Summary
Wir haben bereits eine Technik entwickelt, zum Implantieren Tetrode Drähte in den zentralen Komplex der Schabe Gehirn, die uns in den einzelnen Einheiten der tethered Kakerlaken überwachen Aktivität ermöglicht. Hier präsentieren wir eine modifizierte Version der Technik, die uns auch die Gehirnaktivität aufgezeichnet in sich frei bewegenden Insekten ermöglicht.
Abstract
Das zunehmende Interesse an der Rolle der Hirnaktivität in Insektenmotorsteuerung erfordert, dass wir in der Lage zu überwachen neuronale Aktivität während Insekten führen natürliche Verhalten. Wir haben bereits eine Technik entwickelt, zum Implantieren Tetrode Drähte in den zentralen Komplex der Schabe Gehirne, die uns erlaubt, gleichzeitig die Aktivität mehrerer Neuronen aufzuzeichnen, während ein angebundenes Kakerlake schaltet oder veränderte Schrittgeschwindigkeit. Während ein großer Fortschritt, Fessel Vorbereitungen Zugang zu begrenzten Verhaltensweisen und oft nicht über Rückkopplungsprozesse, die in sich frei bewegenden Tieren auftreten. Wir präsentieren nun eine modifizierte Version der Technik, die uns aus dem zentralen Komplex der frei beweglichen Kakerlaken, wie sie zu Fuß in einer Arena und befassen sich mit Barrieren durch Drehen, Klettern oder Tunnel aufzeichnen können. Mit High-Speed-Video-und Schneid Cluster gekoppelt ist, können wir jetzt beziehen sich die Hirnaktivität auf verschiedene Parameter der Bewegung frei verhalten Insekten.
Introduction
Dieser Artikel beschreibt ein erfolgreiches System für die Aufnahme von Neuronen im zentralen Komplex (CC) der Schabe, Blaberus discoidalis, wie der Insektenwanderungen in einer Arena und befasst sich mit Objekten, die es auf etwa unter drehen, Tunnel-oder klettern über Hindernisse führen. Die Drähte können auch mit einem Stimulator, um die Aktivität in der umgebenden Neuropil mit nachfolgeVerhaltensÄnderungen hervorrufen verbunden werden.
Im letzten Jahrzehnt hat beträchtliche Aufmerksamkeit auf die Rolle von verschiedenen Hirnregionen bei der Kontrolle der Insektenverhalten gespielt gerichtet. Viel von diesem Schwerpunkt in Richtung der Mittellinie Gehirn Neuropilen die kollektiv als Zentralkomplex (CC) bezeichnet werden, gerichtet. Fortschritte wurden als Ergebnis von verschiedensten Techniken gezielt Fragen über die Rolle von CC-Verhalten erzielt. Diese Techniken reichen von neurogenetischen Manipulationen, vor allem in Drosophila, verbunden mit der VerhaltensMund Analyse 1-3, zu elektrophysiologischen Techniken, die neuronale Aktivität im CC und versuchen, diese Tätigkeit zu verhaltensrelevanten Parameter beziehen überwachen.
Elektrophysiologische Techniken umfassen intrazellulären Aufnahme von einzelnen identifizierten Neuronen 4-9 und extrazelluläre Aufnahme, oft mit Mehrkanal-Sonden 10,11. Diese beiden Techniken sind kostenlos. Intrazelluläre Aufnahme mit scharfen Elektroden oder ganze Zelle Patch liefert sehr detaillierte Daten über Neuronen identifiziert, aber ist mit einer oder zwei Zellen auf einmal begrenzt, erfordert begrenzte oder keine Bewegung, und kann für eine relativ kurze Zeit aufrechterhalten werden. Extrazelluläre Aufnahmen können leicht eingerichtet werden, keine Zurückhaltung erfordern, und kann für Stunden gehalten werden. Bei Mehrkanal-Tetroden und Cluster-Schneiden, können ziemlich große Populationen von Neuronen gleichzeitig 9,12 analysiert werden. Während ganze Zelle patch wurde erfolgreich in tethered Insekten 13 verwendet, fühlen wir, dass es auch eine Notwendigkeit für Techniken, die uns auf neuronale Aktivität im Gehirn aufzeichnen für längere Zeit in frei Insekten verhalten, als sie mit Barrieren zu befassen Vorwärtsbewegung zu ermöglichen.
Die Notwendigkeit, wie die Insekten bewegt und springt nach oben und unten geschoben aufzeichnen uns zu extrazellulären Aufnahmeverfahren. Wir haben gute Erfolge zurückhaltende Aufnahme in die Vorbereitungen mit handelsüblichen 16 Kanäle Silizium-Sonden 11, hatte jedoch die geringe Größe auch große Kakerlaken bedeutet, dass die Sonden müssen aus dem Körper angebracht werden. Das, gepaart mit der Zartheit der Sonde Zinken, machte sie nicht für eine kostenlose Stadt Vorbereitung. In zwei früheren Projekten haben wir Bündel von feinen Adern als Tetrode ähnliche Aufzeichnungseigenschaften zu erreichen, aber in einem robusteren Anordnung. Diese Tetrode Bündel erlaubt uns, von Kakerlaken angebunden aufzeichnen eind beziehen CC Einheit Aktivität auf Veränderungen in Schrittgeschwindigkeit 14 und Drehverhalten von anten Kontakt mit einer Stange 10 resultieren.
