Ekstracellulær Wire Tetrode opptak i hjernen til Fritt Walking Insekter

Summary

Vi har tidligere utviklet en teknikk for å implantere tetrode ledningene inn i sentrale komplekset av kakerlakk hjerner som tillater oss å overvåke aktiviteten i enkelte enheter av tethered kakerlakker. Her presenterer vi en modifisert versjon av den teknikken som gjør det mulig for oss å også ta opp hjernens aktivitet i fritt bevegelige insekter.

Abstract

Økende interesse i rollen som hjernens aktivitet i insekt motorisk kontroll fordrer at vi er i stand til å overvåke hjerneaktiviteten mens insekter utføre naturlig atferd. Vi har tidligere utviklet en teknikk for å implantere tetrode ledningene inn i sentrale komplekset av kakerlakk hjerner som mulig for oss å registrere aktivitet fra flere nevroner samtidig mens en tethered kakerlakk slått eller endrede gangfart. Mens et stort fremskritt, tethered forberedelser gi tilgang til begrensede atferd og mangler ofte tilbakemeldinger prosesser som skjer i fritt bevegelige dyr. Vi presenterer nå en modifisert versjon av den teknikken som gjør det mulig for oss å ta opp fra den sentrale komplekset av fritt bevegelige kakerlakker som de går på en arena og håndtere barrierer ved å slå, klatring eller tunneling. Sammen med høyhastighets video og cluster skjæring, kan vi nå forholde hjerneaktiviteten til ulike parametere for bevegelse av fritt oppfører insekter.

Introduction

Denne artikkelen beskriver et vellykket system for registrering fra nerveceller i sentralkomplekset (CC) av kakerlakk, Blaberus discoidalis, som insektet går på en arena og avtaler med objekter som får det til å snu, tunnel under, eller klatre over hindringer. Ledningene kan også kobles til en stimulator for å fremkalle aktivitet i det omkringliggende neuropil med påfølgende atferdsendringer.

I løpet av det siste tiåret betydelig oppmerksomhet har vært rettet mot de rollene spilles av ulike hjerneregioner i kontrollerende insekt atferd. Mye av dette fokuset har vært rettet mot midtlinjen hjerne neuropils som er kollektivt referert til som den sentrale komplekset (CC). Fremgang har blitt gjort som et resultat av brede varianter av teknikker rettet spørsmål om rollen til CC i atferd. Disse teknikkene varierer fra neurogenetic manipulasjoner, primært i Drosophila, kombinert med adferdoral analyse ^1-3, til elektrofysiologiske teknikker som overvåker nevrale aktiviteten innenfor CC og forsøk på å fortelle at aktiviteten til atferdsmessig relevante parametere.

Elektrofysiologiske teknikker inkluderer intracellulær opptak fra enkelte identifiserte nevroner ^4-9 og ekstracellulære opptak, ofte med multikanal sonder ^10,11. Disse to teknikkene er gratis. Intracellulært opptak med spisse elektroder eller hele celleplaster gir meget detaljerte data på identifiserte neuroner, men er begrenset til en eller to celler på en gang, krever liten eller ingen bevegelse, og kan opprettholdes i forholdsvis korte tidsperioder. Ekstracellulære opptak kan enkelt sette opp, ikke krever tilbakeholdenhet, og kan opprettholdes i timevis. Med multikanal tetrodes og klynge skjæring, kan relativt store populasjoner av nerveceller analyseres samtidig ^9,12. Mens hele celle patch har blitt brukt i tethered insekter ^13, føler vi at det er også et behov for teknikker som tillater oss å ta nevral aktivitet i hjernen i lange perioder av gangen i fritt oppfører insekter som de håndtere barrierer for bevegelse fremover.

Behovet for å spille inn som insekt beveger seg og spretter opp og ned presset oss mot ekstracellulære innspillingsmetoder. Vi har hatt god suksess opptak i strekkfaste preparater med kommersielt tilgjengelige 16 kanaler silisium sonder ^11, men den lille størrelsen av selv store kakerlakker betyr at probene trenger å være montert utenfor legemet. Det, kombinert med delikatesse av sonde tindene, gjorde dem upassende for en gratis spasertur forberedelse. I to tidligere prosjekter, brukte vi bunter fine ledninger som danner en tetrode å oppnå samme opptaksegenskaper, men i en mer robust ordning. Disse tetrode bunter tillatt oss å ta opp fra tethered kakerlakker end forholde CC enhet aktivitet til endringer i gangfart ¹⁴ og snu atferd som følge av antennal kontakt med stang ^10.

