Protéines consensus dérivé du cerveau, Protocole d'extraction pour l'étude de l'homme et du protéome murin cerveau en utilisant deux 2D-DIGE et Mini 2DE Immunoblotting

Summary

Un protocole d'extraction de la protéine en utilisant un tampon commun urée / thiourée / SDS pour le tissu cérébral des souris humain et permet indentification de protéines par 2D-DIGE et leur caractérisation ultérieure par un mini 2DE immunoblot. Cette méthode permet un pour obtenir des résultats plus fiables et reproductibles à partir de biopsies humaines et des modèles expérimentaux.

Abstract

Deux dimensions électrophorèse sur gel (2DE) est un outil puissant pour découvrir les modifications du protéome potentiellement liés aux différentes conditions physiologiques ou pathologiques. Fondamentalement, cette technique est basée sur la séparation des protéines en fonction de leur point isoélectrique dans une première étape, et d'autre part en fonction de leur poids moléculaire par SDS sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE). Dans ce rapport, un échantillon protocole de préparation optimisé pour petite quantité de tissus post-mortem et le cerveau de la souris humaine est décrite. Cette méthode permet d'effectuer à la fois un gel électrophorèse bidimensionnelle de différence de fluorescence (2D-DIGE) et d'un mini 2DE immunoblot. La combinaison de ces approches permet de trouver non seulement de nouvelles protéines et / ou des modifications des protéines dans leur expression grâce à sa compatibilité avec détection par spectrométrie de masse, mais aussi un nouvel éclairage sur la validation des marqueurs. Ainsi, mini-2DE couplé à un permis de transfert de Western pour identifier et valider poste-Traductionnelles des protéines, des modifications du catabolisme et fournit une comparaison qualitative entre les différentes conditions et / ou traitements. Ici, nous fournissons une méthode pour étudier les composants d'agrégats de protéines trouvées dans la MA et la démence à corps de Lewy, comme le peptide bêta-amyloïde et l'alpha-synucléine. Notre méthode peut donc être adaptée pour l'analyse du protéome et d'extraire les protéines insolubles à partir des modèles de tissu cérébral des souris et humaines aussi. En parallèle, il peut fournir des informations utiles pour l'étude des mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans les maladies neurodégénératives ainsi que des biomarqueurs de nouveaux potentiels et les cibles thérapeutiques.

Introduction

Les troubles mentaux et neurologiques représentent 13% de la charge mondiale de morbidité, de nouveaux défis tels que les mécanismes physiopathologiques, les facteurs de risque et des biomarqueurs avant-coureurs doivent être explorées ^1. Conformément à cet objectif, la protéomique études du cerveau humain deviennent indispensables pour découvrir voies moléculaires impliquées dans des processus tels que la mémoire, le comportement, les émotions et la plasticité neuronale, par exemple, non seulement pour des raisons physiologiques, mais aussi pour des conditions pathologiques. Par conséquent, l'utilisation de modèles animaux et plus particulièrement les souris transgéniques, apporte un large éventail de possibilités d'imiter l'étiologie des troubles neurodégénératifs humains ^2.

Approches protéomiques sont aujourd'hui disponibles pour accomplir ces nouvelles perspectives dans le domaine des neurosciences. Une électrophorèse sur gel bidimensionnelle (2DE) est une méthode simple et efficace qui permet susceptibles de comparer le protéome d'une vaste gamme d'échantillons. En outre, il est égalementméthode puissante pour isoler une protéine d'un mélange complexe dans le but d'identifier et d'analyser plus en détail par la spectrométrie de masse. Cette technique consiste essentiellement en deux étapes successives: 1) séparation des protéines en fonction de leur point isoélectrique (pI) par isoélectrofocalisation (IEF). Plus précisément, un potentiel électrique est appliquée entre les bandes d'acrylamide de immobiline entre un gradient de pH et protéines vont migrer et de se concentrer sur un pi déterminé en fonction de leur charge nette globale. 2) les protéines sont dénaturées porté isoélectrique et chargées négativement par l'addition de dodécylsulfate de sodium (SDS), ainsi les protéines dans leur première structure sont séparés en fonction de leur poids moléculaire apparent (PM) par SDS-PAGE ^3. Ces deux propriétés distinctes permettent de nous attaquer à une valeur double à aller plus loin dans l'étude du protéome. D'une part, cette approche offre la possibilité d'effectuer une analyse quantitative utilisant des colorants minimales méthode 2D-DIGE, et d'autre part un qualitativanalyse de e par mini-2DE couplé à un transfert de Western.