So nützlich diese Präparate angebunden wurde und wird weiterhin sein, präsentieren einige Einschränkungen tun sie. Erstens, die Verhaltensweisen, die das Insekt durchführen können, sind begrenzt auf einer Ebene. Das heißt, wir könnten leicht evozieren Veränderungen in Gehgeschwindigkeit oder Drehen, aber Klettern und Tunnel Aktionen waren nicht möglich, zumindest mit der typischen Halteseil Anordnung. Zweitens sind unsere Vorbereitungen tethered "Open-Loop". Das heißt, dass sie nicht für die normale Bewegung bezogene Rückkopplung zu dem System zu ermöglichen. So wie die Schabe schaltet unsere Haltegurt, dessen visuelle Welt nicht entsprechend geändert. Es ist möglich, Closed-Loop-Systeme zu bauen Halteseil, um diese Art von Feedback einzuführen. Sie sind jedoch durch die Komplexität der Programmierung und Hardware des simulierten visuellen Umgebung beschränkt. Nevertheless, fühlten wir uns, dass wir auf unsere bestehenden tethered Aufnahmeverfahren durch die Aufnahme von dem Tier zu verbessern, wie es ging frei in einer Arena oder Spur und stieß auf Objekte wie es wäre, in seiner natürlichen Umgebung.
Obwohl drahtlose Systeme für die Aufzeichnung von Gehirnaktivität 15 wäre ideal, aktuellen Systeme haben Beschränkungen in der Anzahl der Aufzeichnungskanäle, die Zeit der Datenerfassung, Akkulaufzeit und Gewicht. Wir haben deshalb entschieden, zu versuchen, unseren angebundenen Aufzeichnungssystem für den Einsatz in frei beweglichen Vorbereitungen anzupassen. Wie besser drahtlose Systeme zur Verfügung stehen, kann dieses Verfahren leicht auf solche Vorrichtungen angepasst werden. Das System, das in diesem Artikel beschrieben wird ist leicht, funktioniert sehr gut und scheint wenig schädliche Wirkung auf das Verhalten der Schabe haben. Mit einem preiswerten Hochgeschwindigkeitskamera und Cluster-Schneidesoftware, kann die Aktivität einzelner Nervenzellen im Gehirn, um die Bewegung bezogen werden. Hier beschreiben wir die preparation der Tetrode Drähte und ihre Implantation in das Insekt Gehirn sowie Aufnahmetechniken für die elektrische Aktivität und Bewegung, und wie diese Daten können für eine nachfolgende Analyse zusammengebracht werden.
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Protocol
1. Vorbereitung der Tetrode Drähte
- Ziehen Sie eine sehr dünne Nichromdraht (Durchmesser 12 um, PAC-Beschichtung) von etwa 1,1 m Länge. Befestigen Sie ein Band-Tag an jedem Ende. Aufhängen des Drahtes über eine horizontale Gewindestange, so dass die beiden Enden auf der gleichen Höhe in der Nähe der Tischplatte.
- Wiederholen Sie Schritt 1.1 für einen zweiten Draht, so dass zwei weitere Enden für insgesamt 4, und legen Sie sie neben dem ersten Draht (etwa 1 cm dazwischen).
- Kleben Sie die vier Enden zusammen mit einem Band-Tag und bringen Sie den Tag mit einem motorisierten Drehwickelvorrichtung. Diese Vorrichtung kann aus einem preiswerten Gleichstrommotor erfolgen.
- Wickeln der Tetrode in einer Richtung für 2 min (60 rpm) und Entspannen in der Gegenrichtung für 30 Sekunden.
- Verwenden Sie eine Heißluftpistole, um die Drähte miteinander zu verschmelzen. Die Drähte nicht berühren, mit der Pistole. Verwenden Sie drei nach oben und unten aus wechselnden Richtungen spielt mit jedem Durchlauf dauert etwa 10 Sekunden.
- Schneiden der Oberseite und der Unterseite der Wickeldrähte. Die vier Drähte verdreht sind einan einem Ende fusioniert D gemeinsam, aber getrennt an dem anderen.
- Fügen Sie die Stützrohr. Schneiden Sie ein 30 cm Länge von Polyethylen-Schlauch (Durchmesser: 0,28 mm innen, außen 0,61 mm). Fädeln Sie den Tetrode sehr langsam und vorsichtig in das Tragrohr, so dass sie nicht knicken.
- Sobald die geschmolzene Ende erscheint auf der anderen Seite, durchziehen, so daß es eine gleiche Länge des Drahtes an beiden Enden des Führungsrohrs.
- Besorgen Sie sich die getrennten Ende jeder Draht mit einer Zange. Mit der Basis der Flamme eines Gasbrenners, sorgfältig zu verbrennen die Isolierung aus der letzten 2 oder 3 mm von jedem Draht. Heizen Sie den Draht, bis es glüht, aber nicht kräuseln.