Så nyttig som disse tethered forberedelsene har vært og vil fortsette å være, gjøre de presenterer noen begrensninger. Først atferd som insektet kan utføre er begrenset til ett plan. Det vil si, vi kunne lett fremkalle endringer i gangfart eller snu, men klatring og tunneling handlinger var ikke mulig, i hvert fall med den typiske tjore ordningen. Sekund, våre tethered preparater er "open loop". Det vil si, at de ikke tillater normal bevegelse relatert tilbakemelding til systemet. Således, som kakerlakk slått på vår tjore, sin visuelle verden ble ikke endret tilsvarende. Det er mulig å bygge lukkede sløyfe tjore systemer for å introdusere en slik tilbakemelding. De er imidlertid begrenset av kompleksiteten til programmering og maskinvaren i den simulerte visuelle miljøet. Nevertheless, følte vi at vi kunne forbedre våre eksisterende tethered innspillingsmetoder ved opptak fra dyret som det gikk fritt i en arena eller spor og støtt gjenstander som det ville gjort i sine naturlige omgivelser.

Selv om trådløse systemer for opptak hjernens aktivitet ¹⁵ ville være ideelt, dagens systemer har begrensninger i antall opptakskanaler, tidspunkt for datainnsamling, batterilevetid og vekt. Vi har derfor valgt for å forsøke å tilpasse vår tjoret opptakssystem for bruk i fritt glidende preparater. Som bedre trådløse systemer blir tilgjengelige, kan denne teknikken være lett tilpasses slike enheter. Systemet som er beskrevet i denne artikkelen, er lett i vekt, virker meget godt, og som synes å ha liten skadelig effekt på kakerlakk oppførsel. Med en rimelig høy hastighet kamera og cluster cutting programvare, kan aktivitet i enkelte hjernens nerveceller være relatert til bevegelse. Her beskriver vi forberedeasjon av tetrode ledninger og deres implantering i insektet hjerne samt opptak teknikker for elektrisk aktivitet og bevegelse, og hvordan disse data kan bringes sammen for senere analyse.

