Summary
En vanlig protein utvinning protokollen ved hjelp av urea / tiourinstoff / SDS buffer for mennesker og mus hjernevev tillater indentification av proteiner ved 2D-DIGE og deres påfølgende karakterisering av mini 2DE immunoblotting. Denne metoden gjør det mulig å oppnå mer reproduserbare og pålitelige resultater fra humane biopsier og eksperimentelle modeller.
Abstract
To-dimensjonal elektroforese (2DE) er et kraftig verktøy for å avdekke proteom modifikasjoner potensielt knyttet til ulike fysiologiske eller patologiske tilstander. I utgangspunktet er denne teknikken basert på separasjon av proteiner i henhold til deres isoelektriske punkt i et første trinn, og for det andre i henhold til deres molekylvekt ved SDS polyakrylamid gel elektroforese (SDS-PAGE). I denne rapporten en optimalisert prøvepreparering protokoll for liten mengde humant post-mortem og mus hjernevev er beskrevet. Denne metoden gjør det mulig å utføre både todimensjonal fluorescens forskjell gelelektroforese (2D-DIGE) og mini 2DE immunoblotting. Kombinasjonen av disse metodene gjør det mulig å ikke bare finne nye proteiner og / eller protein modifikasjoner i deres uttrykk takket være sin kompatibilitet med massespektrometri deteksjon, men også en ny innsikt i markører validering. Dermed mini-2DE koblet til vestlige blotting tillatelser til å identifisere og validere innlegg-Translasjonell modifikasjoner, proteiner katabolisme og gir en kvalitativ sammenligning mellom ulike tilstander og / eller behandlinger. Heri, tilbyr vi en metode for å studere komponenter av protein aggregater funnet i AD og Lewy legeme demens som amyloid-beta peptid og alfa-synuclein. Vår fremgangsmåte kan således tilpasses for analyse av proteomet og uoppløselige proteiner ekstrakt fra humane hjernevevet og muse modeller også. Parallelt, kan det gi nyttig informasjon for studiet av molekylære og cellulære stier involvert i nevrodegenerative sykdommer så vel som potensielle nye biomarkører og terapeutisk mål.
Introduction
Psykiske og nevrologiske lidelser representerer 13% av den globale sykdomsbyrden, må nye utfordringer som patofysiologiske mekanismer, risikofaktorer og prodromal biomarkører bli utforsket en. I tråd med denne målsettingen, proteomikk studier av den menneskelige hjerne blitt uunnværlig for å avdekke molekylære stier involvert i prosesser som hukommelse, atferd, følelser og neuronal plastisitet for eksempel, ikke bare for fysiologisk, men også for patologiske tilstander. Derfor vil anvendelse av dyremodeller og mer spesifikt den transgene mus, bringer en rekke muligheter for å etterligne etiologien av human neurodegenerative forstyrrelser 2.
Proteomikk tilnærminger er i dag tilgjengelig for å oppnå disse nye perspektiver i nevrovitenskap feltet. To-dimensjonal gelelektroforese (2DE) er en potent og sannsynlig enkel metode som gjør det mulig å sammenligne proteomet av et bredt spekter av prøver. Videre er det også enkraftig metode for å isolere et protein fra en kompleks blanding for å identifisere og videre analyse ved massespektrometri. Denne teknikken består i det vesentlige i to suksessive trinn: 1) proteinet separasjon i henhold til deres isoelektriske punkt (pI) ved isoelectrofocusing (IEF). Mer presist, er et elektrisk potensial som påtrykkes over immobiline akrylamid strimlene mellom en pH-gradient, og da proteinene vil migrere og fokusere på en bestemt pI i funksjon av deres globale nettoladning. 2) Isoelectrically fokusert proteiner denatureres og negativt ladet ved tilsetning av natriumdodecylsulfat (SDS), og dermed proteiner i deres første struktur separeres avhengig av deres tilsynelatende molekylvekt (MW) ved hjelp av SDS-PAGE 3.. Disse to distinkte egenskaper tillate oss å takle en dobbel verdi for å gå videre i studiet av proteomet. På den ene side er denne tilnærmingen gir muligheten for å utføre en kvantitativ analyse ved bruk av minimalt fargestoffer 2D-DIGE metode, og på den annen side en qualitative analyse av mini-2DE koblet til western blotting.
Kvantitativ analyse av 2D-DIGE skjenker protein uttrykk endrer hele prøven proteomet. Kort fortalt er prøvene merket med tre cyanines (CY2, Cy3 og Cy5) emitting på tre forskjellige bølgelengder (blått, grønt og rødt). Disse fluor minimal fargestoffer inneholdende N-hydroksy-succinimidyl-ester-gruppen reagerer med ε-aminogruppen i lysines rester av proteiner som resulterer i kovalente amidbindinger 4. Lysin-rester er merket bare mellom 1-3% og derved hindre flere etiketter tillegg per protein og større nettoladning modifikasjoner 5, 6. Cy3 og Cy5 blir ofte brukt til å merke to uavhengige utvalg mens CY2 tags en blanding av lik andel av prøvene for å sammenligne. De to viktigste fordelene er at alle merkede prøver er blandet og IEF-og SDS-PAGE utføres på en gel på en gang for hvert trinn, unngår den inter variabilitet blant eksperimenter på grunn av geler sammenligning. Videre presenterer den en høy deteksjonsgrensen på rundt en femtomole av protein 7. Geler blir skannet og 2D programvaren sammen 2D gel fluorescens bilder, hvor CY2 fungerer som en indre standard for å tillate identifisering av statistiske forskjeller mellom stedene for deres bakre identifikasjon ved massespektrometri. Den 2D-analyse-programvare ved hjelp av intern standard oppnår en rask påvisning av mindre enn 10% av forskjeller mellom prøver med mer enn 95% av statistisk sikkerhet 8..