- Schließen Sie die Tetrode mit einer Mann-Frau-IC-Sockel-Adapter, der das Aufnahmegerät passt. Setzen Sie den deinsulated Ende jedes Drahtes in eine andere Steckdose des Adapters mit einer Pinzette. Stabilisieren Sie den Draht in die Buchse mit einem kleinen Messingstift. Verwenden Sie einen feinen Spitze Lötkolben und füllen den Sockel mit dem geschmolzenen Lot. Seien Sie vorsichtig, um nicht zu kontaktierender zerbrechliche Draht mit dem Lötkolben.
- Überprüfen Sie die Impedanz jeder Draht und die inter Impedanz jedes Adernpaar.
- Platzieren des geschmolzenen, verdrehte Ende in einen Behälter mit Salzlösung und eine Verbindung ein Kupferdrahtleiter von der Salzlösung zu dem Ohmmeter.
- Das andere Ende des Messgeräts auf den Steckbolzen, die den Draht. Die Impedanz jeder Draht sollte unter 3 MOhm sein.
- Wenn die oben genannten Werte nicht erreicht werden, erneut versuchen, die Lötverbindungen.
- Entfernen Sie die Kabel von der Kochsalzlösung, spülen Sie die Spitzen mit Wasser, und testen Sie die unter Draht Impedanz für jede Paarung (n = 6). Die Zwischenwiderstand sollte über 5 MOhm sein.
- Wenn die oben genannten Werte nicht erreicht werden, schneiden Sie eine kleine Menge von der Spitze an der fusionierten Ende und erneut zu testen.
- Entsorgen Sie alle Kabelsatz, die nicht erfüllt, sowohl der Impedanzanforderungen für alle Drähte.
- Sichern Sie die Tetrode.
- Falten Sie ein kleine rechteckige Pappschachtel slightly größer als der Steckdosenadapter.
- Bringen Sie den Adapter in der Box mit der männlichen Seite an der Unterseite. Dringen das Feld, so daß alle Stifte der männlichen Seite außerhalb der Box, während der Rest des Adapters innerhalb des Kastens.
- Kleben Sie die Ecken der Box auf der Außenseite. Verwenden Sie kleine Stücke von doppelseitiges Klebeband auf der Innenseite der Box, einzelne Litzen zu stabilisieren. Der Draht sollte verschmolzen werden, wie es aus dem Feld.
- Mischen Sie schnell Satz 2 Komponenten Epoxidharz und gießen Sie in das Feld, um den Adapter und alle Drähte zu sichern.
- Befestigen Sie das nahe Ende der Führungsschlauch an einer Seite der Box mit Dentalwachs, aber lassen Sie die Rohrleitung, so dass der Tetrode kann durch frei an beiden Enden gezogen werden öffnen.
- Schärfen Sie die Tetrode.
- Vor jedem Versuch, schneiden Sie die Spitze der Tetrode mit einem scharfen Skalpell, keine Schere. Dies verhindert, Brech-und Spreizen der Drahtenden, während eine saubere flache Kante für den nächsten Schritt.
- Das gewünschte Ergebnis wandelt das Bündelende von einer geraden Kante zu einer Spitze mit kleinen Mengen Isolierung vom Ende jedes Drahtes entfernt. Überprüfen Sie den Punkt mit einem Binokular vor dem Beschichten der Tetrode. Wenn ein Ausfransen an der Spitze auf, nachgeschnitten und nachpolieren.
- Wenn Impedanz Tests während der subsequent Beschichtungsschritt zeigt extrem niedrige Werte unter Draht (weniger als 4 MQ), zeigt es zu viel Material während des Polierschritt entfernt. Umschnitt und nachpolieren die Tetrode.
- Vor jedem Versuch, schneiden Sie die Spitze der Tetrode mit einem scharfen Skalpell, keine Schere. Dies verhindert, Brech-und Spreizen der Drahtenden, während eine saubere flache Kante für den nächsten Schritt.
- Platte der Tetrode. Setzen Sie die Spitze des Tetrode in eine gesättigte Kupfersulfat-Lösung (85 ml Wasser, 5 ml Schwefelsäure, 50 g Kupfersulfat). Platte jeder Draht mit einem Strom von 2,5 &mgr; A mit einem Stimulus Isolator. Spritzen Sie die Strom für 1 Sek., Pause für 1 Sek. und wiederholen Sie diesen Vorgang 4x.
- Prüfen Sie die Impedanz eines jeden Drahtes und der interimpedance von jedem Paar von Drähten. Die Impedanz von jedem Draht sollte zwischen 0,5 bis 1 MOhm und der Zwischenwiderstand sollte über 4 MOhm sein.
- Montieren Sie den Adapter auf die heads eines Mehrkanal-Recording-System.
- Bringen Sie einen gebogenen Insektenstift zu einem Mikromanipulator. Bringen Sie die Spitze der Tetrode zu den Insekten Stift mit Dentalwachs
2. Vorbereitung der Tiere
- Anesthetize dieKakerlake mit Eis.
- Nachdem die Kakerlake mehr bewegt, hemmen die Kakerlake vertikal zu einer flachen Oberfläche Kork mit großen Sattel Pins, die das Insekt zu überspannen, aber einen Teil seines Körpers nicht durchdringen.
- Übertragen Sie die Zubereitung in einem Kunststoffbehälter und legen Eis rund um das Tier, den Blutfluss und Körperbewegungen zu minimieren.
- Positionieren Sie eine Kunststoffkragen am Hals, um den Kopf zu stützen und legen Dentalwachs um den Kopf, um sie zu stabilisieren.
- Schneiden Sie ein kleines Fenster zwischen der Augenflecken mit einer Rasierklinge und entfernen Sie die Nagelhaut aus dem Kopf.
- Entfernen Bindegewebe und Fett mit einer Pinzette, um das Gehirn freizulegen.
- Legen Sie einige Kakerlake Salzlösung in die Kopfkapsel, die Hirngewebe abzudecken.
- Um das Gehirn desheath, verwenden Sie einer feinen Pinzette vorsichtig greifen die Hülle auf der Oberseite des Gehirns und verwenden Sie ein anderes feinen Pinzette, um den Mantel auseinander in der Drahtbereich implantiert reißen.
- Öffnen Sie ein kleines Loch in der vorderen Kopfkapsel an das Gehirn Witzh ein Insekt Pin. Legen Sie ein Geflecht von drei größeren Durchmessern (56 um) isolierten Kupferdrähten in das Loch, um als Referenz / Masseelektrode dienen.
- Senken Sie die Spitze der Tetrode auf der Hirnoberfläche mit dem Mikromanipulator und positionieren Sie es in der Nähe der Hirnregion von Interesse.
- Vorsichtig zwei kleine Stücke von dünnen Azetat (2 mm x 1 mm), etwas größer als das Loch in der Kopfkapsel, vor und hinter der Tetrode.
- Einschalten des Aufzeichnungssystems.
- Langsam senken die Tetrode 150-250 &mgr; m unter der Hirnoberfläche je nach Aufnahmequalität.
- Schalten Sie das Aufzeichnungssystem.
- Bewegen der beiden Stücke Azetat möglichst nahe an der Tetrode wie möglich, ohne es zu berühren (Fig. 1A).
- Erhitzt eine kleine Spachtel oder abgeflachte Injektionsnadel und steckte es in Dentalwachs, so dass es flüssiges Wachs an der Spitze der Spachtel. Das andere Ende von jedem Stück von Acetat-Folie von der vorsichtig berührenTetrode mit dem Spatel, so dass flüssiges Wachs kann auf jedem Stück fließen und verschließen die Lücke zwischen ihm und dem Kopf Nagelhaut.
- Wiederholen Sie Schritt 2.16. Lassen Sie eine kleine Menge des flüssigen Wachses auf die Acetatfolie jeder Zeit. Starten Sie den Prozess weit weg von der Tetrode und bewegen sich allmählich auf ihn zu. Schließlich wird die Tetrode wird von Dentalwachs verankert werden. Vermeiden Sie, dass heißes Wachs in den Hohlraum und auf das Gehirn.
- Verwenden Sie die gleiche Methode wie die Schritte 2,16 und 2,17, um die Referenz / Masseelektrode mit Wachs zu verankern.
- Erhitzen Sie das Wachs, das die Tetrode wird an der Mikromanipulator, um die Tetrode von ihm zu lösen.
- Schlingen Sie die Tetrode in die Dentalwachs auf den Kopf, um eine Zugentlastung (1B) zu liefern.
- Decken Sie die Zugentlastung Schleife mit Dentalwachs (Abbildung 1C).
- Entfernen Sie vorsichtig die Zwänge und übertragen Sie die Vorbereitung auf eine Petrischale. Rain die Vorbereitung Rückenseite mit großen Sattel Pins.
- Befestigeneine Stange an der Halsschild mit einer Klebepistole. Dies ist ein Holzstäbchen, die aus dem Halsschild über den Bauch erstreckt.
- Bringen Sie die Spitze der Tetrode Schlauch an dem hinteren Ende der Stange mit Dentalwachs.
- Verankern Sie die Tetrode und die Bezugs / Masseelektrode zur vorderen Ende der Stange mit Dentalwachs.
- Ziehen der Tetrode aus dem Muffenende des Rohrstranges so weit wie möglich, aber nicht auf sie zu zerren, um die Chance, dass das Tier den Abschnitt des Tetrode außerhalb der Rohrleitung (1D) beschädigt zu beseitigen.
- Entfernen Sie alle Beschränkungen. Befestigen Sie die Referenz / Masse-Elektrode mit der Tetrode Schlauch mit Dentalwachs.
- Warten Sie mindestens 60 Minuten für das Tier, von dem Eis vor jedem Experiment Narkose erholen.
3. Experimentelle Verfahren
- Schließen Sie einen PC sowohl mit dem Aufzeichnungssystem und einer LED-Licht mit einem USB-Kabel an den seriellen Port.
- Starten neuronalen Aufnahmen.
- Starten Sie Videoaufnahmen mit 20 Bildern pro Sekunde für das Gehen Experimente mit dem Bild Motmot Erwerb Paket 16 oder 120 fps für Kletterversuche mit einer Hochgeschwindigkeitskamera.
- Legen Sie die Kakerlake in ein 40 cm x 40 cm Plexiglas Arena für Experimente zu Fuß oder ein 58 cm lang, 5 cm breit und 5 cm hoch Arena für Kletterversuche. Das Lauf Arena eine transparente Barriere, die sich von der Mitte der rechten Wand zur Mitte der Bahn, über der die heads befindet. Die Barriere wird verwendet, um Tiere aus zu Fuß in Bereichen, wo die Kamera-Ansicht wird durch die heads blockiert verhindern. Die Kletterarena hat einen Acrylblock (entweder 1,2 cm oder 1,8 cm hoch und 5 cm breit) oder ein Regal an einer vergleichbaren Höhe in der Mitte.
- Generieren Sie einen TTL-Impuls vom PC aus über eine maßgeschneiderte MATLAB-Befehl. (S = seriell ('COM4'); fopen (s); s.RequestToSend = 'off' / s.RequestToSend = 'auf' /; fclose (s); löschen (s) ;). Der TTL-Puls erzeugt ein malstampfen für das Aufzeichnungssystem und entweder ein-oder ausgeschaltet wird das LED-Licht.
- Lassen Sie die Kakerlake, die Arena zu erkunden, bis es nicht mehr bewegt seit mehr als 30 Sekunden, um zu Fuß Experimenten. Lassen Sie die Kakerlake, entweder den Block / Regal oder Tunnel klettern über durch das Regal für Kletterversuche.
- Stoppen Sie die Videoaufnahmen.
- Stoppen neuronalen Aufnahmen.
- Notieren Sie sich die von der TTL-Impuls erzeugt Zeitstempel.
- Entfernen Sie die Schabe aus der Arena und warten Sie mindestens 3 min.
- Wiederholen Sie die Schritte 3,2-3,10 für den nächsten Versuch.
- Sobald alle Aufnahmen abgeschlossen sind, vergehen 5 Sekunden von 5 uA Gleichstrom durch einen der Drahtspitzen (Anode) und der Referenzelektrode (Kathode) zu Kupfer in das Gehirn an der Drahtspitze hinterlegen.
4. Offline-Analyse
- Synchronisieren von Video-und neuronalen Daten durch die Verknüpfung der Rahmen, in dem das LED-Licht eingeschaltet ist und die Zeitstempel von der Aufzeichnungssystem aufgezeichnetdieser Moment.
- Mark Drahtspitze Standorten. Verwenden Timms Intensivierung Verfahren in 12 um Serienschnitte 17 ausfallen und beobachten die Kupfer. Prominente Ablagerungen sollten in 3-8 benachbarten Abschnitte (etwa 18-48% der Länge des dorsalen ventralen Ebene der Bereich, den wir aus aufzeichnen) (Abbildung 2) zu sehen sein.
- Korrelieren spezifische elektrische Impulse an die Aktivität einzelner Neuronen. Folgen Spike im Detail an anderer Stelle 10,14,18 gelegt Sortierverfahren. Verwenden Sie das Programm KlustaKwik (Version 1.5, Autor K. Harris, Rutgers University), um erste, automatische Clustering erzeugen. Importieren Sie sie in das Programm MClust (Version 3.5, Autoren Redish AD et al., University of Minnesota) für die weitere Verfeinerung und Analyse (Abbildung 3).
- Verfolgen Sie die Bewegungen der Schabe. Für Experimente zu Fuß, extrahieren Sie die Position der Schabe (visuell) Mitte der Masse und ihrer Körperorientierung in jedem Rahmen des video Aufnahmen über den Caltech Mehrere Fly Tracker (Version 0.1.5.6; http://ctrax.sourceforge.net/) und die damit verbundene FixErrors Toolbox für MATLAB 19. Für Kletterversuche, extrahieren Sie die Position des Blocks und Kopf-und Halsschild der Schabe in jedem Frame des Videos mit Bewegungsanalyse-Software-Paket.
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Representative Results
Wir nahmen die neuronale Aktivität von 50 Einheiten aus dem CC in 27 Vorbereitungen für das Gehen Experimenten. Für 15 dieser Präparate (23 Einheiten), wurden Kletterversuche ebenfalls durchgeführt. Einzelgeräte werden nach der Zubereitung und Stückzahlen benannt (z. B. Einheit 1-2 zeigt Vorbereitung 1, Einheit 2).
Momentaufnahmen aus dem Video von einem Kletter Studie sind in Abbildung 4 dargestellt. Das gesamte Video ist in ergänzenden Video 1 verfügbar (Der Klang ist von der Einheit 1-2). Die Aufnahme wurde in der rechten fächerförmigen Körper (FB) gemacht. Die Schabe blieb stehen, wenn es begegnet den Block und seine Antennen verwendet, um den Block (Abb. 4A-C) zu beurteilen. Dann hob die Schabe die Vorderseite seines Körpers, die Änderung der Körpersubstrat Winkel (Abb. 4D-E), bevor er schwang sein Bein nach oben in den Block und kletterte über sie (4F-I). Die Geschwindigkeit und die Höhe der the Schabe sowie der momentane Brennrate der beiden sortierten Einheiten von der ersten in dem aktuellen Rahmen sind über jedem Rahmen dargestellt. Der momentane Brennrate wurde durch Glätten Spike Zeiten jedes Gerät mit einem Gauß-Kern mit einer Breite von 50 ms berechnet. Die Feuerrate von Einheit 1-1 erhöhte sich im Klettern und die Erhöhung der Feuerrate ging der Anstieg der Geschwindigkeit (4I). Einheit 1-2 schwieg aber vor dem Klettern zu feuern, nachdem Kletter eingeleitet (4I) gestartet. Die Spitzen der zwei sortierten Einheiten innerhalb 1 Sekunde des aktuellen Rahmens unter jedem Rahmen angezeigt. Die orangefarbene Linie zeigt die Zeit, die jeden Rahmen und dem blauen Rechteck bedeckt zeigt die doppelte Breite des Kernels, der verwendet wurde, um die momentane Feuerrate für den aktuellen Rahmen zu berechnen.
Eine Momentaufnahme des Video von einem Explorations-Arena-Studie ist in 5A gezeigt. Das gesamte Video ist avTENBLÄTTER in ergänzenden Video 2 (Der Klang ist von der Einheit 2-1). Die Aufnahme wurde in der Mitte FB gemacht. Die Position der Küchenschabe und seine Körperorientierung in jedem Rahmen unter Verwendung Ctrax extrahiert und verwendet, um zu berechnen, und vorwärts in Richtung Geschwindigkeit sowie momentane Brenngeschwindigkeit. Die Flugbahn der Schabe im gesamten Video ist in Fig. 5B gezeigt. Jeder schwarze Punkt bezeichnet die Position der Schabe in jedem Rahmen und der Pfad mit der momentanen Farbe Feuerungsrate Einheit 2-1 codiert. Wie wir in je-Studie mit einer konstanten Framerate (dh 20 fps), desto länger der Abstand zwischen zwei Punkten ist, desto schneller die Geschwindigkeit zu dieser Zeit. Die Feuerrate von Einheit 2-1 erhöht, wenn die Schabe begann zu laufen und war mit Schrittgeschwindigkeit korreliert. Um die Abstimmung der einzelnen Einheiten, um die Fortbewegung Zustand des Tieres (dh Geschwindigkeit und Richtung) zu untersuchen, konstruierten wir Feuerrate Karten basierend auf Schrittgeschwindigkeit vorwärts und turning Geschwindigkeit für jede Einheit. Für viele CC-Einheiten wurde erhöht Feuerrate, spezifische Fortbewegung Staaten beschränkt. Zum Beispiel, Einheit 2-1 wurde abgestimmt, um zu Fuß weiterzuleiten, unabhängig von der Drehgeschwindigkeit (Abbildung 5C).
Fig. 1 ist. Fotos von Tierpräparation. AC Frontalansicht der Schabe Kopfkapsel. A. Zwei Stücke von Acetat Blatt war, wurden in der Nähe der Tetrode, um die Basis für die Wachs bieten. B. Eine Zugentlastung war zu schaffen d durch Biegen der Tetrode in Wachs. C . Die Tetrode wurde vollständig durch Dentalwachs abgedeckt. D. Dorsale Ansicht der Schabe Körper. Ein Holzstab wurde an das Tierhalsschild angebracht und die Tetrode Schlauch wurde an der Stange befestigt ist. Die Tetrode und die Referenz / Masseelektrode wirwieder weiter, indem sie an der vorderen der Stange befestigt. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
2. Mark Drahtspitze Standorte. A. Ein Teil des Gehirns der Vorbereitung n o 2, die eine braune Kupferabscheidung Standort in der fächerförmigen Körper (FB). B. Schematische Darstellung der CC und die Drahtspitze Lage. PB, Protocerebralbrücke, FB, fächerförmigen Körper;. EB, Ellipsoidkörper Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
3. &# 160; Eine typische Tetrode Aufnahme A. Raw Spannung Spuren von einzelnen Elektroden innerhalb einer Tetrode Bundle.. Man beachte den Unterschied der Spannung zwischen den verschiedenen Spuren Elektroden. B. Drei-Einheiten wurden mit MClust. C. 3-dimensionale Darstellung der Wellenenergie auf drei der vier Elektroden erfasst sortiert. Jeder Punkt ist eine einzige Schwelle Veranstaltung, Farbe durch den Cluster wurde es schließlich zu vergeben codiert. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
.. Abbildung 4 Snapshots des Videos von einem Kletter Studie Über jedem Rahmen: normalisierte Geschwindigkeit, Höhe der Schabe sowie sofortige Feuerrate der beiden sortierten Einheiten von der ersten auf dieaktuellen Rahmen. Zeit 0 zeigt das Auftreten von Klettern. Brennrate von 0-1 normalisiert und Geschwindigkeit und Höhe wurden 0-0,5 für die Anzeige normalisiert. Unterhalb jedes Rahmens: die Spitzen der zwei sortierten Einheiten innerhalb 1 Sekunde des aktuellen Rahmens. Die orangefarbene Linie zeigt die Zeit, die jeden Rahmen und dem blauen Rechteck bedeckt zeigt die doppelte Breite des Kernels, der verwendet wurde, um die momentane Feuerrate für den aktuellen Rahmen zu berechnen. Einzelne Einheiten wurden nach Vorbereitung und Stückzahlen benannt (z. B. ". Einheit 1-2" zeigt Vorbereitung 1, Einheit 2). Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
Abbildung 5. Eine Momentaufnahme des Video von einem Explorations-Arena Studie A. Der roteoval Linie zeigt die Form der Kakerlake in diesem Rahmen und die rote gestrichelte Linie zeigt die Position der Schabe Mitte der Masse in den vorangegangenen 10 Frames. Rechts: Dreh-und Vorwärtsschrittgeschwindigkeit sowie die momentane Feuerrate Einheit 2-1 in diesem Rahmen. Unten: die Spitzen der Einheit 2-1 innerhalb von 4 Sekunden des aktuellen Rahmens. Wie in Fig. 4, zeigt die orange Linie die Zeit, die jeden Rahmen und das blaue Rechteck gedeckt zeigt die doppelte Breite des Kerns, der verwendet wurde, um die momentane Feuerungsrate für den aktuellen Rahmen zu berechnen. B. Die Bahn der Schabe im gesamten Video. Der große schwarze Punkt zeigt den Ausgangspunkt der Schabe, und jeder kleine schwarze Punkt zeigt die Position der Schabe in jedem Rahmen. Die Bahn wurde Farbe in rot (hoch). C. Die Brenngeschwindigkeit Karte von Einheit 2-1 codiert mit der momentanen Feuerrate Einheit 2-1, von blau (niedrig). Für das gesamte Experiment, vorwärts und turning Geschwindigkeit sowie Spike Zeiten wurden unter Verwendung eines Gauß-Kern mit einer Breite von 150 ms geglättet und wurden in nicht überlappende 50 ms lange Abschnitte geteilt. Für jeden Abschnitt unterteilt wurde ein Geschwindigkeitsvektor durch Mittelung vorne und Drehgeschwindigkeit innerhalb dieser Frist bzw. erzeugt. Brennrate für jeden Geschwindigkeitsvektor wurde ebenfalls berechnet. Alle Geschwindigkeitsvektoren wurden klassierte (10 mm / s für die Vorwärtsschrittgeschwindigkeit und 10 Grad / s für Drehgeschwindigkeit) und eine Feuerrate der Karte wurde durch die Überlagerung der gemittelten Feuerrate für jeden Behälter durch Mittelung alle Feuerraten, deren entsprechende Geschwindigkeitsvektoren erhalten erzeugt fiel in diesem Fach. X-Achse ist die Drehgeschwindigkeit und y-Achse ist die Schrittgeschwindigkeit vorwärts. Positive Drehgeschwindigkeit zeigt rechts drehen und negative Drehgeschwindigkeit zeigt links drehen. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
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Discussion
Während frühere elektrophysiologische Untersuchungen zur CC oder anderen Regionen der Insektengehirn haben uns Einblicke in die zentrale Steuerung von Verhalten zur Verfügung gestellt, wurden die meisten von ihnen entweder in zurückhaltenden Vorbereitungen 9,11 oder vernetzt diejenigen 10,14 durchgeführt. Als Ergebnis des Tieres sensorische Erfahrung und physiologischen Zustand sehr verschieden von denen in der Natur sein könnte. Darüber hinaus sind die Aufgaben, die der Verhaltens Tier führen können, sind unter diesen Situationen beschränkt sich auf einer Ebene. Hier haben wir eine Methode, um aus dem CC in frei verhalten Kakerlaken aufzeichnen. Hoffentlich haben wir Sie mit allen notwendigen Informationen, die Sie benötigen, um elektrophysiologischen Ableitungen in frei verhalten Insekten im eigenen Labor zu erfassen ist. Wir präsentierten die Verfahren für die Systeme, die wir verwenden (Neuralynx, MClust, WinAnalzye und Ctrax), aber sobald die Umkodierung Elektroden implantiert werden, können die Aufnahme-Setup ohne weiteres auf andere Systeme angepasst werden. & #160;
Wir haben 27 Präparaten durchgeführt, und als der noch keiner der Versuche wurde beendet, weil die Schabe beschädigt die Leitungssätze. Wir haben nicht jeden Versuch durch das Tier zu reinigen oder zu entfernen Sie den Draht-Sets, Wachs oder Stange beobachtet. Die implantierten Kakerlaken ging in einem normalen Gang. Sie waren in der Lage, die Arena zu erkunden und durchzuführen, Klettern Aufgaben genauso gut wie diejenigen, intakt. Unsere Experimente dauerten in der Regel 2-4 Stunden nach der Tetrode implantiert wurde. Gelegentlich einige Einheiten verschwunden oder ihre Tätigkeit im Laufe der Zeit verringert, aber die meisten Aufnahmen waren während des gesamten Experiments sehr stabil. Wir haben auch einige Probanden isoliert und kehrte nach Ableitung und Stimulation des folgenden Tages. Dieses Verfahren wird zuverlässig über längere Zeiträume extrazelluläre Aufzeichnungen in frei verhalten Insekten.
Ein Schwerpunkt ist die fragile Natur der Verdrahtunge-Sets. Sie sind leicht beschädigt werden, wenn nicht große Sorgfalt bei der Konstruktion und der Implantation entnommen. Immer bewegen die Drähte und alle Instrumente in der Nähe Seziersaal sie langsam, man aufpassen, nicht zu stoßen oder reißen sie. Drähte können vorsichtig aus der Herstellung nach dem Experiment abgeschlossen und Läsion gezogen werden, so dass zwei oder drei Verwendungen. Achten Sie darauf, erneut zu testen, nachpolieren und Ausstrich vor jedem Gebrauch.
Der Schlüssel zu einer erfolgreichen Vorbereitung ist es, die Leitungssätze von der Kakerlake zu halten. Wir verwenden eine lange Stange, die sich von der Halsschild über dem Bauch und befestigen Tetrode Schlauch an dem hinteren Ende der Stange. Folglich ist die Tetrode Schlauch immer hinter der Schabe, wenn es sich bewegt in einer Arena, so dass das Insekt den Schlauch mit der Antennen oder Beine nicht erreichen. Die Platzierung der Draht-Sets hinter der Schabe bietet auch Freiraum über dem Körper des Tieres. Dies verbessert die Videoqualität unserer Arena experiments, weil die Kamera über der Arena positioniert. Lassen Sie keine Überleitungen zwischen den Kopf des Tieres und der Tetrode Schläuche. Wenn das Insekt die Drähte mit ihren Fühlern und Beinen zu erreichen, wird es sie zu brechen. In diesem Verfahren werden die Schläuche frei gleitet über den Draht, so dass wir bis überschüssigen Draht ziehen und befestigen Sie sie in der Nähe des heads.
Eine mögliche Einschränkung unserer Methode ist die Größe der Arena, wo die Schabe zu erkunden. Die Tetrode 40 cm Länge, die genug ist, um Zugriff auf die gesamte 40 x 40 cm 2 Arena bereitzustellen. Wir haben keine Probleme wie Lärm und Tetrode Qualität angetroffen. Allerdings könnten solche Probleme auftreten, wie wir mehr machen Tetroden für eine größere Arena. Ein weiteres potentielles Problem mit einer längeren Tetrode ist das Gewicht der Tetrode. Unsere Tetrode und Stangen wiegen etwa 0,25 g, die offenbar nicht einen 2-3 g Kakerlake nicht behindern. Wir beobachteten intakt Kakerlaken Erkundung der gleichen Arena für elek verwendetPhysiologie Experimente. Die Wanderaktivität und Gesamtgeschwindigkeit waren zwischen Kakerlaken, der eine Stange und Tetrode und unbelasteten Tieren. Wir haben jedoch nicht die Grenze der Belastung, die eine Kakerlake kann vor seiner Leistung Tropfen tragen getestet. Eine Lösung für die Einschränkungen eines längeren Drahtes ist, einen motorisierten Plattform für die heads und der Kamera zu bauen. In einem solchen System kann die Kamera Bewegungen der Schabe in Echtzeit und an den Motor ausgegeben, so dass die Plattform entsprechend bewegt zu verfolgen. Daher wäre eine relativ kurze Tetrode ausreichen für eine große Arena, weil die heads wäre direkt über das Tier bleibt.
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Disclosures
Die Autoren erklären, keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Die Autoren danken Nick Kathman für Anregungen und Hilfe bei der Vorbereitung des Manuskripts. Diese Technik wurde in Verbindung mit der Arbeit der unter dem Förder AFOSR FA9550-10-1 bis 0054 und die National Science Foundation unter Grant No IOS-1120305 RER unterstützt entwickelt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nichrome wire | Sandvik Heating Technology | Kanthal RO-800 | Use for tetrode |
| Biomedical polyethylene tubing | A-M Systems | 800700 | Use for tetrode tubing |
| Lynx-8 | Neuralynx | Use for multiunit recording | |
| Cheetah 32 | Neuralynx | Use for multiunit recording | |
| High speed camera | Basler | A602f | Use for video recording for walking experiments |
| High speed camera | Casio | EX-FC150 | Use for video recording for climbing experiments |
| WINanalyze | Winanalyze | version 1.4 3D | Use for video tracking |
| MATLAB | MathWorks | MATLAB R2012b | Use for TTL pulse generation and offline data analysis |
References
- Strauss, R. The central complex and the genetic dissection of locomotor behaviour. Curr. Opin. Neurobiol. 12, 633-638 (2002).
- Pick, S., Strauss, R. Goal-driven behavioral adaptations in gap-climbing Drosophila. Curr. Biol. 15, 1473-1478 (2005).
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