Protocol

En. Utarbeidelse av Tetrode Ledninger

1. Trekk ut en svært tynn nikrom (12 mikrometer i diameter, PAC belegg) på ca 1,1 m lengde. Fest en tape tag til hver ende. Heng opp ledning over en horisontal gjengestang, slik at de to ender er i samme høyde nær stasjonære.
2. Gjenta trinn 1.1 for en andre ledning, noe som gjør to ender for totalt fire, og plassere den ved siden av den første ledningen (ca 1 cm i mellom).
3. Stick de fire endene sammen med en tape tag og feste tag til en motorisert roterende svingete enhet. Denne enheten kan være laget av et billig likestrømsmotor.
4. Vikle tetrode i den ene retningen i 2 min (60 rpm) og koble den i motsatt retning for 30 sek.
5. Bruk en varmepistol til å smelte ledningene sammen. Ikke ta på ledninger med pistolen. Bruk tre opp og ned går fra vekslende retninger, med hver passering tar ca 10 sek.
6. Skjær toppen og bunnen av såret ledninger. De fire ledninger er vridd end smeltet sammen i den ene enden, men adskilt i den andre.
7. Til støtterøret. Skjær en 30 cm lengde av polyetylen rør (diameter: innvendig 0,28 mm, utvendig 0,61 mm). Træ tetrode meget langsomt og forsiktig inn i støtterøret, slik at den ikke knekkes.
8. Når den sammensmeltede enden vises ut på den andre side, å trekke den gjennom, slik at det er en lik lengden på ledningen i begge ender av styrerøret.
9. Grab separate enden av hver ledning med en tang. Ved hjelp av undersiden av flammen fra en gassbrenner, omhyggelig brenne isolasjon av av de siste 2 eller 3 mm på hver ledning. Varm opp ledningen til den gløder, men ikke krølle.
10. Koble tetrode med en mannlig-kvinnelig IC socket adapter som passer til opptaksenheten. Sett deinsulated enden av hver ledning inn i en annen stikkontakt av adapteren med en tang. Stabil ledningen i kontakten med en liten messing pin. Bruk en fin spiss loddebolt og fylle mansjetten med smeltet loddetinn. Vær nøye med å ikke ta kontaktden skjøre tråd med loddebolten.
11. Kontroller impedansen av hver ledning og den inter impedansen av hvert par av ledninger.
    1. Plasser smeltet, vridd ende inn i en beholder med saltoppløsning og koble en kobbertråd leder fra saltvann til den ohm-meter.
    2. Koble den andre enden av måleren til mansjettstiften inneholder ledningen. Impedansen av hver ledning bør være under 3 MΩ.
    3. Hvis de ovennevnte verdiene ikke nås, forsøk igjen loddetinn tilkoblinger.
    4. Fjern ledningene fra saltvann, skyll tips med vann, og teste den innvendig tråd impedans for hver sammenkobling (n = 6). Den inter impedans bør være over 5 MΩ.
    5. Hvis de ovenfor angitte verdier ikke oppnås, skjære en liten mengde av spissen av på den sammensmeltede enden og test.
    6. Forkast alle trådsett som ikke oppfyller begge krav impedans for alle de ledninger.
12. Fest tetrode.
    1. Brett en liten rektangulær papir boks slightly større enn adapter.
    2. Overfør adapteren inn i boksen med den mannlige side nederst. Trenge inn i boksen slik at alle pinnene i den mannlige side er utenfor boksen, mens resten av adapteren er inne i boksen.
    3. Tape hjørnene av boksen på utsiden. Bruk små biter av dobbeltsidig tape på innsiden av boksen for å stabilisere eventuelle individuelle tråder av wire. Wiren bør sikres som det kommer ut av esken.
    4. Bland raskt satt to komponent epoxy og hell inn i boksen for å sikre adapteren og alle ledningene.
    5. Fest nær enden av føringsrøret til den ene siden av boksen med tann voks, men la slangen åpnes slik at den tetrode kan trekkes gjennom fritt i begge ender.
13. Skjerp tetrode.
    1. Før hvert forsøk snitt spissen av tetrode med et skarpt skalpellblad, ikke saks. Dette hindrer knusing og splaying av kabelendene samtidig som det gir en ren flat kant for det neste trinn. Bruk en liten multiverktøy montert vertikalt med middels og fin grus slipe disker (disse kan kombineres på én plattform) til å polere tetrode og fjerne noen tips isolasjon. Hold bunten nær sin ende med tang. Vipp ledningen satt slutt på en 45 ° vinkel i forhold til sliping disk og forsiktig røre det til moderat hastighet roterende disk for ca 1 eller 2 sek hver på medium og deretter de fine grits. Gjenta dette tre ganger til, aksielt å dreie bunten 90 ° hver gang. Det er kritisk at retningen av spinningen på slipe diskene er borte fra den grunne vinkel på kabelendene, også separering av trådene kan oppstå.
    2. Det ønskede resultatet transformeres bunten ende fra en rett kant på en spiss tupp med små mengder av isolasjon som er fjernet fra enden av hver ledning. Kontroller punktet ved hjelp av en dissekere mikroskop før plating den tetrode. Hvis noen gir mindre slitasje oppstår på spissen, skjæres og repolish.
    3. Hvis impedansen testing under subsequent galvaniseringstrinn viser ekstremt lave innvendig tråd verdier (mindre enn 4 MΩ), indikerer det for mye materiale fjernet under poler trinnet. Recut og repolish den tetrode.
14. Plate på tetrode. Sett spissen av tetrode i en mettet kobbersulfatoppløsning (85 ml vann, 5 ml svovelsyre, 50 g kobbersulfat). Plate hver ledning med en strøm på 2,5 μA med en stimulans isolator. Injisere gjeldende i 1 sek, pause i 1 sek og gjenta denne prosessen 4x.
15. Kontroller impedansen av hver ledning og interimpedance av hvert par av ledninger. Den impedans av hver ledning skal være mellom 0,5-1 MΩ og inter impedans bør være over 4 MΩ.
16. Monter adapteren på heads av en flerkanals opptakssystemet.
17. Fest en bøyd insekt pin til en micromanipulator. Sett på spissen av tetrode til insektet pin med tann voks

2. Animal Forberedelse

1. Anesthetizekakerlakk med is.
2. Etter kakerlakk slutter å bevege seg, holde kakerlakk vertikalt mot en flat kork underlag med store sal pinner som ligger langs kanten av insekt, men ikke trenge noen del av kroppen sin.
3. Overfør-tilberedningen til en plastbeholder og plassere is rundt dyret for å minimalisere blodstrøm og kroppsbevegelser.
4. Plasser en plastkrage på halsen for å støtte hodet og plassere tann voks rundt hodet for å stabilisere den.
5. Skjær et lite vindu mellom Ocelli med et barberblad og fjerne skjellaget fra hodet.
6. Fjern bindevev og fett med en tang for å eksponere hjernen.
7. Plasser en kakerlakk saltvann inn i hodet kapselen for å dekke hjernevev.
8. Å desheath hjernen, bruker en fin pinsett til forsiktig ta tak i kappen på toppen av hjernen og bruke en annen fin pinsett til å rive kappen fra hverandre i ledningen implantert området.
9. Åpne et lite hull i hodet kapsel anterior til hjernen viddh et insekt pin. Sett inn en flette av tre større diameter (56 mikrometer) isolerte kobbertråder inn i hullet for å tjene som en referanse / jordspyd.
10. Senk spissen av tetrode til hjernens overflate med mikromanipulator og posisjonere den i nærheten av hjerneregionen av interesse.
11. Nøye plassere to små stykker av tynne ark acetat (2 mm x 1 mm), er litt større enn hullet i hodet kapsel, anterior og posterior til tetrode.
12. Slå på opptakssystemet.
13. Senk tetrode 150-250 mikrometer under hjernens overflate, avhengig av opptakskvalitet.
14. Slå av opptakssystemet.
15. Flytt de to biter av acetat ark så nær tetrode som mulig uten å berøre den (figur 1A).
16. Varm en liten stekespade eller flat kanyle og sette det inn i dental voks slik at det er flytende voks på tuppen av slikkepott. Berøre enden av hver bit av acetat ark fra nøyetetrode med spatelen, slik at flytende voks kan flyte bort på hver del og tetter mellom den og hodet hårstråene.
17. Gjenta trinn 2.16. Slippe en liten mengde av flytende voks på acetat ark hver gang. Starte prosessen langt borte fra tetrode og bevege seg gradvis mot det. Omsider tetrode vil bli forankret ved dental voks. Unngå å få varm voks inn i hulrom og på hjernen.
18. Bruk samme fremgangsmåte som trinn 2.16 og 2.17 for å feste referanse / jordelektroden med voks.
19. Varm voks som fester tetrode til mikromanipluatoren å frigjøre tetrode fra det.
20. Loop den tetrode inn i tann voks på hodet for å tilveiebringe en strekkavlastning (figur 1B).
21. Dekk til strekkavlastning sløyfe med dental voks (figur 1C).
22. Fjern forsiktig begrensninger og overføre forberedelse på en petriskål. Beherske forberedelse dorsalsiden opp med store sal nålene.
23. Festen stang til pronotum med limpistol. Dette er en trepinne som strekker seg fra pronotum over magen.
24. Sett på spissen av tetrode-slangen til den bakre enden av stangen med tann voks.
25. Feste tetrode og referanse / jordelektroden til den fremre enden av stangen med tann voks.
26. Trekk tetrode fra kontakten ende av røret så mye som mulig, men ikke rykk på den, for å eliminere muligheten for at dyret kan skade deler av tetrode utsiden av slangen (fig. 1D).
27. Fjern alle begrensninger. Fest referansen / bakken elektrode til tetrode slangen med dental voks.
28. Vent i minst 60 min for dyret å komme seg fra anestesi isen før eksperimentet.

Tre. Eksperimentelle prosedyrer

1. Koble til en PC med både opptakssystem og en LED-lys ved hjelp av en USB til seriell port kabel.
2. Begynn nevrale innspillinger.
3. Starte videoopptak ved 20 bilder per sekund for å gå eksperimenter ved hjelp av Motmot image oppkjøpet pakke ¹⁶ eller 120 fps for klatring eksperimenter ved hjelp av høyhastighetskamera.
4. Plasser kakerlakk inn i en 40 cm x 40 cm Pleksiglass arena for fotturer eksperimenter eller en 58 cm lang, 5 cm bred, og 5 cm høy arena for klatring eksperimenter. Den gang arena har en gjennomsiktig barriere som strekker seg fra midten av den rette veggen til sentrum av arenaen, over hvilken heads er plassert. Barrieren er brukt for å hindre dyr fra å gå i områder hvor kameraet er blokkert av den heads. Klatre arena har en akryl-blokken (enten 1,2 cm eller 1,8 cm høye og 5 cm brede) eller en hylle som ligger på en tilsvarende høyde i midten.
5. Generere hjelp av et tilpasset MATLAB kommandoen en TTL puls fra PC. (S = serie (com4); fopen (s); s.RequestToSend = 'off' / s.RequestToSend = "på" /; fclose (s), slette (s) ;). TTL puls genererer en gangertamp for opptakssystemet og enten skrur på eller slår av LED lys.
6. La kakerlakk å utforske arenaen til den stopper å flytte for mer enn 30 sekunder for gang eksperimenter. La kakerlakk til enten klatre over blokken / hylle eller tunnel gjennom hyllen for klatring eksperimenter.
7. Stopp videoopptak.
8. Stopp nevrale innspillinger.
9. Skriv ned stempelet generert av TTL puls.
10. Fjern kakerlakk fra arenaen og vent i minst 3 min.
11. Gjenta trinn 03.02 til 03.10 for den neste rettssaken.
12. Når alle opptak har blitt fullført, passerer 5 sek med 5 μA likestrøm gjennom en av tråd tips (anode) og referanseelektroden (katoden) for å avsette kobber inn i hjernen ved ledning spissen.

4. Offline analyse

1. Synkronisere video og nevrale data ved å koble rammen hvor LED-lyset er slått og tidsstempel registrert av opptakssystemet pådet øyeblikket.
2. Marker tråd tip steder. Bruk Timms intensive prosedyrer for å felle ut og observere kobber i 12 mikrometer seriesnitt ^17. Fremtredende avleiringer skal være synlig i 3-8 tilstøtende seksjoner (ca 18-48% av lengden av den dorsale ventral planet området vi opp fra) (figur 2).
3. Correlate spesifikke elektriske impulser til aktiviteten til enkeltnerveceller. Følg pigg sortering prosedyrene i detalj andre steder ^10,14,18. Bruk programmet KlustaKwik (versjon 1.5, forfatter K. Harris, Rutgers University) for å generere innledende, automatisert clustering. Importere dem inn i programmet MClust (versjon 3.5, forfattere AD Redish et al., University of Minnesota) for videreutvikling og analyse (figur 3).
4. Spor kakerlakk bevegelser. For å vandre eksperimenter, trekke ut posisjonen til kakerlakk (visuell) tyngdepunkt og dens kropp retning i hver ramme i vidEO opptak ved hjelp av Caltech Multiple Fly Tracker (versjon 0.1.5.6; http://ctrax.sourceforge.net/) og den tilhørende FixErrors verktøykasse for MATLAB ^19. For klatreforsøk, trekke ut posisjonen til blokken og kakerlakk hode og pronotum i hver ramme av video ved hjelp av bevegelsesanalyseprogrampakke.

Representative Results

Vi spilte inn nevrale aktiviteten til 50 enheter fra CC i 27 forberedelsene til walking eksperimenter. For 15 av disse preparater (23 enheter), ble det klatring eksperimenter også utført. Enkelte enheter er navngitt i henhold til forberedelse og enhetsnummer (f.eks enhet 1-2 indikerer forberedelse 1, enhet 2).

Øyeblikks av video av en klatre utprøving er vist i figur 4.. Hele video er tilgjengelig i supplerende Video 1 (Lyden fra enheten 1-2). Innspillingen ble gjort i riktig vifteformet kropp (FB). Den kakerlakk sluttet å gå når det støtt på blokken og dens antenner brukes for å vurdere blokken (figurene 4A-C). Deretter heves kakerlakk forsiden av kroppen, endring av kropps substrat vinkel (figurene 4D-E), før den svinges dens ben mot toppen av blokken og klatret over den (figurene 4F-I). Hastigheten og høyde på the kakerlakk, så vel som den øyeblikkelige fyringshastighet for de to sorterte heter fra den første til den aktuelle ramme er vist over hver ramme. Den øyeblikkelige avfyringshastigheten ble beregnet ved å jevne pigg ganger i hver enhet ved hjelp av en Gaussian-kjerne med en bredde på 50 msek. Den avfyring sats på enhet 1-1 økt under klatring og økningen av avfyring rate forut for økning av hastighet (figur 4I). Unit 1-2 var stille før klatring, men begynte å skyte etter klatring ble initiert (Figur 4I). Toppene av de to sorterte enheter innenfor en sek for den aktuelle ramme er vist under hver ramme. Den oransje linje angir tiden er dekket av hver ramme, og den blå rektangel angir dobbelte av bredden av kjernen som ble brukt for å beregne den øyeblikkelige avfyringshastighet for den nåværende rammen.

Et øyeblikksbilde av video av en arena undersøkelsesprøve er vist i figur 5A. Hele videoen er en vailable i supplerende Video 2 (Lyden er fra enhet 2-1). Innspillingen ble gjort i midten FB. Posisjonen for kakerlakk, og dens kropp retning i hver ramme ble ekstrahert ved hjelp av Ctrax og brukes til å beregne forover og posisjon hastighet samt momentan skuddtakt. Banen av kakerlakkene på hele video er vist i figur 5B. Hver svarte prikken indikerer posisjonen av kakerlakkene i hver ramme, og banen er fargekodet med den øyeblikkelige fyringshastighet for enheten 2-1. Som vi spilt hvert forsøk på en konstant bildefrekvens (dvs. 20 fps), jo lenger avstanden mellom to punkter, jo raskere hastighet på den tiden. Den avfyring sats på enhet 2-1 økt når kakerlakk begynte å gå og var korrelert med gangfart. For å undersøke tuning av enkelte enheter til dyrets bevegelse tilstand (dvs. hastighet og retning), bygget vi skuddtakt kart basert på forward gangfart og turning hastighet for hver enhet. For mange CC enheter, ble økt skuddtakt begrenset til bestemte locomotion stater. For eksempel, ble enheten 2-1 innstilt til å videresende å gå uavhengig av dreiehastigheten (figur 5C).

Figur 1. Bilder av animalsk preparatet. AC Frontal visning av kakerlakkene hodekapsel. A. To stykker av acetat arket ble plassert nær til tetrode for å gi grunnlag for voks. B. En strekkavlastning ble skape d ved å bøye tetrode inn i voks. C . Den tetrode var fullt dekket av dental voks. D. Dorsal visning av kakerlakk kroppen. En av tre stav var festet til dyrets pronotum og tetrode slangen ble festet til stangen. Den tetrode og referanse / jordelektroden vire ytterligere sikret ved å feste dem til fremre av stangen. Klikk her for å se større bilde.

Figur 2. Marker tråd tip steder. A. En del av hjernen ble klargjort n ^o 2, som viser en brun avsetning av kobber side i vifteformet legeme (FB). B. Skjematisk tegning av CC og ledningen spissen sted. PB, protocerebral broen, FB, vifteformet kropp;. EB, ellipsoiden kroppen Klikk her for å se større bilde.

Figur 3. &# 160; En typisk tetrode opptak A. Rå spenningsforløpene fra enkelt elektroder innen ett tetrode bunt.. Merk forskjellen på de spennings spor mellom ulike elektroder. B. Tre enheter ble sortert ved hjelp MClust. C. 3-dimensjonal visning av kurve energi som er spilt inn på tre av de fire elektroder. Hver prikk er en enkel terskel hendelse, fargekodet etter klyngen det ble til slutt tildelt. Klikk her for å se større bilde.

.. Figur 4 Øyeblikks av video av en klatreprøve Over hver ramme: normalisert hastighet, høyden av kakerlakkene samt momentan avfyring frekvensen av de to sorterte heter fra det første til detgjeldende ramme. Tid 0 indikerer utbruddet av klatring. Firing sats ble normalisert 0-1, og hastighet og høyde ble normalisert 0 til 0,5 for visning formål. Under hvert bilde: toppene av de to sorterte enheter innenfor 1 sek av gjeldende ramme. Den oransje linje angir tiden er dekket av hver ramme, og den blå rektangel angir dobbelte av bredden av kjernen som ble brukt for å beregne den øyeblikkelige avfyringshastighet for den nåværende rammen. Enkelte enheter ble navngitt i henhold til forberedelse og enhetsnummer (f.eks. "Unit 1-2" indikerer forberedelse 1, enhet 2). Klikk her for å se større bilde.

Figur 5. Ett skjermbilde av videoen av en arena leting rettssaken A. Den rødeoval linje viser formen av kakerlakkene ved at rammen og den røde stiplede linje angir stillingen av kakerlakkene sentrum av masse i de foregående 10 ramme. Høyre: snu og frem ganghastighet samt momentant skuddtakt av enhet 2-1 på denne rammen. Under: piggene av enhet 2-1 innen 4 sek av gjeldende ramme. Som i figur 4, indikerer den oransje linjen tiden er dekket av hver ramme, og den blå rektangel angir dobbelte av bredden av kjernen som ble brukt for å beregne den øyeblikkelige avfyringshastighet for den nåværende rammen. B. bane av kakerlakkene på hele video. Den store svarte prikken indikerer startpunktet for kakerlakk, og hver liten svart prikk indikerer posisjonen av kakerlakkene i hver ramme. Banen ble fargekodet med øyeblikkelig skuddtakt av enhet 2-1, fra blå (lav) til rødt (høy). C. skuddtakt kartet enhet 2-1. For hele eksperimentet, frem og turning hastighet samt pigg ganger ble glattet ved hjelp av en Gaussian kernel med en bredde på 150 msek og ble delt inn i nonoverlapping 50 msek lange seksjoner. For hver oppdelt del, ble en hastighetsvektor genereres ved å ta gjennomsnittet forover og dreie hastighet innenfor denne perioden hhv. Firing rate for hver hastighetsvektor ble også beregnet. Alle Hastighetsvektorene ble binned (10 mm / sek for forover ganghastighet og 10 grader / sek for å snu hastighet), og en hastighet kartet ble generert ved overliggende gjennomsnitt avfyring rate for hver bin innhentet ved gjennomsnitt alle avfyring priser som tilsvarende hastighet vektorer falt i at bin. X-aksen er i dreiehastigheten, og y-aksen er den frem ganghastighet. Positiv snuhastighet indikerer riktig vende og negative snuhastighet indikerer venstre snu. Klikk her for å se større bilde.

Discussion

Mens tidligere elektrofysiologiske studier på CC eller andre regioner av insekt hjernen har gitt oss innsikt i den sentrale kontroll av atferd, ble de fleste av dem utført i enten behersket forberedelser ^9,11 eller tethered seg ^10,14. Som et resultat av dyrets sensoriske erfaring og fysiologisk tilstand kan være meget forskjellige fra de i naturlige omgivelser. Videre er de atferdsmessige oppgaver som dyret kan utføre er begrenset til ett plan under slike situasjoner. Her presenterte vi en metode for å ta opp fra CC i fritt oppfører kakerlakker. Forhåpentligvis har vi gitt deg all nødvendig informasjon du trenger for å fange opp elektrofysiologiske opptak i fritt oppfører insekter i ditt eget laboratorium. Vi presenterte prosedyrer for de systemene som vi bruker (Neuralynx, MClust, WinAnalzye, og Ctrax), men når de Opptaket elektrodene er implantert, kan opptaksoppsettet lett tilpasses andre systemer. & #160;

Vi har utført 27 preparater, og som foreløpig ingen av forsøkene ble avsluttet fordi den kakerlakk skadet wire sett. Vi har ikke observert noen forsøk av dyret for å rense eller fjerne wire sett, voks, eller stang. De implanterte kakerlakker gikk i en normal gangart. De var i stand til å utforske arenaen og utfører klatre oppgaver like godt som intakt seg. Forsøkene varte vanligvis 2-4 timer etter den tetrode ble implantert. Av og til noen enheter forsvant eller deres aktivitet redusert hele tiden, men de fleste opptakene var veldig stabil gjennom hele forsøket. Vi har også isolert enkelte fag og returnerte til opptak og stimulering neste dag. Denne metoden ser pålitelig for lengre perioder av ekstracellulære opptak i fritt oppfører insekter.

Ett poeng av vekt er den skjøre natur wire settene. De kan lett bli skadet hvis stor omsorg er ikke tatt under bygging og implantasjon. Alltid flytte ledningene og eventuelle dissecting instrumenter nær dem sakte, være forsiktig med å støte eller rive dem. Ledninger kan trekkes forsiktig fra utarbeidelse etter forsøket og lesioning er ferdig, slik at for to eller tre bruksområder. Sørg for å teste, repolish, og replate før hver bruk.

Nøkkelen til en vellykket preparat er å holde trådsettene bort fra kakerlakk. Vi bruker en lang stang som strekker seg fra pronotum til over magen og feste tetrode slangen til den bakre enden av stangen. Følgelig er tetrode slangen alltid bak kakerlakk når det beveger seg rundt i en arena slik at insektet ikke kan nå slangen med sin antenner eller ben. Plassering av wire sett bak kakerlakk gir også klaring over dyrets kropp. Dette forbedrer videokvaliteten på vår arena experiments fordi kameraet er plassert over arenaen. La ingen overflødige ledningene mellom dyrets hode og tetrode slangen. Er insektet kan nå ledningene med sin antenner eller ben, vil det bryte dem. I denne metoden, slange lysbilder fritt over ledningen, slik at vi kan trekke overflødig ledning opp og fest den i nærheten av heads.

En potensiell begrensning av vår fremgangsmåte er størrelsen på plassen hvor kakerlakk kan oppdage. Den tetrode er 40 cm i lengde, som er nok til å gi adgang til hele 40 x 40 cm ² arena. Vi har ikke støtt på problemer som støy og tetrode kvalitet. Imidlertid kan slike problemer dukker opp som vi gjør lengre tetrodes for en større arena. Et annet potensielt problem med en lengre tetrode er vekten av tetrode. Vår tetrode og stang veier ca 0,25 g som tilsynelatende ikke hindrer en 2-3 g kakerlakk. Vi observerte intakte kakerlakker som utforsker det samme arena som brukes for elektrophysiology eksperimenter. The walking aktivitet og generelle hastigheten var lik mellom kakerlakker bærer en stang og tetrode og uhemmet dyr. Vi har imidlertid ikke testet grensen for den belastning som en kakerlakk kan bære før dens ytelses dråper. En løsning av begrensninger i en lengre tråd er å bygge en motorisert plattform for heads og kameraet. Under et slikt system, kan kameraet spore kakerlakk bevegelser i sanntid og utgang til motoren slik at plattformen kan bevege seg tilsvarende. Derfor ville en relativt kort tetrode være tilstrekkelig for en stor arena fordi heads ville forbli direkte over dyret.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nichrome wire	Sandvik Heating Technology	Kanthal RO-800	Use for tetrode
Biomedical polyethylene tubing	A-M Systems	800700	Use for tetrode tubing
Lynx-8	Neuralynx		Use for multiunit recording
Cheetah 32	Neuralynx		Use for multiunit recording
High speed camera	Basler	A602f	Use for video recording for walking experiments
High speed camera	Casio	EX-FC150	Use for video recording for climbing experiments
WINanalyze	Winanalyze	version 1.4 3D	Use for video tracking
MATLAB	MathWorks	MATLAB R2012b	Use for TTL pulse generation and offline data analysis