Kvalitativ analyse av mini-2DE er et viktig skritt for protein karakterisering. Prinsippet er det samme som tidligere beskrevet for pI-og MW-separasjon, men i dette tilfellet proteiner blir overført fra en liten polyakrylamidgel til en membran og immunoblotting utføres etterpå. Mens den ene dimensjon gelelektroforese gir forandringer i protein ekspresjon av en eller flere protein-epitoper i funksjon av antistoffet, på informasjonsn av mini-2DE endows med to ekstra parametre. For det første protein isovariants endres som funksjon av pI, som angir at post-translasjonelle modifikasjoner kan finne sted. For det andre kan massespektrometri identifisering være en indikasjon på plausible zymogener og katabolske produkter av proteiner. Derfor modifikasjoner observert av 2D-DIGE er sannsynlig indikasjon på mekanismene bak endringer i global proteom profil. Justeringer av immunoblots blant flere prøver for samme protein epitop / s ved mini-2DE kan gjenspeile surhet endringer Shedding lys inn posttranslasjonelle variasjoner litt observert eller selv ikke etter monodimensional immunoblotting 9, 10. Videre informerer denne analysen om de potensielle spaltningsseter grunn til kunnskap om pi og MW av de metabolske rester 11,12.
Kombinasjonen av disse to teknikkene gir en komplementær proteomforskning analyse. På den ene siden 2D-DIGE gir en type av forskjeller tillater en nøyaktig isolering av polypeptider som uttrykk er forskjellig. Disse forskjeller består i det vesentlige inn i utseende eller forsvinningen av en flekk eller økning / reduksjon av intensiteten av en gitt en av programvare analyse av de fluorescerende geler. Men disse observasjonene i seg selv er lite sannsynlig å forklare innholdet i modifikasjonen observert. Av disse grunner, når polypeptidet blir isolert og identifisert ved massespektrometri, bruk av mini-2DE gjør det mulig å bekrefte nøyaktig 1) identiteten av proteinet isoleres og 2) arten av forskjellen: endring i isovariant / isoform nivå ekspresjonssystemer, post-translasjonelle modifikasjoner og cleavage prosesser for eksempel. Imidlertid er det nødvendig å utvikle et utgangs lysis buffer både kompatible med 2D-DIGE og med mini-2DE for å begrense de mulige dispersjoner som følge av bruk av ekstraksjonsmetoder som er svært forskjellige.
I denne artikkelen, vi utelattbeskrevet en tilpasset protokoll for utarbeidelse, utvinning og ytelse av 2D-DIGE og mini-2de teknikker for hjerne proteiner som kommer fra mennesker og mus vev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Homogenisering og Total Protein Utvinning fra Menneske og mus hjernevev
- Hjernevev homogenisering. Homogenisere hjernevevet 10% (w / v) i 8 M urea, 2 M tiourea og 1% w / v SDS buffer (UTS) ved hjelp av en rote-glass (for humane prøver) eller teflon homogenisator (for muse prøver). Sonicate ved 60 Hz 30 pulser med en ultralydgenerator anvende 0,5 sek for total oppløsning vev 13, 14..
- Bestem proteinkonsentrasjonen med Bradford-analysen ved bruk av BSA som standard. Dette UTS buffer ekstraksjon er fullstendig forenlig med en dimensjon SDS-PAGE, så lenge lysater ikke over-oppvarmet for å unngå karbamylering 15..
- Tilsett 1% (w / v) av Amberlite og inkuber med forsiktig omrøring i løpet av 10 min ved romtemperatur. Deretter filtrere på 0,22 mikrometer sprøytefiltre og til slutt legge til SDS til urea / thiourea løsning. Dette trinnet reduserer mengden av urinsyre og isocyansyre, som er i equilibrium med urea i løsning og lette dets nedbrytning.
- Kloroform / metanol protein nedbør. Fremskynde mellom 100-150 mikrogram av protein for 11 cm IPG Strips og 1-1,5 mg for 18 cm de (uavhengig om pH-området valgt å utføre IEF).
- Utføre alle trinnene på is eller ved 4 ° C. Kul kloroform og metanol ved 4 ° C i 30 min før utfellingen prosedyren.
- Til tre volumer av metanol og en volumdel kloroform til et volum på UTS lysat. Rist manuelt blandingen og tilsett tre mengder kaldt vann. Vortex i løpet av 1 minutt, og pellet proteinene ved sentrifugering ved 12 000 xg i 30 min ved 4 ° C.
- Kast supernatanten ved hjelp av en Pasteur pipette og tilsett tre bindene av kulde MeOH. Vortex igjen og sentrifuger ved 12 000 xg i 30 min ved 4 ° C. Endelig kast supernatanten og tørk pellet etter N 2.
- Utarbeidelse av proteiner for 2D-analyse.Resuspender protein-tørkede pellet i 2D-buffer (8 M urea, 2 M tiourea supplert med 4% CHAPS). Vask løsningen med Amberlite som angitt ovenfor, og prøver å holde andelen av 500 mikrogram protein per 200 pl buffer for 2D-2D-DIGE. Merk: 2D buffer kan lagres ved -80 ° C eller holdt ved 4 ° C i løpet av en uke (for å hindre nedbrytning av urea).
- Sonicate og lagre prøvene ved -80 ° C til utførelse av følgende trinn. Verdt å merke seg, kan denne protokollen brukes etter maursyre oppløsning av protein aggregater 10. Kort, fordamp maursyre etter N 2 og resuspender pelleten som beskrevet.
2. 2D-DIGE
- Prøver teste kvalitet. Dose prøver på nytt med Bradford metode. Fortynn 15 pg av proteiner i LDS prøvebuffer, oppvarmning ved 37 ° C 15 og laster inn på 4-12% polyakrylamidgeler.
- Coomassie farging. Flekk polyakrylamidgel med 0,1% (w / v) CoomassieBlå G-250, 50% EtOH og 10% (v / v) eddiksyre-oppløsningen i minst 1 time. Let bakgrunn destain over natten i 7% eddiksyre og 10% (volum / volum) etanoloppløsning.
- Pre-elektrofore merking av prøver. Før utføre cyanine fargestoff merking, kontrollerer pH-verdien av prøven, som skal være enkel eller til og med nøytral ettersom N-hydroksysuccinimid substitusjon er mer effektiv ved basisk pH, og gis for å være optimal ved pH 8,6.
- Merke minimalt de to prøver av studiet med Cy3 eller Cy5 fluorescerende fargestoffer med en ratio på 50 mikrogram protein/400 pmol fargestoff og holde i en time ved 4 ° C i mørket for å lette NHS ester reaktiv gruppe av cyanines med unprotonated amin grupper av lysines.
- Redusere variasjon i prøve gjør en cross-merking med Cy3 og Cy5 fargestoffer, unngå en fortrinnsrett kobling av én prøve til en bestemt cyanine. Legg merke til at cyanine-fargestoff minimal merking kan tilpasses for liten mengde av proteiner med å holde andelen av ett mikrogram protein per 8 pmol cyanine-dye. I så fall kan den mini 2DE-systemet bli brukt i stedet for den store 2D-gel-system. Dette vil gjøre det mulig for 2D-DIGE analyse for en liten mengde av hjernevev.
- Etiketten en pool av begge prøver med den samme mengde av protein (50 pg totalt) med CY2 fluorescerende fargestoff og anvendt som intern standard. Bruk de samme vilkår som tidligere indikert.
- Fullstendig til et totalvolum 350 pl med 2D-buffer inneholdende 1,1% Destreak reagens, 1,2% av IPG buffer og spor av bromfenolblå total 150 ug av merkede proteiner (50 ug CY2, 50 ug Cy3 og 50 ug CY2). Utfør dette trinnet i fire eksemplarer ved hjelp av fire uavhengige strimler. Videre forbereder ytterligere to ikke-merkede strips (en for hver prøve) med 350-450 mikrogram av protein for preparering gels.
- La de seks lastet strimler dekket med mineralolje over natten for passiv rehydrering.
- Isoelectrofocusing. Gjennomføre IEF på 206; C. For en pH 3-11NL, 18 cm stripe protokollen er: maksimal aktuell innstilling er 50 μA / stripe under 8 etapper: 1) 150 V skritt for en time, 2) 200 V skritt for 5 timer, 3) 500 V gradient for 2 t, 4) 1,000 V gradient i 2 timer, 5) 2000 V gradient i 2 timer, 6) 4000 V gradient i 2 timer, 7) 8000 V gradient i 2 timer og 8) for totalt 24 000 v • hr trinnet . Etter IEF, sende ut overskudd av mineral-olje ved hjelp av kromatografi papir og legge strimlene ved -20 ° C inntil den andre dimensjonen.
- IPG Strips ekvilibrering. Stabil strimler i 6 M urea, 2% SDS, 30% glycerol, 50 mM Tris-HCl pH 8,6 buffer med 1% DTT i 15 min, og etter med 4,7% av jodacetamid i den samme buffer, men uten DTT.
- For det andre dimensjon eller SDS-PAGE elektroforese. Gjør de seks 12% SDS-PAGE-geler (1,5 M Tris-HCl pH 8,6, 12% akrylamid / bisakrylamid, 0,1% (w / v) SDS, 0,072% (w / v) APS og 0,1% (v / v) TEMED ) på samme tid ved hjelp av et stort 2D-system, med fire lav-fluorescens glassplater for strimmelenps med fluorescens prøver og to andre glassplater med 1,5 mm tykkelse for preparering gels for å skjære protein flekker.
- Laste de seks IPG strimler på toppen av gelene og over lagdelt med 0,5% (w / v) av agarose. Løpebufferen inneholder 25 mM Tris, 192 mM glycin og 0,1% (w / v) SDS. Utføre overføringen på 2,5 W / gel over natten med et kuldeanlegg satt til 4 ° C 16,17.
- Fluorescens bilder oppkjøp og analyse. Bruk en Typhoon 9400 skanneren for å få fluorescens gels bilder (12 bilder for ett eksperiment). Scan CY2, Cy3 og Cy5 bilder for hver gel på 488/520 nm, 532/580 nm og 630/670 nm eksitasjon / utslipp bølgelengder, henholdsvis. Bruk informatic programvare for å analysere bildene. Dataene er representative for de endringer som punktvolum assosiert med fordelingen av signalet på tvers av de fire geler mellom de to prøver som ble studert.
- Coomassie farging for store gels. Fest preparering gels i fem0% (v / v), og EtOH 3% (v / v) fosforsyre-oppløsningen i minst 24 timer. Deretter etter, vaskes to ganger med ultrarent vann i 20 min. Utfør farge i 34% (v / v) MeOH, 17% (vekt / volum) ammonium-sulfat og 2% fosforsyre i 1 time før tilsats av 0.1% (w / v) Coomassie Blå G-250. Hold gels i fargen i minst 48 timer og avfarves i ultrarent vann.
- Spots for MS identifikasjon. Når fluorescens bilder er analysert, gir programvaren en liste over stedene som uttrykk er statistisk forskjellig. Manuelt skjære disse plassene fra de preparering gels. Denne fremgangsmåten krever øvelse og noen fingerferdighet for å unngå keratin forurensning. Deretter prøver kan oppbevares i vann ved -20 ° C inntil sende til MS. Spot identifikasjon er forenelig med tandem massespektrometri (MS / MS) og relevansen av protein identiteter blir dømt i henhold til sannsynligheten basert Mowse poengsum beregnet med en p-verdi på 0,05 (p <0,05) 18. </ Ol>
Tre. Kvalitativ Mini-2DE analysen
- Resuspender maksimum på 100 mikrogram av proteinprøven i 2D-buffer inntil et sluttvolum på 200 ul i en 11 cm IPG strimmel. Ved overekspresjonsystem eller renset protein, kan senkes start mengden til 20 ug.
- Til 1,1% (v / v) Destreak Reagent, 0,55% (v / v) IPG buffer og spor av bromfenolblå til et sluttvolum på 200 ul. Så, vortex, gjør en rask spinn og laste inn en IPG stripe for passiv rehydrering (å bringe stripe til sin opprinnelige tykkelse) over natten dekket med mineralolje. Merk: andelen av IPG buffer er den samme for hele intervallet av pH ønskede (pH 3-11, 4-7, 7-11, etc), men dets sammensetning varierer som funksjon av pH-område velges.
- Isoelectrofocalisation. Utfør IEF ved 20 ° C. Varigheten av programmet avhengig av pH-intervall er valgt. Verdt å merke seg, parametre som electroendosmosis kan forstyrre IEF profil og i disse tilfellene,optimalisering i electrofocalisation tid kreves 19. Merk: det er ikke nødvendigvis en lengre IEF som gir bedre resultater, men forkorte den tiden av IEF kan også forbedre oppløsningen. Etter IEF kan IPG strimlene lagres ved -20 ° C i flere måneder.
- IPG strimler ekvilibrering. Stabil strimlene i en buffer inneholdende 25 mM Tris-HCl pH 6,8, 20 mM DTT, 10% glycerol, 5% SDS, 0,05% bromfenolblått. Lag tre ekvilibrering bader i 15 minutter med skiftende bufferoppløsningen mellom hvert bad.
- SDS-PAGE. Layer den IPG stripen på en forhåndsstøpt gel (IPG en vel, 11 cm IPG strip) med en prosentandel av polyakrylamid velges avhengig av MW for proteinet av interesse. Deretter blot gel på en nitrocellulose / PVDF membran på 100 mV under 33 min.
- Inkuber over natten med den ønskede antistoff og visual av peroksidase-aktivitet. Utfør justeringer av immunoblots hjelp urelaterte polypeptider avslørt av den sekundære antistoff. Nå et halvt quantittiv analyse av densitometry av volumet og intensitet for spor / flekker med ImageJ programvare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Proteomikk på hjernevev forblir utfordrende siden ingen ideell buffer eksisterer for å gjenopprette 100% av proteiner, spesielt membran-assosiert eller cytoskjelett proteiner. Det første sett av eksperimenter ble fokusert på leting etter en egnet lyseringsbuffer kompatible med de to fremgangsmåter og som gjør det mulig å gjenopprette et stort panel av protein. Således ble tre lysis buffere analysert for å bestemme den mest passende en. For det første ble det brukt den vanlige biokjemiske og molekylære biologi buffer Tris-HCl 20 ved 10 mM til 1% (w / v) SDS (figur 1A). Videre har Tris-HCl en robust anvendelse som en elektroforese buffer for polyakrylamid-og agarosegeler. De andre to lysis buffere var UTS (Figur 1B) og 2DE ett. Tris-SDS ga et dårlig oppløsning og antall flekker var betydelig redusert (figur 1B) i forhold til den som er observert med UTS, hvor et høyt sted separasjon, ingen vridning og en far bedre utvinne av proteiner ble observert (Figur 1B). Dette punkt understøttes av det faktum at UTS ekstraksjon utbytter nesten ingen gjenværende pellet, mens Tris-HCl skylder en tykk ene etter benken sentrifugering. Mønsteret vist i figur 1B, gir klart bevis på høyere protein oppløselighet i UTS om andre buffere slik som Tris-HCl. Notheworthy at selv 2DE buffer ble også testet, ble bruken utelukket ettersom tross pellet ble heller ikke observert, lipider ble ikke oppløst, og de forble i det øvre laget difficulting manipulering. I overensstemmelse med disse data, er det anbefalt bruk av UTS buffer av flere grunner 1) sin nøytrale chaotrope som denatures proteiner ved opprivning nonconvalent og ioniske bindinger mellom aminosyrerestene og unngå aktiviteten av proteaser som bryter ned celleproteiner 21 2) tilsetning tiourea til urealøsningen drastisk forbedrer oppløseligheten av hydrofobe membranproteinerog proteiner som er utsatt for aggregat 22, 23 og 3) adjunction av det anioniske vaskemiddel SDS bryter lipider binde proteiner via hydrofobe vekselvirkninger, så vel som øker protease og fosfatase-aktivitet inhibering 24,25. Videre ble det besluttet å legge en nedbør skritt for å eliminere impureties som kan forstyrre IEF. På denne måte bestemmer så presipiteringsmetoden oppløseligheten av proteinene 26 og metanol er allerede blitt beskrevet som det mest passende løsningsmiddel for å fjerne fett som er rikt på hjernevev, førte oss til å velge den kloroform / metanol ventet 27.. Utnyttelsen av den zwitterioniske detergent CHAPS (3 - [(3-cholamidopropyl) dimethylammonio]-1-propan-sulfonat) for å oppslemme proteinene pellet i 2D-buffer er på grunn av sin egnethet for å lette protein inngang i den første dimensjonen trinn 28..
Profilen på menneskelige og mus hjerne proteome ved 2D-DIGE er vist i figurene 2A og 2B respektivt. I Figur 2A fusjonert fluorescerende bilder kommer fra menneskelig kontroll og AD cortex prøvene kan observeres i figur 2B idem for muse prøver fra hippocampus av en modell av AD-lignende Tau patologi 29. CY2, er Cy3 og Cy5 henholdsvis illustrert for de humane prøver i Tall 2C-2E. Begge fusjonerte mønstre (figur 2A og 2B) presentere et høyt sted oppløsning som reflekterer en høy kvalitet IEF og andre dimensjonen separasjon i samråd med profilen observert i figur 1B. Denne flekk definisjonen kvalitet sammen med det faktum at kryssbinding er utført for å eliminere en mulig preferanse av proteinene til en bestemt cyanine, gjør disse fluorescens bilder (figurene 2C-2E) meget enkel å justere hele programvaren analyse. Videre har de preparative geler farget med blå Coomassie bevis en beriket protein kartet med rikelig flekker over pH-området benyttes, slik at man skjære de plassene etter programvare analyse og for deres bakre identifisering av MS / MS.
Den kvalitative mini 2DE ved immuno-analyse for et protein som gir høy verdi-informasjon for sin identifisering og modifikasjoner, ikke bare for post-translasjonelle seg, men også for oligomerer og trunkeringer (Fig. 3A og 3B). Mulighets å utføre denne teknikken i mini 2DE gir raske og presise data om protein av interesse. Angående vev fra en pasient påvirket av Lewy Body Demens (LBD), karakterisering av alpha-synuclein gjør det mulig å visualisere en veldefinert 4-7 pH profil der de innfødte protein er på en PI på 4,67 og en MW 18 kDa, likevel med mini-2DE det kan videre sees at nærværet av dimerer (figur 3A, asterisk) på samme pI enn native former, men også at det foreligger ubiquitinated former som er mer grunnleggende, og med en høyere MW når mer ubiquitinated de er (figur 3A, piler). Et annet protein nært knyttet til AD er den amyloid-beta-peptid, som genereres av den komplekse katabolisme av amyloid forløper protein (APP). I Figur 3B er det i forhold til handlingen i en Sporadic AD tilfelle med en familiær ett. I tilfelle av de kjente AD kan det observeres hvordan amyloid-beta 1-42 er redusert i forhold til den sporadiske AD, og dessuten de isovariants amyloid-beta x-42 (4 kDa) er også nedregulert over gapet Imens oligomerene funnet på åtte kDa reflektere at dette faktum er ikke på grunn av en lavere mengde protein, ettersom flekker intensitet er mer relevant i kjent AD (Figur 3B).
Figur 1: 2DE profile etter 10 mM Tris 1% SDS vekt / volum buffer uttak (A), og mønsteret som oppnås etter UTS utnyttelse (B). I panel B kan det sees hvordan antall flekker, intensitet og oppløsningen er mye høyere enn den av panelet (A). Bruken av UTS gjør en nesten total protein utvinning at det gjenspeiles i 2DE Coomassie farging. Klikk her for å se større bilde.
Figur 2: 2D-Dige profiler for human (A) og mus (B) er illustrert bilder (A) og (B) representerer de sammenslåtte bilder for de tre cyanines i et pH-område på 3 til 11 18 cm strimmel.. I bildene (C), (D) og (<strong> E) cyanines er utsatt uavhengig (CY2 i blått, Cy3 i grønt og Cy5 i rødt). Klikk her for å se større bilde.
Figur 3: I det øvre panelet kan det observeres at mini-2DE profil av protein alfa-synuclein in en LBD pasient Den opprinnelige pI (4,4) og MW (18 kDa) endringer i funksjonen av dimerisering (stjerne) hvor MW. er dobbelt, og ubiquitinering som forskyver pI inntil en mer grunnleggende en (piler) (A). Ned bilde viser profilen av en amyloid-beta-peptid-antistoff i en sporadisk og genetisk tilfelle av AD. 2DE mønster viser hvordan oligomerisering og nedbrytning finne sted på en annen måte i henhold til etiologien av disease. Dette immunoblot klart påpeker forskjellene i APP katabolisme mellom de to forholdene. På den ene siden er det en økning i den katabolske produktene i i sporadiske AD angående familiær en (piler), mens oligomerene synes å være mindre markert (B). Disse eksperimenter har blitt utført på 11 cm strimler i en 4-7 pH gap i en 12% Bis-Tris gel og i en 16,5% Tris-Tricine en henholdsvis (A, B). for å vise større bilde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Oppdage patologiske uttrykk endringer av proteiner, søke etter biomarkører og modulering av potensielle trasé for farmakologiske mål er blant målene for de neuroproteomics nærmer 30. Blant de nye verktøyene, den 2DE feltet gir en lovende expectative. Likevel bør en konsensus nås for å minimalisere variabiliteten og øke reproduserbarheten i eksperimentene. I tråd med denne ideen en standardisert protokoll for å utføre 2D-DIGE (figur 2) og den etterfølgende 2DE immunoblotting (Fig. 3) for human-og mus hjernevev fullt kompatibel med mono-dimensjonale immunoblotting er heri beskrevet detaljert.
En av de største dilemmaene i proteomikk er oppløseliggjøring buffer valg. For å øke reproduserbarheten av de forskjellige metodene, ble UTS valgt fordi den er helt forenlig med IEF. Videre gir UTS utvinning buffer ingen pellet eller en virkelig svak en etter sentrifugering ved 12 000 xg (ikke forveksles med SDS utfelling ved 4 ° C). Dette er et viktig punkt å ta hensyn til at mange nevrodegenerative lidelser stede proteiner aggregering, inkludert AD. Det faktum at det ikke er noen pellet forenkler ytelse og tolking, siden ingen uavhengige studier bør gjøres oppløselige og ikke-oppløselige fraksjonen.
Uansett 2D-Dige eller mini-2D tilnærminger skal utføres, er det noen begrensninger som bør være indisert. For det første de kjemiske egenskapene til UTS buffer, denne løsningen må ikke bli overopphetet, eller karbamylering skjer på primære aminer og kan derfor påvirke både cyanine fargestoff kobling og 2D-profil, forverring flekker oppløsning ved å svekke IEF 15. Dernest, de tilgjengelige pH områder, i dag det største pH-intervallet er blant 3-11, denne faktoren ble med til sannsynligheten for at ikke alle proteiner oppføring på IPG stripe kan Explain de stablede proteiner bånd i begge sider av gelene etter farging. Denne begrensningen kan forklare hvorfor ikke hele proteomet kan studeres ved 2D. En annen viktig begrensning er kontrovers bruk av nedbør. På den ene side er det meget tilrådelig å gjøre utfellingstrinnet med kloroform / metanol som gjør det mulig å effektivt redusere lipidinnholdet 27, salter, nukleinsyrer og ladede vaskemidler som kan forstyrre IEF parametere og påvirker oppløsningen og / eller reproduserbarhet 2D. Dessuten, på den annen side kan det ikke utelukkes at noen proteiner sterkt festet til membranen, kan gå tapt. Ikke desto mindre, i det tilfelle at andre ekstraksjons buffere blir benyttet i stedet for UTS, enten med eller uten tilsetning av proteaser eller fosfataser inhibitorer, anvendelse av utfellingstrinnet er sterkt anbefalt for alle fallgruver i løpet av IEF. Til slutt, er det verdt å merke seg at 2D-Dige bilder analyse presenterer det inntrufne som overlappet fluorescensflekker kan føre til tap av informasjon, siden til programvare analyse anser ikke dette som en betydelig variasjon.
Det nye ved denne kombinerte metode ligger i deres reproduserbarhet, allsidighet og proteiner karakterisering. Bare én ekstraksjon buffer gjør det mulig å utføre to komplementære teknikker. 2D-DIGE gir kvantitativ informasjon om proteiner uttrykk endringer og deres påfølgende identifisering av MS / MS. Det er imidlertid mulig at isoformer, isovariants, zymogener, post-translasjonelle modifiseringer og katabolske produkter som ikke kunne identifiseres fordi overlapp fluorescens med andre proteiner. For å overvinne denne begrensningen foreslås det i parallell ved bruk av mini 2DE. Faktisk er en av de viktigste fallgruve som kan bli opptatt av er så vidt vi vet for å ta mono-dimensjonale immunoblotting som en komplett validering av 2D-dige resultater, eller til å tenke på at en hvilken som helst proteomforskning modifikasjon er ikke nødvendig å validere. Furthermore, tekniske fordelene med mini 2DE er 1) muligheten for å bruke små SDS-PAGE systemer, 2) den relativt lave material eventuelt 3) de brede områder av pH er tilgjengelige, 4) immunoavtrykket følsomhet og 5) den lette estimering av endringer. De særeste aspekter av mini 2DE teknikken er kvantifiseringen, til tross for mini-2DE ikke kan betraktes som en kvantitativ tilnærming, etter flekker eller plott justering det er mulig å etablere et forhold mellom syrlig og grunnleggende del eller vice versa, møblering på denne måten en pålitelig estimering av endringene observert ni.
Flere av data i litteraturen og nøyaktig bruk mini-2DE å oppnå proteinkarakterisering, slik som for overexpressed proteiner med og uten post-translasjonell modifikasjon 31, oligomerisering og nedbrytningsmekanismer er beskrevet for demens med Lewy-legemer 32,33 og i figur 3A for en AD pasient. Et annet eksempel på opplysninger gitt av m ini 2DE er avkutting av beta amyloid arter utført i ikke-demente og AD tilfeller som et potensielt mål for vaksinasjon tilnærming 34. Tilstedeværelsen av oligomerer og dens differensielt nedbrytning er også vist i figur 3B, avhengig av en sporadisk eller kjent AD pasient. I tillegg åpner mini 2DE tilnærming et bredt og praktisk vindu muligheter ettersom forskjellige behandlinger kan utføres. For eksempel innen AD, kan fosfatase hemmere legges til og avdekke deres innflytelse i Tau fosforylering. Også den farmakologiske medikamenter effekt på proteolyse pathways, gitt at pI, og MW identifisering av de avkortede formene kan gi spaltningssetet i henhold til antistoffets epitop 34.. Interessant, har nyere data belyst ved hjelp av mini-2DE foreningen av livsstil og medikamentell behandling med kognitive svekkelser i musemodeller, samt biokjemiske profilen til en ny Tau mutasjon 35-37.
ntent "> Utviklingen av en metode som gjør det mulig 2D-DIGE av hjernevev får fra menneske eller mus opprinnelse samt validering ved hjelp av mini-2DE bak, kan kaste lys inn avdekke nye farmakologiske mål og biomarkører for studiet av nevrologiske sykdommer. Det faktum at disse lidelsene har sin opprinnelse i hjernen, forplikte å studere dette organet som en ideell informasjonskilde. Imidlertid er humane prøver begrenset, så bruk av dyremodeller blir uunnværlig for å oppnå dette målet. Heri viktigheten av å bruke tilnærminger i parallell for begge typer av prøver og validere resultatene. Det er ønskelig at i nær fremtid pålitelige kandidater vil bli funnet og testet i korporal fluider slik som plasma and cerebrospinal fluid for å etablere en tidlig diagnose, vurdering av sykdomsutviklingen og eventuelt evalueringen av de plausible behandlinger tilgjengelig.Kritiske trinnene i protokollen må tas i betraktning for sin suitable søknad. I tilfelle av 2D-DIGE, er prøvene testkvaliteten et avgjørende punkt. Denne testen tillatelser til å vite proteiner profil og validere den virkelige mengden av proteiner extract eksisterende i 2D buffer etter nedbør. Stained profilene gir oss informasjon om kvalitet og homogenitet mellom prøvene. Kun prøver med lignende mønstre må brukes for 2D-Dige-studier, ellers 2D-DIGE kan føre til dårlig beising, og dårlig oppløsning av protein-profil. Forskjeller i disse prøvene mønstre er mer vanlig hos mennesker enn hos mus hjernevev, siden menneskelig hjerneprøver for forskning avtale med de mange upraktisk 38,39. I tillegg har identifisering av proteindegradering på grunn av post-mortem-intervall er allerede rapportert av 2D-DIGE 40,41. Kontroll av pH-verdien før cyanine fargestoff merking, må dette trinnet forringe hele bakre prosedyre. Cyanine fargestoffmerking og SDS-PAGE-elektroforese bør gjøres i mørket imye som mulig for ikke å påvirke fluorescens-merking. Til slutt må polyakrylamidgeler være så homogen som mulig mellom dem, for å eliminere inter-variasjon under elektroforetisk migrering, og for å lette mønstre overlapper og bakre analyse 42,43.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfattere har ingen interessekonflikt å erklære.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av INSERM, Universitetet i Lille 2, MEDIALZ, LABEX (excellence laboratorium, program investere for fremtiden) og DISTALZ (utvikling av innovative strategier for en tverrfaglig tilnærming til Alzheimers sykdom). FJ.FG er for tiden en mottaker fellesskap av ANR (French National Research Agency / NeuroSplice de Tau Projet ANR-2010-BLAN-1114 01), men dette arbeidet var også under støtte av et stipend fra SMM (Spania).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CyDye DIGE FLUOR MIN KIT 5 nmol 1 * 5 Nmo | GE Healtcare | 25-8010-65 | |
| Immobiline DryStrip | GE Healtcare | Reference in function of the pH interval/size | |
| IPG Buffer, pH X-X | GE Healtcare | Reference in function of the pH interval desired | |
| AMBERLITE IRN-150L MIXED BED RESIN 1 | GE Healtcare | 551797N | |
| DRYSTRIP COVER FLUID IMMOBILINE 1 * 1 l | GE Healtcare | 17-1335-01 | |
| KIT BOX IPG 1 * 1 KIT | GE Healtcare | 28-9334-92 | Plastic box to make the passive rehydration |
| MILLEX GS Filter | Millipore | SLGS033SB | |
| Criterion XT Precast Gels 13.3 x 8.7 cm (W x L) | Bio-Rad | Reference in function of the MW to separate | |
| IPGphor III Isoelectric Focusing Unit | GE Healtcare | 11-0033-64 | |
| Ettan DALTsix Large Electrophoresis System | GE Healtcare | 80-6485-08 | |
| OneTouch 2D Gel SpotPicker 1.5 mm | Gel Company | P2D1.5 |
References
- Collins, P. Y., et al. Grand challenges in global mental health. Nature. 475, 27-30 (2011).
- De Deyn, P. P., Van Dam, D., Sergeant, N., Buée, L. Animal Models of Dementia Vol. 48 Neuromethods 449-468. , Humana Press. 449-468 (2011).
- O'Farrell, P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J Biol Chem. 250, 4007-4021 (1975).
- Riederer, B. M. Non-covalent and covalent protein labeling in two-dimensional gel electrophoresis. J Proteomics. 71, 231-244 (2008).
- Marouga, R., David, S., Hawkins, E. The development of the DIGE system: 2D fluorescence difference gel analysis technology. Anal Bioanal Chem. 382, 669-678 (2005).
- Westermeier, R., Scheibe, B. Difference gel electrophoresis based on lys/cys tagging. Methods Mol Biol. 424, 73-85 (2008).
- Gong, L., et al. Drosophila ventral furrow morphogenesis: a proteomic analysis. Development. 131, 643-656 (2004).
- Gharbi, S., et al. Evaluation of two-dimensional differential gel electrophoresis for proteomic expression analysis of a model breast cancer cell system. Mol Cell Proteomics. 1, 91-98 (2002).
- Ando, K., et al. Tau pathology modulates Pin1 post-translational modifications and may be relevant as biomarker. Neurobiol Aging. 34, 757-769 (2013).
- Bretteville, A., et al. Two-dimensional electrophoresis of tau mutants reveals specific phosphorylation pattern likely linked to early tau conformational changes. PLoS One. 4, 4843 (2009).
- Sergeant, N., et al. Two-dimensional characterization of paired helical filament-tau from Alzheimer's disease: demonstration of an additional 74-kDa component and age-related biochemical modifications. J Neurochem. 69, 834-844 (1997).
- Sergeant, N., et al. Different distribution of phosphorylated tau protein isoforms in Alzheimer's and Pick's diseases. FEBS Lett. 412, 578-582 (1997).
- Rabilloud, T., Luche, S., Santoni, V., Chevallet, M. Detergents and chaotropes for protein solubilization before two-dimensional electrophoresis. Methods Mol Biol. 355, 111-119 (2007).
- Wrobel, K., Caruso, J. A. Pretreatment procedures for characterization of arsenic and selenium species in complex samples utilizing coupled techniques with mass spectrometric detection. Anal Bioanal Chem. 381, 317-331 (2005).
- McCarthy, J., et al. Carbamylation of proteins in 2-D electrophoresis--myth or reality. J Proteome Res. 2, 239-242 (2003).
- Chafey, P., et al. Proteomic analysis of beta-catenin activation in mouse liver by DIGE analysis identifies glucose metabolism as a new target of the Wnt pathway. Proteomics. 9, 3889-3900 (2009).
- Kahn, J. E., et al. Comparative proteomic analysis of blood eosinophils reveals redox signaling modifications in patients with FIP1L1-PDGFRA-associated chronic eosinophilic leukemia. J Proteome Res. 10, 1468-1480 (2011).
- Pottiez, G., et al. A large-scale electrophoresis- and chromatography-based determination of gene expression profiles in bovine brain capillary endothelial cells after the re-induction of blood-brain barrier properties. Proteome Sci. 8, 57 (2010).
- Stochaj, W. R., Berkelman, T., Laird, N. Preparative 2D Gel Electrophoresis with Immobilized pH Gradients: IPG Strip Equilibration. CSH Protoc. , (2006).
- Azimzadeh, O., et al. Formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) proteome analysis using gel-free and gel-based proteomics. J Proteome Res. 9, 4710-4720 (2010).
- Singh, S., et al. Identification of the p16-Arc subunit of the Arp 2/3 complex as a substrate of MAPK-activated protein kinase 2 by proteomic analysis. J Biol Chem. 278, 36410-36417 (2003).
- Rabilloud, T. Use of thiourea to increase the solubility of membrane proteins in two-dimensional electrophoresis. Electrophoresis. 19, 758-760 (1998).
- Molloy, M. P., et al. Extraction of membrane proteins by differential solubilization for separation using two-dimensional gel electrophoresis. Electrophoresis. 19, 837-844 (1998).
- Ericsson, C., Peredo, I., Nister, M. Optimized protein extraction from cryopreserved brain tissue samples. Acta Oncol. 46, 10-20 (2007).
- Shaw, M. M., Riederer, B. M. Sample preparation for two-dimensional gel electrophoresis. Proteomics. 3, 1408-1417 (2003).
- Ye, X., et al. Optimization of protein solubilization for the analysis of the CD14 human monocyte membrane proteome using LC-MS/MS. J Proteomics. 73, 112-122 (2009).
- Centlow, M., Hansson, S. R., Welinder, C. Differential proteome analysis of the preeclamptic placenta using optimized protein extraction. J Biomed Biotechnol. 2010, 458-748 (2010).
- Perdew, G. H., Schaup, H. W., Selivonchick, D. P. The use of a zwitterionic detergent in two-dimensional gel electrophoresis of trout liver microsomes. Anal Biochem. 135, 453-455 (1983).
- Schindowski, K., et al. Alzheimer's disease-like tau neuropathology leads to memory deficits and loss of functional synapses in a novel mutated tau transgenic mouse without any motor deficits. Am J Pathol. 169, 599-616 (2006).
- Veenstra, T. D., Marcus, K. Multidimensional advancement of neuroproteomics. Expert Rev Proteomics. 5, 149-151 (2008).
- Hernandez-Hernandez, O., et al. Myotonic dystrophy CTG expansion affects synaptic vesicle proteins, neurotransmission and mouse. 136, 957-970 (2013).
- Deramecourt, V., et al. Biochemical staging of synucleinopathy and amyloid deposition in dementia with Lewy bodies. J Neuropathol Exp Neurol. 65, 278-288 (2006).
- Tofaris, G. K., Razzaq, A., