظل، فإنها تفعل تقديم بعض القيود. أولا، السلوكيات التي يمكن أن تؤدي الحشرة محدودة لطائرة واحدة. وهذا هو، ونحن يمكن أن تثير بسهولة التغيرات في سرعة المشي أو تحول، ولكن كانت الإجراءات التسلق والأنفاق غير ممكن، على الأقل مع حبل ترتيب نموذجي. الثاني، الاستعدادات المربوطة لدينا هي "حلقة مفتوحة". وهذا يعني أنها لا تسمح للحركة العادية المتعلقة ردود الفعل على النظام. وهكذا، كما تحولت صرصور على حبل لدينا، لم يتم تغييرها العالم البصرية وفقا لذلك. فمن الممكن لبناء نظم حلقة مغلقة حبل لتقديم هذا النوع من ردود الفعل. ومع ذلك، فهي محدودة بسبب تعقيد البرمجة والأجهزة البيئة البصرية المحاكاة. Neverthelesق، شعرنا أننا يمكن أن تحسن على طرقنا تسجيل المربوطة القائمة من خلال تسجيل من الحيوان لأنه مشى بحرية في الساحة أو المسار واجه الأشياء كما تفعل في محيطها الطبيعي.
على الرغم من أن الأنظمة اللاسلكية لتسجيل نشاط المخ 15 سيكون مثاليا، النظم الحالية لديها قيود في عدد من القنوات تسجيل، والوقت من الحصول على البيانات، وعمر البطارية والوزن. ونحن، بالتالي، اختارت في محاولة للتكيف لدينا نظام تسجيل المربوطة لاستخدامها في التحرك بحرية الاستعدادات. كما تصبح أفضل الأنظمة اللاسلكية المتاحة، وهذه التقنية يمكن تكييفه بسهولة لمثل هذه الأجهزة. نظام الموضح في هذه المقالة هو خفيفة الوزن، ويعمل بشكل جيد جدا، ويبدو أن يكون لها تأثير ضار يذكر على سلوك صرصور و. مع رخيصة كاميرا عالية السرعة والكتلة البرمجيات القطع، والنشاط في الخلايا العصبية في الدماغ الفردية يمكن أن تكون ذات صلة الحركة. نحن هنا وصف preparأوجه من الأسلاك tetrode وترسيخها على الدماغ إلى الحشرة وكذلك تقنيات التسجيل للنشاط والحركة الكهربائية وكيف أن هذه البيانات لا يمكن أن تتحقق معا لتحليلها لاحقا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد أسلاك Tetrode
- سحب سلك رفيع جدا نيتشروم (12 ميكرون القطر، PAC الطلاء) من حوالي 1.1 متر طول. إرفاق علامة الشريط إلى كل نهاية. شنق السلك على قضيب مترابطة الأفقي بحيث طرفي هي على نفس الارتفاع بالقرب من الفوق.
- كرر الخطوة 1.1 لسلك الثانية، مما يجعل طرفي أكثر ليصبح المجموع 4، ووضعه بجانب السلك الأول (حوالي 1 سم في ما بين).
- عصا نهايات الأربعة معا مع علامة الشريط ونعلق على كلمة دلالية لالدورية جهاز لف آلية. هذا الجهاز يمكن أن تكون مصنوعة من العاصمة المحرك غير مكلفة.
- الرياح tetrode في اتجاه واحد لمدة 2 دقيقة (60 لفة في الدقيقة) والاسترخاء في الاتجاه المعاكس لمدة 30 ثانية.
- استخدام بندقية الحرارة لصهر الأسلاك معا. لا تلمس الأسلاك مع البندقية. استخدام ثلاثة صعودا وهبوطا يمر من اتجاهات بالتناوب، مع كل تمريرة يأخذ حوالي 10 ثانية.
- قطع الجزء العلوي والجزء السفلي من الأسلاك الجرح. والملتوية الأسلاك أربعة ود تنصهر معا في نهاية واحدة ولكن فصل في الطرف الآخر.
- إضافة أنبوب دعم. قطع بطول 30 سم من أنابيب البولي ايثيلين (قطر: داخل 0.28 ملم، 0.61 ملم خارج). الخيط tetrode ببطء شديد وبعناية في أنبوب دعم بحيث لا شبك.
- بمجرد ظهور نهاية تنصهر من الجانب الآخر، وسحب من خلال ذلك أن هناك طول متساوية من الأسلاك على طرفي الأنبوب الدليل.
- الاستيلاء على نهاية منفصلة لكل سلك مع ملقط. باستخدام قاعدة من لهب الموقد الغاز، وحرق بعناية العزل الخروج من الماضي 2 أو 3 ملم من كل سلك. تسخين السلك حتى يضيء، ولكن لا حليقة.
- ربط tetrode مع الذكور والإناث IC محول المقبس الذي يناسب جهاز التسجيل الخاص بك. وضع نهاية deinsulated من كل سلك بمقبس مختلفة من محول مع ملقط. استقرار السلك في المقبس مع دبوس نحاسية صغيرة. استخدام الحديد لحام نقطة غرامة وملء مع مأخذ اللحام الذائب. نكون حذرين حتى لا الاتصالالسلك الهشة مع حام الحديد.
- تحقق من مقاومة كل سلك ومقاومة بين كل زوج من الأسلاك.
- وضع في نهاية الملتوية تنصهر في وعاء من المياه المالحة وربط موصل الأسلاك النحاسية من المياه المالحة إلى متر أوم.
- ربط الطرف الآخر من المقياس إلى دبوس مأخذ تحتوي على السلك. يجب أن تكون مقاومة كل سلك أقل من 3 MΩ.
- إذا لم يتم تحقيق القيم أعلاه، reattempt الاتصالات جندى.
- إزالة الأسلاك من المياه المالحة، وشطف النصائح مع الماء، واختبار مقاومة الأسلاك المشتركة لكل الاقتران (ن = 6). يجب أن تكون مقاومة أمور أعلاه 5 MΩ.
- إذا لم يتم تحقيق القيم أعلاه، شريحة كمية صغيرة من غيض قبالة في نهاية تنصهر وإعادة اختبار.
- تجاهل أي مجموعة الأسلاك التي لا تلبي متطلبات كل من مقاومة لجميع الأسلاك.
- تأمين tetrode.
- أضعاف مربع ورقة مستطيلة صغيرة sligأكبر htly من محول المقبس.
- نقل محول في مربع مع الجانب الذكور في الأسفل. اختراق مربع بحيث كل من المسامير من الجانب الذكور خارج منطقة الجزاء في حين أن بقية محول هو داخل منطقة الجزاء.
- الشريط زوايا المربع في الخارج. استخدام قطعة صغيرة من الشريط اللاصق المزدوج على الوجهين داخل منطقة الجزاء لتحقيق الاستقرار في أي فروع الفردية من الأسلاك. يجب أن تنصهر السلك فور خروجها من مربع.
- مزيج تعيين سريع 2 جزء الايبوكسي وتصب في خانة لتأمين محول وجميع الأسلاك.
- نعلق نهاية قريبة من الأنبوب دليل إلى جانب واحد من مربع بالشمع الأسنان ولكن ترك أنابيب فتح مثل أن tetrode يمكن سحبها من خلال بحرية في كلا الجانبين.
- شحذ tetrode.
- قبل كل تجربة، وقطع غيض من tetrode بشفرة مشرط حاد، وليس المقص. هذا يمنع تكسير والتفلطح من السلك ينتهي مع توفير حافة شقة نظيفة للخطوة التالية.
- النتيجة المرجوة يحول نهاية حزمة من حافة مستقيمة إلى المدببة مع كميات صغيرة من العزل إزالتها من نهاية كل سلك. التحقق من هذه النقطة باستخدام مجهر تشريح قبل الطلاء على tetrode. في حالة حدوث أي مرض جلدي في الطرف، وrecut repolish.
- إذا يختبر مقاومة خلال subsequويبين خطوة الطلاء والأنف والحنجرة منخفضة للغاية القيم الأسلاك المشتركة (أقل من 4 MΩ)، فإنه يشير إلى الكثير من المواد التي تم إزالتها أثناء الخطوة تلميع. Recut وrepolish في tetrode.
- قبل كل تجربة، وقطع غيض من tetrode بشفرة مشرط حاد، وليس المقص. هذا يمنع تكسير والتفلطح من السلك ينتهي مع توفير حافة شقة نظيفة للخطوة التالية.
- لوحة للtetrode. وضع غيض من tetrode في محلول مشبع كبريتات النحاس (85 مل من الماء، 5 مل حمض الكبريتيك، 50 غ كبريتات النحاس). كل سلك لوحة مع تيار 2.5 أمبير مع المعزل التحفيز. حقن الحالية ل1 ثانية، وقفة لمدة 1 ثانية، وتكرار هذه العملية 4X.
- تحقق من مقاومة كل سلك وinterimpedance من كل زوج من الأسلاك. يجب أن تكون مقاومة كل سلك بين 0.5-1 MΩ وينبغي أن تكون مقاومة أمور فوق 4 MΩ.
- تركيب محول على headstage لنظام تسجيل الأقنية.
- إرفاق دبوس الحشرات عازمة على مياداة مجهرية. نعلق غيض من tetrode إلى دبوس الحشرات بالشمع الأسنان
2. إعداد الحيوان
- تخديرصرصور مع الثلج.
- بعد توقف صرصور تتحرك، وكبح جماح الصرصور عموديا على سطح الفلين مسطحة مع دبابيس سرج الكبيرة التي تنتشر على الحشرات ولكن لا تخترق أي جزء من جسمها.
- نقل التحضير في وعاء من البلاستيك ووضع الثلج حول الحيوان لتقليل تدفق الدم وحركات الجسم.
- وضع طوق من البلاستيك في الرقبة لدعم الرأس ووضع الشمع الأسنان حول الرأس لتحقيق الاستقرار فيه.
- خفض نافذة صغيرة بين التي تشبه بشفرة حلاقة وإزالة إهاب من الرأس.
- إزالة الأنسجة الضامة والدهون مع ملقط لفضح الدماغ.
- وضع بعض المالحة صرصور في كبسولة الرأس لتغطية أنسجة المخ.
- لdesheath الدماغ، واستخدام ملقط غرامة لانتزاع بلطف غمد على أعلى من الدماغ واستخدام ملقط غرامة أخرى لتمزيق غمد بعيدا في مجال زرع الأسلاك.
- فتح ثقب صغير في الكبسولة الأمامي الرأس إلى الدماغ الطرافةح دبوس الحشرات. إدراج جديلة من ثلاثة أقطار أكبر (56 ميكرون) معزول الأسلاك النحاسية في الحفرة ليكون بمثابة القطب المرجع / الأرض.
- خفض غيض من tetrode على سطح الدماغ مع مياداة مجهرية وضعه بالقرب من منطقة الدماغ من الفائدة.
- وضع بعناية اثنين من قطع صغيرة من ورقة رقيقة خلات (2 مم × 1 مم)، أكبر قليلا من ثقب في كبسولة الرأس، الأمامي والخلفي للtetrode.
- تشغيل نظام التسجيل.
- خفض ببطء ميكرون tetrode 150-250 تحت سطح الدماغ اعتمادا على جودة التسجيل.
- إيقاف تشغيل نظام التسجيل.
- نقل اثنين من قطعة من ورقة خلات أقرب إلى tetrode ممكن دون لمسها (الشكل 1A).
- تسخين ملعقة صغيرة أو إبرة تحت الجلد بالارض ووضعها في الشمع الأسنان مثل أن هناك الشمع السائل في غيض من الملعقة. تلمس بعناية نهاية بكثير من كل قطعة من ورقة من خلاتtetrode مع ملعقة بحيث الشمع السائل يمكن أن تتدفق على كل قطعة وختم الفجوة بينه وبين بشرة الرأس.
- كرر الخطوة 2.16. انخفاض كمية صغيرة من الشمع السائل على ورقة خلات كل مرة. بدء عملية بعيدا عن tetrode والتحرك تدريجيا نحو ذلك. في نهاية المطاف سوف ترسو في tetrode بواسطة الشمع الأسنان. تجنب الحصول على الشمع الساخن في تجويف وعلى الدماغ.
- استخدام نفس الأسلوب كما والخطوات 2.16 2.17 لترسيخ الإلكترود المرجعي / الأرض مع الشمع.
- تسخين الشمع التي يوليها tetrode إلى مياداة مجهرية للافراج عن tetrode منه.
- حلقة tetrode في الشمع الأسنان على رأسه لتوفير الإغاثة سلالة (الشكل 1B).
- تغطية حلقة تخفيف الشد بالشمع الأسنان (الشكل 1C).
- إزالة بعناية القيود ونقل على إعداد طبق بتري. كبح الجانب الظهري إعداد ما يصل مع دبابيس سرج كبيرة.
- تعلققضيب إلى pronotum باستخدام مسدس الغراء. هذا هو العصا الخشبية التي تمتد من pronotum على البطن.
- نعلق غيض من أنابيب tetrode إلى نهاية الخلفي للقضيب مع الشمع الأسنان.
- ترسيخ tetrode والإلكترود المرجعي / الأرض إلى نهاية الأمامي للقضيب مع الشمع الأسنان.
- سحب tetrode من نهاية المقبس من الأنابيب إلى أقصى حد ممكن، ولكن لا الساحبة على ذلك، من أجل القضاء على فرصة أن الحيوان قد يؤدي إلى تلف جزء من tetrode خارج الأنبوب (1D الشكل).
- إزالة كافة القيود. إرفاق الإلكترود المرجعي / الأرض لأنابيب tetrode بالشمع الأسنان.
- الانتظار على الأقل 60 دقيقة للحيوان للتعافي من التخدير الجليد قبل أي تجربة.
3. الإجراءات التجريبية
- ربط جهاز كمبيوتر مع كل من نظام تسجيل وضوء LED باستخدام USB إلى كابل المسلسل الميناء.
- بدء التسجيلات العصبية.
- بدء تسجيلات الفيديو في 20 لقطة في الثانية للمشي التجارب باستخدام حزمة الحصول على الصور Motmot 16 إطارا في الثانية أو 120 لتسلق التجارب باستخدام كاميرا عالية السرعة.
- ضع صرصور الى 40 سم × 40 سم زجاجي الساحة للمشي التجارب أو 58 سم، 5 سم، 5 سم وارتفاع الساحة لتسلق التجارب. الساحة المشي لديه حاجز شفاف تمتد من منتصف الجدار الأيمن إلى وسط الساحة، أعلاه التي يقع فيها headstage. يتم استخدام حاجز لمنع الحيوانات من السير في المناطق التي يتم حظر عرض الكاميرا من قبل headstage. الساحة تسلق لديه كتلة الاكريليك (إما 1.2 سم أو 1.8 سم ارتفاع، و 5 سم) أو رف تقع على ارتفاع مقارنة في المركز.
- توليد نبضة TTL من جهاز الكمبيوتر باستخدام الأوامر MATLAB حسب الطلب. (ق = مسلسل ('COM4')؛ الدالة fopen (ق)؛ s.RequestToSend = 'قبالة' / s.RequestToSend = 'على' /؛ fclose (ق)؛ حذف (ق) ؛). نبض TTL يولد مرةحشا لنظام تسجيل وإما يتحول على أو إيقاف ضوء LED.
- السماح للصرصور لاستكشاف الساحة حتى يتوقف تتحرك لأكثر من 30 ثانية للتجارب المشي. السماح للصرصور إما تسلق كتلة / رف أو من خلال نفق على الرف لتسلق التجارب.
- وقف تسجيلات الفيديو.
- وقف التسجيلات العصبية.
- كتابة الطابع الزمني الناتجة عن النبض TTL.
- إزالة صرصور من الساحة وانتظر 3 دقائق على الأقل.
- كرر الخطوات 3،2-3،10 للمحاكمة القادمة.
- مرة واحدة وقد تم الانتهاء من جميع التسجيلات، 5 ثانية تمر من 5 أمبير العاصمة الحالية من خلال واحدة من النصائح الأسلاك (الأنود) والقطب المرجعية (الكاثود) أن تودع النحاس في الدماغ في الطرف السلك.
4. حاليا تحليل
- مزامنة الفيديو والبيانات العصبية عن طريق ربط الإطار حيث يتم تبديل ضوء LED والطابع الزمني التي سجلتها في نظام تسجيلتلك اللحظة.
- علامة سلك المواقع غيض. استخدام الإجراءات تكثيف تيمز لترسيب ومراقبة النحاس في 12 ميكرومتر المقاطع المسلسل 17. يجب أن تكون ودائع بارزة واضحة في أقسام 3-8 المجاورة (حوالي 18-48٪ من طول الطائرة البطني الظهري للمنطقة نسجل من) (الشكل 2).
- ربط نبضات كهربائية محددة لنشاط الخلايا العصبية واحدة. متابعة إجراءات الفرز ارتفاع المنصوص عليها بالتفصيل في مكان آخر 10،14،18. استخدام البرنامج KlustaKwik (الإصدار 1.5، مؤلف K. هاريس، جامعة روتجرز) لتوليد الأولية، تجميع الآلي. استيرادها إلى برنامج MClust (الإصدار 3.5 والمؤلفين م ريديش وآخرون، جامعة مينيسوتا) لمزيد من الصقل وتحليل (الشكل 3).
- تتبع تحركات صرصور و. للمشي التجارب، واستخراج موقف مركز صرصور في (المرئي) من كتلة الجسم والتوجه في كل إطار من فيدتسجيلات EO باستخدام معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا متعددة يطير المقتفي (الإصدار 0.1.5.6؛ http://ctrax.sourceforge.net/) وFixErrors الأدوات المرتبطة بها لMATLAB 19. لتسلق التجارب، استخراج موقف كتلة ورأس صرصور وpronotum في كل إطار من الفيديو باستخدام حزمة برمجيات تحليل الحركة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
سجلنا النشاط العصبي من 50 وحدة من 27 CC في الاستعدادات لاجراء تجارب على الأقدام. ل15 من تلك التحضيرات (23 وحدة)، وأجريت أيضا تجارب التسلق. تتم تسمية الوحدات الفردية وفقا لأرقام إعداد وحدة (مثل وحدة 1-2 يشير إعداد 1، 2 وحدة).
وتظهر لقطات من الفيديو واحد محاكمة تسلق في الشكل 4. الفيديو كامل متاح في تكميلية الفيديو 1 (الصوت هو من وحدة 1-2). تم تسجيل في على شكل مروحة حق الجسم (الفيس بوك). توقف صرصور يمشي عندما واجهت كتلة وتستخدم هوائيات لتقييم كتلة (أرقام 4A-C). ثم رفعت صرصور الجزء الأمامي من جسمها، وتغيير زاوية الركيزة الجسم (أرقام 4D-E)، قبل أن تأرجح الساق تجاه الجزء العلوي من كتلة وارتفع أكثر من ذلك (أرقام 4F-I). السرعة والارتفاع من اله صرصور وكذلك معدل إطلاق النار لحظية من الوحدتين التي تم فرزها من الأول إلى الإطار الحالي تظهر فوق كل إطار. تم حساب معدل إطلاق النار لحظية من قبل تجانس مرات ارتفاع كل وحدة باستخدام نواة جاوس مع عرض 50 ميللي ثانية. زيادة معدل اطلاق النار من خلال وحدة 1-1 التسلق وزيادة معدل اطلاق سبقت زيادة السرعة (الشكل 4I). وكانت وحدة 1-2 الصامتة قبل التسلق ولكن بدأ إطلاق النار بعد أن بدأ التسلق (الشكل 4I). يتم عرض المسامير اثنين من الوحدات التي تم فرزها داخل 1 ثانية من الإطار الحالي تحت كل إطار. الخط البرتقالي يدل على الوقت من خلال كل إطار والمستطيل الأزرق غطت يشير إلى ضعف العرض من النواة الذي تم استخدامه لحساب معدل اطلاق فوري للإطار الحالي.
ويرد واحد لقطة من شريط الفيديو من واحد محاكمة استكشاف الساحة في الشكل 5A. الفيديو كله مركباتailable في تكميلية فيديو 2 (الصوت هو من وحدة 2-1). تم تسجيل في الفيس بوك الوسط. تم استخراج موقف صرصور والتوجه جسمها في كل الإطار باستخدام Ctrax والمستخدمة لحساب سرعة التوجه إلى الأمام وكذلك معدل إطلاق النار لحظية. يظهر مسار صرصور في شريط الفيديو بأكمله في الشكل 5B. كل نقطة سوداء تشير إلى موقف صرصور في كل إطار والمسار ونا مميزا مع معدل اطلاق النار الفوري وحدة 2-1. كما سجلنا كل محاكمة في إطار معدل ثابت (أي 20 إطارا في الثانية)، ويعد المسافة بين اثنين من النقاط، وأسرع من سرعة في ذلك الوقت. زيادة معدل اطلاق النار من وحدة 2-1 عندما بدأت صرصور على المشي وارتبط مع سرعة المشي. من أجل دراسة ضبط الوحدات الفردية لتحرك الدولة للحيوان (أي سرعة واتجاه)، اقمنا اطلاق الخرائط على أساس معدل سرعة المشي إلى الأمام والطورنينغ السرعة لكل وحدة. بالنسبة للعديد من وحدات CC، تم تقييد زيادة معدل إطلاق النار لدول تنقل محددة. على سبيل المثال، تم ضبطها وحدة 2-1 على إحالة المشي بغض النظر عن تحول السرعة (الشكل 5C).
الشكل 1. ألف وضعت صور لحيوان التحضير. عرض AC أمامي من الكبسولة رئيس صرصور قطعتين من ورقة خلات بالقرب من tetrode لتوفير قاعدة للشمع. B. وكان من سلالة الإغاثة إنشاء د عن طريق الانحناء tetrode في الشمع. C . وتمت تغطية tetrode بالكامل من قبل الشمع الأسنان. عرض D. الظهرية من الجسم صرصور. تم إرفاق قضيب خشبي لpronotum الحيوان وكان يعلق على أنابيب tetrode إلى قضيب. وtetrode والإلكترود المرجعي / الأرض نحنإعادة مزيد من المضمون ضمهم للالأمامي للقضيب. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
الشكل 2. علامة سلك المواقع غيض. A. مقطع من الدماغ إعداد ن س 2، والتي تبين واحدة البني موقع ترسب النحاس في الجسم على شكل مروحة (الفيس بوك). الرسم التخطيطي B. من CC وموقع طرف السلك. PB، جسر protocerebral؛ الفيس بوك، على شكل مروحة الجسم؛ EB والجسم الإهليلجي اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
الرقم 3. و# 160؛ وتسجيل tetrode نموذجية آثار الجهد A. الخام من أقطاب واحدة ضمن حزمة واحدة tetrode. لاحظ الفرق من آثار الجهد بين الأقطاب المختلفة. تم فرز B. ثلاث وحدات باستخدام MClust. C. عرض 3 الابعاد من الطاقة الموجي كما هو مسجل على ثلاثة من الأقطاب الأربعة. كل نقطة هي مفرد عتبة، ونا مميزا من قبل الكتلة تم تعيينه في نهاية المطاف ل. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
. الرقم 4 لقطات من شريط فيديو لأحد محاكمة تسلق فوق كل إطار: سرعة تطبيع، وارتفاع الصرصور وكذلك معدل إطلاق النار لحظية من الوحدتين التي تم فرزها من الأول إلىالإطار الحالي. الوقت 0 يشير إلى بداية التسلق. تم تطبيع معدل اطلاق النار من 0-1، وكان تطبيع السرعة وارتفاع 0-0،5 لأغراض العرض. تحت كل الإطار: المسامير من الوحدتين التي تم فرزها داخل 1 ثانية من الإطار الحالي. الخط البرتقالي يدل على الوقت من خلال كل إطار والمستطيل الأزرق غطت يشير إلى ضعف العرض من النواة الذي تم استخدامه لحساب معدل اطلاق فوري للإطار الحالي. سميت الوحدات الفردية وفقا لإعداد وحدة أرقام (على سبيل المثال. "وحدة 1-2" يشير إلى إعداد 1، 2 وحدة). اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
الرقم 5. واحد لقطة من شريط الفيديو من واحد الساحة التنقيب محاكمة A. الأحمرخط البيضاوي يشير شكل صرصور في هذا الإطار والخط الأحمر يشير متقطع موقف مركز الصرصور للكتلة في إطارات 10 السابقة. الحق: تحول وإلى الأمام سرعة المشي وكذلك معدل اطلاق النار الفوري وحدة 2-1 في هذا الإطار. أدناه: المسامير وحدة 2-1 بعد 4 ثوانى من الإطار الحالي. كما في الشكل (4)، والخط البرتقالي يدل على الوقت من خلال كل إطار والمستطيل الأزرق غطت يشير إلى ضعف العرض من النواة الذي تم استخدامه لحساب معدل اطلاق فوري للإطار الحالي. باء مسار صرصور في كامل فيديو. النقطة السوداء الكبيرة يشير إلى نقطة البداية من صرصور وكل نقطة سوداء صغيرة يشير إلى موقف صرصور في كل إطار. مسار تم ونا مميزا مع معدل اطلاق النار الفوري وحدة 2-1، من الأزرق (منخفض) إلى اللون الأحمر (عالية). C. الخارطة معدل اطلاق الوحدة 2-1. للتجربة بأكملها، إلى الأمام والسلاحفسرعة rning فضلا عن أوقات ارتفاع وممهدة باستخدام نواة جاوس مع عرض 150 ميللي ثانية وقسمت إلى 50 ميللي ثانية المقاطع الطويلة غير المتداخلة. لكل قسم مقسمة، تم إنشاء ناقل السرعة عن طريق حساب متوسط السرعة إلى الأمام، وتحول في غضون تلك الفترة على التوالي. تم حساب معدل إطلاق النار أيضا لكل ناقل السرعة. تم اهمال كل ناقلات السرعة (10 ملم / ثانية لسرعة المشي إلى الأمام و 10 درجة / ثانية لتحويل السرعة) ولدت خريطة معدل إطلاق النار من جانب تتراكب معدل اطلاق بلغ متوسط لكل بن الحصول عليها عن طريق حساب متوسط جميع الأسعار اطلاق النار الذي ناقلات السرعة المقابلة سقط في أن بن ل. المحور العاشر هو سرعة تحول والمحور y هو سرعة المشي إلى الأمام. سرعة تحول إيجابي يشير إلى تحول الحق والسلبية سرعة التحول يشير إلى تحول اليسار. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في حين قدمت الدراسات السابقة الكهربية على CC أو مناطق أخرى من الدماغ الحشرات لنا نظرة ثاقبة لسيطرة مركزية من السلوك، وأجريت معظمها في الاستعدادات إما مقيدة أو تلك المربوطة 9،11 10،14. ونتيجة لذلك، فإن الحيوان التجربة الحسية والحالة الفسيولوجية يمكن أن تكون مختلفة جدا عن تلك الموجودة في بيئة طبيعية. علاوة على ذلك، المهام السلوكية التي يمكن أن تؤدي الحيوان تقتصر على طائرة واحدة بموجب تلك الحالات. نحن هنا قدم طريقة لتسجيل من الصراصير CC في التصرف بحرية. نأمل، قدمنا لكم مع كل المعلومات اللازمة ستحتاج للقبض على التسجيلات الكهربية في التصرف بحرية الحشرات في المختبر الخاص بك. قدمنا إجراءات الأنظمة التي نستخدمها (Neuralynx، MClust، WinAnalzye، وCtrax)، ولكن مرة واحدة يتم زرع أقطاب إعادة ترميز، وتسجيل الإعداد يمكن تكييفه بسهولة لأنظمة أخرى. & #160؛
وقد أجرينا الاستعدادات 27، واعتبارا من بعد تم إنهاء أي من التجارب لأن صرصور تلف مجموعات الأسلاك. ونحن لم يلحظ أي محاولة من هذا الحيوان لتنظيف أو إزالة مجموعات الأسلاك، والشمع، أو قضيب. مشى الصراصير مزروع في مشية عادية. انهم كانوا قادرين على استكشاف الساحة وتنفيذ مهام التسلق فقط، وكذلك تلك التي سليمة. تجاربنا عادة استمرت 2-4 ساعة بعد أن تم زرع tetrode. أحيانا بعض الوحدات اختفى أو تضاءل النشاط طوال الوقت، ولكن كانت معظم التسجيلات مستقرة جدا في كافة مراحل التجربة برمتها. لقد عزلت أيضا بعض المواد وعاد إلى تسجيل والتحفيز في اليوم التالي. يظهر هذا الأسلوب يمكن الاعتماد عليها لفترات طويلة من التسجيلات خارج الخلية في التصرف بحرية الحشرات.
نقطة واحدة من التركيز هي طبيعة الهشة لتقرير الاستثمار العالميمجموعات البريد. كانت معطوبة بسهولة إذا لم يتم توخي الحذر الشديد أثناء عملية البناء والغرس. دائما تحريك الأسلاك وأية أدوات تشريح بالقرب منها ببطء، والحرص على عدم عثرة أو المسيل للدموع عليهم. الأسلاك قد يتم سحبها بعناية من إعداد بعد الانتهاء من التجربة وlesioning، والسماح لاثنين أو ثلاثة من الاستخدامات. تأكد من إعادة اختبار، repolish، وreplate قبل كل استعمال.
المفتاح لإعداد الناجح هو للحفاظ على مجموعات الأسلاك بعيدا عن صرصور. نستخدم قضيب طويل يمتد من pronotum إليها أعلاه البطن وإرفاق أنابيب tetrode إلى نهاية الخلفي للقضيب. وبالتالي فإن أنابيب tetrode هو دائما وراء صرصور عندما يتحرك في ساحة من هذا القبيل أن الحشرات لا يمكن أن تصل إلى أنابيب مع الهوائيات، أو الساقين. وضع مجموعات الأسلاك وراء صرصور يوفر أيضا التخليص على جسم الحيوان. هذا يحسن من جودة الفيديو لدينا experime الساحةاليلة لأن الكاميرا يتوضع فوق الساحة. لا تترك الأسلاك الزائدة بين رأس الحيوان وأنابيب tetrode. إذا الحشرة يمكن أن تصل إلى الأسلاك مع الهوائيات، أو الساقين، فإنه سيتم كسر لهم. في هذه الطريقة، والشرائح أنابيب بحرية عبر السلك، مما يسمح لنا رسم الأسلاك الزائدة حتى وضمان الحصول عليها بالقرب من headstage.
واحد الحد من إمكانات أسلوبنا هو حجم الساحة حيث صرصور يمكن استكشاف. وtetrode هو 40 سم في الطول وهو ما يكفي لتوفير الوصول إلى كامل 40 × 40 سم 2 الساحة. ونحن لم تواجه مشاكل مثل الضوضاء ونوعية tetrode. ومع ذلك، يمكن أن تظهر مثل هذه المشاكل ونحن جعل tetrodes أطول لساحة أكبر. آخر مشكلة محتملة مع tetrode يعد وزن tetrode. لدينا tetrode وقضيب تزن حوالي 0.25 جرام والتي على ما يبدو لا تعيق 2-3 ز صرصور. لاحظنا الصراصير سليمة استكشاف نفس الساحة تستخدم لكهربائيتجارب trophysiology. كان النشاط المشي وسرعة الشاملة مماثلة بين الصراصير يحمل قضيب وtetrode والحيوانات غير المرتبط به. ومع ذلك، ونحن لم تختبر الحد من الحمولة التي صرصور يمكن أن تحمل قطرات قبل أدائها. حل واحد للقيود من سلك يعد لبناء منصة الآلية لheadstage والكاميرا. في ظل هذا النظام، يمكن للكاميرا تتبع تحركات صرصور في الوقت الحقيقي، والإخراج إلى الحركية بحيث يمكن ان تتحرك منصة فقا لذلك. وبالتالي، فإن tetrode قصيرة نسبيا تكون كافية لساحة كبيرة لأن headstage ستبقى مباشرة فوق الحيوان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب تعلن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
المؤلفين أشكر نيك كاثمان للاقتراحات ومساعدة في التحضير للمخطوطة. وقد تم تطوير هذه التقنية بالتعاون مع العمل بدعم من AFOSR تحت منحة FA9550-10-1-0054 والمؤسسة الوطنية للعلوم تحت المنحة رقم IOS-1120305 لRER.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nichrome wire | Sandvik Heating Technology | Kanthal RO-800 | Use for tetrode |
| Biomedical polyethylene tubing | A-M Systems | 800700 | Use for tetrode tubing |
| Lynx-8 | Neuralynx | Use for multiunit recording | |
| Cheetah 32 | Neuralynx | Use for multiunit recording | |
| High speed camera | Basler | A602f | Use for video recording for walking experiments |
| High speed camera | Casio | EX-FC150 | Use for video recording for climbing experiments |
| WINanalyze | Winanalyze | version 1.4 3D | Use for video tracking |
| MATLAB | MathWorks | MATLAB R2012b | Use for TTL pulse generation and offline data analysis |
References
- Strauss, R. The central complex and the genetic dissection of locomotor behaviour. Curr. Opin. Neurobiol. 12, 633-638 (2002).
- Pick, S., Strauss, R. Goal-driven behavioral adaptations in gap-climbing Drosophila. Curr. Biol. 15, 1473-1478 (2005).
- Triphan, T., Poeck, B., Neuser, K., Strauss, R. Visual targeting of motor actions in climbing Drosophila. Curr. Biol. 20, 663-668 (2010).
- Heinze, S., Gotthardt, S., Homberg, U. Transformation of polarized light information in the central complex of the locust. J. Neuorosci. 29, 11783-11793 (2009).
- Heinze, S., Homberg, U. Maplike representation of celestial E-vector orientations in the brain of an insect. Science. 315, 995-997 (2007).
- Heinze, S., Homberg, U. Neuroarchitecture of the central complex of the desert locust: Intrinsic and columnar neurons. J. Comp. Neurol. 511, 454-478 (2008).
- Heinze, S., Homberg, U. Linking the input to the output: new sets of neurons complement the polarization vision network in the locust central complex. J. Neurosci. 29, 4911-4921 (2009).
- Heinze, S., Reppert, S. M. Sun compass integration of skylight cues in migratory monarch butterflies. Neuron. 69, 345-358 (2011).
- Brill, M. F., et al. Parallel processing via a dual olfactory pathway in the honeybee. J Neurosci. 33, 2443-2456 (2013).
- Guo, P., Ritzmann, R. E. Neural activity in the central complex of the cockroach brain is linked to turning behaviors. J. Exp. Biol. 216, 992-1002 (2013).
- Ritzmann, R. E., Ridgel, A. L., Pollack, A. J. Multi-unit recording of antennal mechanosensitive units in the central complex of the cockroach, Blaberus discoidalis. J. Comp. Physiol. A. 194, 341-360 (2008).
- Buzsáki, G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nature Neurosci. 7.5, 446-445 (2004).
- Huston, S. J., Jayaraman, V. Studying sensorimotor integration in insects. Curr. Opin. Neurobiol. 21, 527-534 (2011).
- Bender, J. A., Pollack, A. J., Ritzmann, R. E. Neural activity in the central complex of the insect brain is linked to locomotor changes. Curr. Biol. 20, 921-926 (2010).
- Harrison, R. R., et al. Wireless Neural/EMG telemetry systems for small freely moving animals. IEEE. 5, 103-111 (2011).
- Straw, A. D., Dickinson, M. H. Motmot, an open-source toolkit for realtime video acquisition and analysis. Source Code Biol. Med. 4, 5 (2009).
- Strausfeld, N. J., Miller, T. A. Neuroanatomical Techniques. Insect Nervous System. , Springer Verlag. (1980).
- Daly, K., Wright, G., Smith, B. Molecular features of odorants systematically influence slow temporal responses across clusters of coordinated antennal lobe units in the moth, Manduca sexta. J. Neurophsyiol. 92, 236-254 (2004).
- Branson, K., Robie, A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat Methods. 6, 451-457 (2009).