L'analyse quantitative par 2D-DIGE donne l'expression des protéines change tout sur l'échantillon protéome. Brièvement, les échantillons sont étiquetés avec trois cyanines (Cy2, Cy3 et Cy5) émettant à trois longueurs d'onde distinctes (bleu, vert et rouge). Ces colorants minimes fluor contenant un groupe ester de N-hydroxy succinimidyle réagissent avec le groupe de résidus lysines des protéines entraînant des liaisons amide covalentes ⁴ ε-amino. résidus de lysine sont marqués seulement entre 1-3% et empêchant ainsi plusieurs étiquettes plus par des protéines et des modifications importantes de charge nette ^{5, 6.} Cy3 et Cy5 sont souvent utilisés pour marquer deux échantillons indépendants tout en Cy2 Tags un mélange de proportion égale des échantillons à comparer. Les deux principaux avantages sont que tous les échantillons étiquetés sont mélangés et IEF et SDS-PAGE sont effectuées dans un gel à la fois pour chaque étape, en évitant l'inter variabilité des expériences dues à des gels comparaison. De plus, il présente un seuil de détection élevé de l'ordre de 1 femtomole de protéine ^7. Les gels sont numérisés et logiciel 2D comparent les images de fluorescence sur gel 2D, où Cy2 sert d'étalon interne pour permettre l'identification de différences statistiques entre les spots pour leur identification postérieure par spectrométrie de masse. Le logiciel d'analyse 2D en utilisant l'étalon interne permet d'obtenir une détection rapide de moins de 10% des différences entre les échantillons avec plus de 95% de confiance statistique ^8.

L'analyse qualitative par mini-2DE est une étape cruciale pour la caractérisation des protéines. Le principe est le même que celui décrit précédemment pour la séparation et le pI MW, mais dans ce cas, les protéines sont transférées à partir d'un gel de polyacrylamide à petite membrane et une immuno-empreinte est réalisée par la suite. Bien que l'on électrophorèse sur gel de dimension fournit des changements dans l'expression de la protéine pour un ou plusieurs épitopes de protéines en fonction de l'anticorps, l'information de mini-2DE apporte deux paramètres supplémentaires. Tout d'abord, les isovariants de protéines changent en fonction de la pi, ce qui indique que des modifications post-traductionnelles pourraient avoir lieu. En second lieu, l'identification par spectrométrie de masse peut être une indication de zymogènes plausibles et des produits cataboliques de protéines. Par conséquent, les modifications observées par 2D-DIGE sont susceptibles indicative des mécanismes sous-jacents des changements dans le profil global du protéome. Les alignements de immunoblots entre plusieurs échantillons pour le même épitope de protéine / s par mini-2DE peuvent refléter des changements d'acidité qui éclairent en variations post-traductionnelles peu observés ou même pas par immuno monodimensionnel ^{9, 10.} En outre, cette analyse renseigne sur les sites de clivage potentiels dus à la connaissance de la pI MW et des résidus métaboliques ^11,12.

La combinaison de ces deux techniques permet une analyse protéomique complémentaire. D'une part 2D-DIGE offre un type de différences permettant un isolement précis de polypeptides dont l'expression est différente. Ces différences sont essentiellement constitués par l'apparition ou la disparition d'un endroit ou d'augmentation / diminution de l'intensité d'un être déterminé par l'analyse logicielle des gels fluorescents. Cependant, ces observations se sont peu susceptibles d'expliquer la nature de la modification observée. Pour ces raisons, une fois que le polypeptide est isolé et identifié par spectrométrie de masse, l'utilisation de mini-2DE permet de confirmer avec précision 1) l'identité de la protéine isolée, et 2) la nature de la différence: changement dans le niveau de isovariant / isoforme expression, modifications post-traductionnelles et les processus de clivage par exemple. Cependant, il est nécessaire de développer un tampon de lyse à partir à la fois compatible avec 2D-DIGE et avec mini-2DE afin de limiter les dispersions éventuelles résultant de l'utilisation de protocoles d'extraction qui sont très dissemblables.

Dans le présent article, on dedécrit un protocole adapté à la préparation, l'extraction et la performance des techniques mini-2DE pour les protéines du cerveau provenant de tissu humain et de souris 2D-DIGE et.

Protocol

1. Homogénéisation et extraction de protéines totales de l'homme et de la souris tissu cérébral

1. Cerveau homogénéisation des tissus. Homogénéiser le tissu cérébral de 10% (p / v) dans 8 M d'urée, 2 M thiourée et 1% p / v de tampon SDS (UTS) à l'aide d'un verre de potier (pour les échantillons humains) ou Téflon homogénéisateur (pour les échantillons de souris). Traitement par ultrasons à 60 30 Hz des impulsions avec un générateur d'ultrasons pour l'application de 0,5 sec désintégration totale du tissu ^{13, 14.}
   1. Déterminer la concentration de protéine avec dosage de Bradford, en utilisant la BSA comme standard. Cette UTS extraction tampon est totalement compatible avec une dimension SDS-PAGE tant que lysats sont pas trop chauffé pour éviter carbamylation ^15.
   2. Ajouter 1% (p / v) d'Amberlite et incuber sous agitation douce pendant 10 min à température ambiante. Filtrer par la suite sur 0,22 um filtres seringues et enfin ajouter le SDS à la solution d'urée / thiourée. Cette étape réduit la quantité d'acide urique et de l'acide isocyanique, qui sont en equilibrium avec de l'urée en solution et faciliter sa dégradation.
2. Chloroforme / méthanol, la précipitation des protéines. Précipiter entre 100-150 mg de protéines pour 11 cm bandes IPG et 1-1,5 mg pour 18 cm ceux (indépendamment de la gamme de pH choisi pour effectuer l'IEF).
   1. Effectuez toutes les étapes sur la glace ou à 4 ° C. Refroidir chloroforme et de methanol à 4 ° C pendant 30 min avant de lancer la procédure de précipitation.
   2. Ajouter trois volumes de méthanol et d'un volume de chloroforme à un volume de lysat UTS. Agiter manuellement le mélange et ajouter trois volumes d'eau froide. Vortex pendant 1 min et sédimenter les protéines par centrifugation à 12 000 xg pendant 30 min à 4 ° C.
   3. Jeter le surnageant avec une pipette Pasteur et ajouter trois volumes de MeOH froid. Vortex à nouveau et centrifuger à 12 000 xg pendant 30 min à 4 ° C. Enfin éliminer le surnageant et le culot sécher sous _N2.
3. La préparation de protéines pour l'analyse 2D.Reprendre le culot de protéine séché en 2D-tampon (8 M d'urée, 2 M thiourée complété avec 4% de CHAPS). Laver la solution avec de l'Amberlite comme indiqué ci-dessus et essayer de garder la proportion de 500 ug de protéines par 200 pi de tampon 2D 2D-DIGE. Remarque: tampon 2D peut être stocké à -80 ° C ou maintenu à 4 ° C pendant une semaine (pour éviter la dégradation de l'urée).
   1. Traitement par ultrasons et stocker les échantillons à -80 ° C jusqu'à ce que l'exécution de l'étape suivante. Il convient de noter, ce protocole peut être utilisé après solubilisation de l'acide formique de protéines regroupe ^10. En résumé, l'évaporation de l'acide formique sous _N2 et remettre en suspension le culot comme décrit.

2. 2D-DIGE

1. Les échantillons de tester la qualité. En utilisant à nouveau les échantillons de dose méthode de Bradford. Diluer 15 pg de protéines dans du tampon d'échantillon LDS, la chaleur à 37 ° C et ^15% 12.4 charger sur des gels de polyacrylamide.
2. Coloration Coomassie. Colorer gel de polyacrylamide avec 0,1% (p / v) de bleu de CoomassieBleu G-250, 50% d'EtOH et 10% (v / v) d'une solution d'acide acétique pendant au moins 1 heure. Soit le fond Destain pendant une nuit dans de l'acide acétique à 7% et 10% (v / v) d'une solution d'éthanol.
3. Étiquetage pré-électrophorèse d'échantillons. Avant de procéder à l'étiquetage de colorant cyanine, vérifier le pH de l'échantillon, ce qui devrait être de base ou même neutre depuis la substitution N-hydroxy est plus efficace à pH basique et donné pour être optimale à pH 8,6.
   1. Étiqueter minimalement les deux échantillons de l'étude avec des colorants fluorescents Cy3 ou Cy5 avec un ratio de 50 ug protein/400 pmol colorant et garder pendant 1 h à 4 ° C dans l'obscurité pour faciliter le groupe ester réactif NHS des cyanines avec l'amine non protonée groupes de lysines.
   2. Réduire les variations échantillons faisant une contre-marquage avec Cy3 et Cy5 colorants, évitant un couplage préférentiel d'un échantillon à un cyanine particulier. A noter que le colorant cyanine-marquage minimal peut être adapté pour petite quantité de protéines avec le maintien de la proportion de 1 pg protein par 8 pmol cyanine-colorant. Si c'est le cas, le système de mini-2DE peut être utilisé à la place du grand système de gel 2D. Cela permettra à l'analyse 2D-DIGE pour une petite quantité de tissu cérébral.
   3. Étiqueter un groupe de deux échantillons avec la même quantité de protéine (50 ug au total) avec le colorant fluorescent et Cy2 utilisé comme étalon interne. Utilisez les mêmes conditions que précédemment indiqué.
   4. Complète à un volume de 350 ul au total avec du tampon 2D contenant 1,1% de réactif de Destreak, 1,2% de tampon IPG et des traces de bleu de bromophénol au total de 150 ug de protéines marquées (50 pg de Cy2, 50 pg de Cy3 et 50 pg de Cy2). Effectuez cette étape en quatre avec quatre bandes indépendantes. De plus, la préparation de deux bandes de non-marqués supplémentaires (une pour chaque échantillon) avec de 350 à 450 ug de protéine pour les gels préparatifs.
   5. Laissez les six bandes chargées couvertes de nuit de l'huile minérale pour la réhydratation passive.
4. Isoélectrofocalisation. Effectuer l'IEF à 206; C. Pour un pH 3-11NL, 18 cm dépouillent le protocole est: réglage courant maximal est de 50 pA / bande pendant 8 étapes: 1) 150 V étape pendant 1 heure, 2) 200 V étape pendant 5 heures, 3) 500 V gradient pour 2 h, 4) gradient de 1000 V pendant 2 heures, 5) 2000 V gradient pendant 2 heures, 6) 4000 V gradient pendant 2 heures, 7) 8000 V gradient pendant 2 heures et 8) pour un total de 24 000 V · étape h . Après IEF, envoyé l'excès d'huile minérale en utilisant du papier de chromatographie et de stocker les bandes à -20 ° C jusqu'à ce que la deuxième dimension.
5. IPG bandes équilibrage. Equilibrer bandes dans 6 M d'urée, 2% de SDS, 30% de glycerol, 50 mM Tris-HCl pH 8,6 avec un tampon à 1% de DTT pendant 15 min et après avec de l'iodoacétamide 4,7% dans le même tampon mais sans DTT.
6. Deuxième dimension ou électrophorèse SDS-PAGE. Faire les six 12% de gels SDS-PAGE (1,5 M Tris-HCl pH 8,6, 12% d'acrylamide / bisacrylamide, 0,1% (p / v) de SDS, 0,072% (p / v) APS et 0,1% (v / v) de TEMED ,) en même temps à l'aide d'un grand système 2D, avec quatre plaques de verre à faible fluorescence pour la strips avec des échantillons de fluorescence et deux autres plaques de verre avec une épaisseur de 1,5 mm pour les gels préparatifs afin d'exciser les taches protéiques.
   1. Charger les six bandes IPG sur la partie supérieure des gels et plus de couches avec 0,5% (p / v) d'agarose. Tampon de migration est composé de Tris 25 mM, glycine 192 mM et 0,1% (p / v) de SDS. Effectuer la migration à 2,5 W / gel pendant la nuit avec un système de réfrigération réglé à 4 ° C ^16,17.
7. Des images de fluorescence acquisition et d'analyse. Utiliser un scanner Typhoon 9400 pour obtenir les gels de fluorescence images (12 images pour une expérience). Numérisation Cy2, Cy3 et Cy5 images pour chaque gel à 488/520 nm, 532/580 nm et 630/670 nm excitation / longueurs d'onde d'émission, respectivement. Utilisez un logiciel informatique pour analyser les images. Les données sont représentatives des changements de volume de la tache associés à la distribution du signal sur les quatre gels entre les deux échantillons étudiés.
8. Coloration au Coomassie des gels pour les grandes. Fixer les gels préparatifs en 50% (v / v) d'EtOH et 3% (v / v) d'une solution d'acide orthophosphorique pendant au moins 24 h. Puis après, laver deux fois avec de l'eau ultra pure pendant 20 min. Effectuer une coloration dans 34% (v / v) de MeOH, 17% (p / v) de sulfate d'ammonium et d'acide orthophosphorique à 2% pendant 1 heure avant d'ajouter 0,1% (p / v) de bleu de Coomassie G-250. Gardez les gels de coloration pendant au moins 48 heures et décoloré dans de l'eau ultra pure.
   1. Spots pour l'identification MS. Une fois les images de fluorescence sont analysées, le logiciel fournit une liste de points dont l'expression est statistiquement différente. Exciser manuellement ces taches des gels préparatifs. Cette procédure nécessite de la pratique et une certaine dextérité manuelle afin d'éviter la contamination de la kératine. Ensuite, les échantillons peuvent être conservés dans de l'eau à -20 ° C jusqu'à ce que l'envoi de MS. identification spot est parfaitement compatible avec la spectrométrie de masse en tandem (MS / MS) et la pertinence de l'identité des protéines est jugé en fonction de la probabilité de score Mowse base calculée avec une valeur p de 0,05 (p <0,05) ^18.
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   3. Qualitative Assay Mini-2DE

   1. Remettre en suspension maximale de 100 pg d'échantillon de protéine dans un tampon 2D jusqu'à un volume final de 200 pl pour une bande de IPG de 11 cm. Dans le cas d'un système de surexpression ou d'une protéine purifiée, la quantité de départ peut être abaissée à 20 pg.
   2. Ajouter 1,1% (v / v) Destreak Reagent, 0,55% (v / v) de tampon et des traces de bleu de bromophénol IPG à un volume final de 200 ul. Ensuite, vortex, faire un tour rapide et charger dans une bande IPG pour la réhydratation passive (pour mettre la bande à son épaisseur d'origine) de nuit couvert avec de l'huile minérale. Remarque: la proportion de tampon IPG est la même pour tous l'intervalle de pH désiré (pH 3-11, 4-7, 7-11, etc), mais sa composition varie en fonction de l'intervalle de pH choisi.
   3. Isoélectrofocalisation. Effectuer IEF à 20 ° C. La durée du programme dépend de l'intervalle de pH choisi. Il convient de noter, des paramètres tels que électroendosmose peut perturber le profil IEF et dans ces cas,l'optimisation du temps de electrofocalisation est nécessaire ^19. Remarque: il n'est pas nécessairement une plus IEF qui fournit de meilleurs résultats, mais la réduction du temps de l'IEF peut également améliorer la résolution. Après IEF, bandes IPG peuvent être conservés à -20 ° C pendant des mois.
   4. IPG bandes équilibrage. Equilibrer les bandes dans un tampon contenant 25 mM Tris-HCl pH 6,8, 20 mM de DTT, 10% de glycerol, 5% de SDS, 0,05% bleu de bromophénol. Faire trois équilibrage baigne pendant 15 min à l'évolution de la solution de tampon entre chaque bain.
   5. SDS-PAGE. Couche la bande IPG sur un gel préfabriqué (IPG 1 bien, 11 cm de bande IPG) avec un pourcentage de polyacrylamide choisi en fonction de la PM de la protéine d'intérêt. Ensuite, éponger le gel sur une membrane de nitrocellulose / PVDF à 100 mV pendant 33 min.
   6. Incuber pendant la nuit avec l'anticorps nécessaire et visualiser par l'activité de la peroxydase. Effectuer les alignements de immunoblots en utilisant des polypeptides indépendants révélés par l'anticorps secondaire. Atteindre un semi-quantitAtive analyse par densitométrie du volume et de l'intensité des traces / taches avec le logiciel ImageJ.

Representative Results

Protéomique sur le tissu cérébral reste difficile car aucun tampon idéal existe pour récupérer 100% de protéines, en particulier associée à la membrane ou des protéines du cytosquelette. La première série d'expériences a été axée sur la recherche d'un tampon de lyse approprié compatible avec les deux approches et qui permet de récupérer un large panel de protéines. Ainsi, trois tampons de lyse ont été analysés afin de déterminer la plus appropriée. Tout d'abord, on a utilisé le tampon de la biologie moléculaire et biochimique commune Tris-HCl ²⁰ à 10 mM avec 1% (p / v) de SDS (Figure 1A). En outre, Tris-HCl a une application solide comme tampon d'électrophorèse de polyacrylamide et d'agarose gels. Les deux autres tampons de lyse sont UTS (figure 1b) et celui 2DE. Tris-SDS donné une mauvaise résolution et le nombre de points ont été considérablement réduit (figure 1B) en comparaison avec le profil observé avec UTS, où une séparation de haut lieu, aucune distorsion et un far meilleure récupération des protéines a été observée (Figure 1B). Ce point est corroboré par le fait que UTS extraction des rendements presque pas de granulés résiduelle, tandis que Tris-HCl doit une épaisseur un banc après centrifugation. Le motif montré sur la figure 1B donne clairement la preuve de la solubilité plus élevée en protéines dans UTS en ce qui concerne d'autres tampons tels que le Tris-HCl. Notheworthy ce tampon même 2DE a également été testé, son utilisation a été écartée puisque malgré culot a été observé ni, lipides n'ont pas été dissous et ils sont restés dans la couche supérieure difficulting la manipulation. En accord avec ces données, il est recommandé l'utilisation d'un tampon UTS pour plusieurs raisons 1) son de chaotrope neutre qui dénature les protéines par rupture des liaisons nonconvalent et ioniques entre les résidus d'acides aminés et d'éviter l'activité de protéases qui dégradent les protéines cellulaires ²¹ 2) l'addition de la thiourée à la solution d'urée améliore considérablement la solubilité des protéines membranaires hydrophobeset les protéines exposées à un agrégat ^{22, 23} et 3) l'adjonction du détergent anionique SDS rompt lipides se lient des protéines par des interactions hydrophobes, ainsi que augmente la protéase et l'activité de la phosphatase inhibition ^24,25. En outre, il a été décidé d'ajouter une étape de précipitation pour éliminer impureties qui pourraient perturber l'IEF. De cette manière, en tant que procédé de précipitation détermine la solubilité des protéines ^{de 26} et de methanol a déjà été décrits en tant que solvant le plus approprié pour enlever les lipides qui sont abondants dans le tissu cérébral, il nous a amené à choisir la précipitation du chloroforme / méthanol ^27. L'utilisation des CHAPS zwitterioniques détergentes (3 - [(3-cholamidopropyl) diméthylammonio]-1-propane sulfonate) pour remettre en suspension les protéines culot dans le tampon 2D est due à son aptitude à faciliter l'entrée de la protéine dans la première étape de la dimension ^28.

Le profil du cerveau des souris pr humaine etoteome 2D-DIGE en est représenté sur les figures 2A et 2B respectivement. Dans la figure 2A fusionné images fluorescentes provenant de contrôle humain et échantillons AD du cortex peuvent être observées, à la figure 2B, idem pour les souris des échantillons provenant de l'hippocampe d'un modèle de type AD Tau pathologie ^29. Cy2, Cy3 et Cy5 sont illustrés respectivement pour les échantillons humains dans les figures 2C-2E. Les deux modèles fusionnées (figure 2A et 2B) présentent une résolution de haut lieu reflétant un IEF de haute qualité et deuxième séparation de dimension en accord avec le profil observé dans la figure 1B. Cette qualité ainsi que le fait que la réticulation est effectuée afin d'éliminer une possible préférence des protéines à une cyanine notamment, de rendre ces images de fluorescence (figures 2C-2E) très facile à aligner tout au long de l'analyse des logiciels de définition d'endroit. En outre, les gels préparatifs colorées avec Co bleupreuves omassie une carte de protéines enrichi avec des taches abondantes partout dans la gamme de pH utilisé, permettant de l'accise les taches après analyse de logiciels et de leur identification postérieure par MS / MS.

L'analyse qualitative de la mini-2DE par immunoblot pour une protéine fournit des informations de grande valeur pour son identification et modifications, non seulement pour les post-traductionnelles, mais aussi pour les oligomères et les troncatures (figures 3A et 3B). La faisabilité d'effectuer cette technique en mini 2DE fournit des données rapides et précises sur la protéine d'intérêt. En ce qui concerne les tissus d'un patient atteint de démence à corps de Lewy (LBD), la caractérisation de l'alpha-synucléine permet de visualiser un profil de pH 4-7 bien défini où la protéine native est à un pi de 4,67 et un MW de 18 kDa, néanmoins avec mini-2DE il peut encore être vu la présence de dimères (figure 3A, astérisque) en même pI que les formes indigènes, mais aussi l'existence de ubiqformes uitinated qui sont plus basiques et avec un PM plus élevé quand ils sont plus ubiquitinée (figure 3A, flèches). Une autre protéine intimement liée à la MA est le peptide bêta-amyloïde, généré par le catabolisme complexe de la protéine précurseur de l'amyloïde (APP). Sur la figure 3B, il est comparé l'intrigue d'un cas sporadique de la MA avec une une familiale. Dans le cas de l'AD au courant, on peut observer comment les bêta-amyloïde 1-42 est diminuée relativement à la MA sporadique, et de plus, les bêta-amyloïde isovariants x-42 (4 kDa) est également régulée à la baisse dans tout l'intervalle , en attendant les oligomères trouvés à 8 kDa reflètent que ce fait n'est pas dû à une baisse de la quantité de la protéine, puisque l'intensité des taches est plus pertinent en l'an familier (figure 3B).

Figure 1: 2DE profile après Tris 10 mM SDS à 1% d'extraction de la mémoire tampon en poids / volume (A) et le motif obtenu après l'utilisation UTS (B). Dans le panneau B, on peut voir la façon dont le nombre de spots, l'intensité et de la résolution est bien supérieure à celle de panneau (A). L'utilisation de UTS permet une extraction de protéines presque totale que cela se reflète dans la coloration 2DE Coomassie. Cliquez ici pour agrandir l'image.

Figure 2: profils 2D-DIGE pour l'homme (A) et la souris (B) sont illustrées d'images (A) et (B) représentent les images fusionnées pour les trois cyanines dans une gamme de pH de 3-11 18 cm bande.. Dans les images (C), (D) et (<strong> E) cyanines sont exposés indépendamment (Cy2 en bleu, en vert Cy3 et Cy5 en rouge). Cliquez ici pour agrandir l'image.

Figure 3: Dans le panneau supérieur, on peut observer le profil de mini-2DE de la protéine alpha-synucléine dans un patient LBD Le pi native (4.4) et MW (18 kDa) changement dans la fonction de la dimérisation (astérisque) où la MW. est le double, et ubiquitination qui déplace le pi jusqu'à un plus base (flèches) (A). L'image de bas révèle le profil d'un anticorps de peptide bêta-amyloïde dans un cas sporadique et génétique de la MA. Motif 2DE montrer comment oligomérisation et la dégradation se déroulent d'une manière différente selon l'étiologie de la papillease. Cette immunoblot montre clairement les différences dans le catabolisme de l'APP entre les deux conditions. D'une part, il ya une augmentation dans les produits cataboliques dans la dans la MA sporadique concernant une familiale (flèches), tandis que les oligomères semblent être moins marquée (B). Ces expériences ont été réalisées dans 11 cm bandes dans un intervalle de pH 4-7 dans un gel Bis-Tris 12% et à 16,5% Tris-Tricine un respectivement (A, B). Cliquez ici pour agrandir l'image.

Discussion

Découvrir les changements d'expression de protéines pathologiques, recherche de biomarqueurs et la modulation des voies possibles pour cibles pharmacologiques sont parmi les objectifs des neuroprotéomique approches ^30. Au milieu des nouveaux outils, le domaine 2DE ajoute une expectative prometteur. Néanmoins, un consensus devrait être atteint afin de minimiser la variabilité et augmenter la reproductibilité dans les expériences. Conformément à cette idée un protocole normalisé pour effectuer 2D-DIGE (figure 2) et l'immuno-empreinte 2DE ultérieure (figure 3) pour le tissu cérébral des souris humain et entièrement compatible avec des mono-dimensionnelle immunoblot est décrite ici en détail.

Un des plus grands dilemmes de la protéomique est le choix de tampon de solubilisation. Afin d'augmenter la reproductibilité entre les différentes approches, UTS a été choisi car il est entièrement compatible avec l'IEF. En outre, un tampon d'extraction UTS ne donne pas de pellet ou une très légère après une centrifugation à 12 000 xg (à ne pas confondre avec la précipitation de SDS à 4 ° C). C'est un point essentiel prise en compte que l'agrégation de nombreux troubles neurodégénératifs des protéines présentes, y compris AD. Le fait qu'il n'existe pas de culot simplifie l'exécution et l'interprétation des données, car aucune étude indépendante devrait être fait pour la fraction soluble et non soluble.

Quel que soit approches 2D-DIGE ou mini-2D vont être effectués, il existe certaines limites qui devraient être indiqués. Tout d'abord les propriétés chimiques de la mémoire tampon UTS, cette solution ne doit pas être surchauffé, ou carbamylation se produit sur ​​des amines primaires et peuvent donc interférer avec tant de couplage des colorants de cyanine et profil 2D, aggravation résolution des points en altérant IEF ^15. Deuxièmement, les gammes de pH disponibles, de nos jours la plus large intervalle de pH est entre 3 à 11, ce facteur relié à la probabilité que toutes les protéines entrée sur la bande IPG peut explain les bandes de protéines empilés dans les deux côtés des gels après coloration. Cette limitation pourrait expliquer pourquoi ne pas tout le protéome peut être étudiée par 2D. Une autre limitation importante est l'utilisation de la précipitation de controverse. D'une part, il est fortement recommandé de faire l'étape de précipitation au chloroforme / méthanol qui permet de réduire efficacement la teneur en lipides ^27, sels, des acides nucléiques et des détergents chargés qui pourraient interférer avec les paramètres IEF et avoir un impact sur ​​la résolution et / ou la reproductibilité des 2D. De plus, de l'autre côté, il ne peut pas être exclu que certaines protéines fortement attachés à la membrane peuvent être perdues. Néanmoins, dans le cas où d'autres tampons d'extraction sont utilisés à la place de l'UTS, que ce soit avec ou sans l'addition d'inhibiteurs de protéases ou de phosphatases, l'utilisation de l'étape de précipitation est fortement recommandé pour les pièges pendant IEF. Enfin, il est à noter que l'analyse des images 2D-DIGE présente l'inconvénient que chevauchait fluorescencetaches peuvent conduire à une perte d'information, depuis l'analyse du logiciel ne considère pas cela comme une variation significative.

La nouveauté de cette méthode combinée réside dans leur reproductibilité, la polyvalence et la caractérisation des protéines. Un seul tampon d'extraction permet d'effectuer deux techniques complémentaires. 2D-DIGE fournit des informations quantitatives sur les changements dans l'expression des protéines et leur identification ultérieure par MS / MS. Cependant, il est possible que les isoformes, isovariants, zymogènes, des modifications post-traductionnelles et des produits cataboliques pas pu être identifiés depuis la fluorescence en chevauchement avec d'autres protéines. Pour surmonter cette limitation, il est proposé l'utilisation en parallèle de mini-2DE. En fait, à notre connaissance, un des écueil le plus important qui peut être commise, c'est de prendre l'immuno mono-dimensionnel comme une validation complète des résultats 2D-DIGE, ou même de considérer que toute la protéomique modification n'est pas nécessaire pour valider. Furthermore, les avantages techniques de mini-2DE sont 1) la faisabilité de l'utilisation de petits systèmes SDS-PAGE, 2) le matériau relativement faible nécessaire, 3) les larges gammes de pH disponibles, 4) la sensibilité de immunoblot et 5) l'estimation facile de l' changements. Les aspects plus fines de la technique mini-2DE est la quantification, malgré mini-2DE ne peuvent pas être considérées comme une approche quantitative, après alignement des taches ou des parcelles, il est possible d'établir un rapport entre la partie acide et basique ou vice-versa, fournissant ainsi une fiabilité estimation des changements observés ^9.

Plusieurs données de la littérature précise l'utilisation de mini-2DE pour réaliser la caractérisation des protéines, telles que des protéines surexprimées avec ou sans modification post-traductionnelle ^31, oligomérisation et de dégradation des voies décrites pour la démence à corps de Lewy et ^32,33 dans la figure 3A pour une AD patient. Un autre exemple de l'information fournie par m ini 2DE est la troncature des espèces amyloïdes bêta effectuées en cas de non-déments et AD comme une cible potentielle pour l'approche de vaccination ^34. La présence d'oligomères et de sa dégradation différentielle est également représenté sur la figure 3B en fonction d'un patient atteint de la MA sporadique ou familiale. En outre, mini approche 2DE ouvre une fenêtre large et pratique des possibilités depuis différents traitements peuvent être effectués. Par exemple, dans le domaine de l'AD, inhibiteurs de phosphatase peuvent être ajoutés et découvrir leur impact dans phosphorylation de Tau. Également l'effet pharmacologique de la drogue sur les voies de protéolyse, étant donné que l'identification et pI MW des formes tronquées peuvent fournir le site de clivage selon l'épitope de l'anticorps ^34. Fait intéressant, les données récentes ont élucidé l'aide de mini-2DE l'association de mode de vie et les traitements médicamenteux avec des troubles cognitifs chez les souris modèles, ainsi que le profil biochimique d'une nouvelle mutation de Tau ^35-37.

ntent "> Le développement d'un procédé permettant la 2D-DIGE du tissu cérébral obtenir de l'homme ou de l'origine de la souris ainsi que la validation à l'aide de mini-2DE derrière, peut faire la lumière en découvrant de nouvelles cibles et de biomarqueurs pour l'étude des maladies neurologiques pharmacologiques. Le fait que ces troubles ont leur origine dans le cerveau, obligent à étudier cet organe comme une source d'information idéale. Cependant, les échantillons humains sont limités, de sorte que l'utilisation de modèles animaux est indispensable pour atteindre cet objectif. Ici l'importance d'utiliser des approches en parallèle pour les deux types d'échantillons et de valider les résultats. Il est souhaitable que, dans un avenir proche candidats fiables seront trouvés et testés dans les fluides corporels tels que le plasma et le liquide céphalo-rachidien dans le but d'établir un diagnostic précoce, l'évaluation de la progression de la maladie et, éventuellement, l'évaluation des traitements disponibles plausibles.

Les étapes critiques dans le protocole doivent être prises en compte pour son Conviedemande le. Dans le cas de 2D-DIGE, la qualité de l'examen des échantillons est un point crucial. Ce test permet de savoir protéines profil et valider le montant réel des protéines extraient existant dans le tampon 2D après précipitation. Profils colorés nous donnent des informations sur la qualité et l'homogénéité entre les échantillons. Seuls les échantillons avec des motifs similaires doivent être utilisés pour des études 2D-DIGE, sinon le 2D-DIGE peut conduire à une mauvaise coloration et une faible résolution de profil protéique. Les différences dans ces échantillons modèles sont plus fréquentes chez l'homme que dans les tissus du cerveau de la souris, puisque les échantillons de cerveau humain pour la recherche traitent les nombreux gênant ^38,39. En outre, l'identification de la dégradation des protéines en raison de l'intervalle post-mortem a déjà été rapporté par 2D-DIGE ^40,41. Vérification du pH avant l'étiquetage des colorants de cyanine, cette étape doit nuire à toute procédure postérieure. Cyanine étiquetage de colorant et l'électrophorèse SDS-PAGE doit être fait dans l'obscurité commeautant que possible afin de ne pas influer marquage par fluorescence. Enfin, les gels de polyacrylamide doit être aussi homogène que possible entre eux, de manière à éliminer au cours de la variabilité inter-migration électrophorétique et de faciliter l'analyse des motifs se chevauchent et postérieur ^42,43.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CyDye DIGE FLUOR MIN KIT 5 nmol 1 * 5 Nmo	GE Healtcare	25-8010-65
Immobiline DryStrip	GE Healtcare		Reference in function of the pH interval/size
IPG Buffer, pH X-X	GE Healtcare		Reference in function of the pH interval desired
AMBERLITE IRN-150L MIXED BED RESIN 1	GE Healtcare	551797N
DRYSTRIP COVER FLUID IMMOBILINE 1 * 1 l	GE Healtcare	17-1335-01
KIT BOX IPG 1 * 1 KIT	GE Healtcare	28-9334-92	Plastic box to make the passive rehydration
MILLEX GS Filter	Millipore	SLGS033SB
Criterion XT Precast Gels 13.3 x 8.7 cm (W x L)	Bio-Rad		Reference in function of the MW to separate
IPGphor III Isoelectric Focusing Unit	GE Healtcare	11-0033-64
Ettan DALTsix Large Electrophoresis System	GE Healtcare	80-6485-08
OneTouch 2D Gel SpotPicker 1.5 mm	Gel Company	P2D1.5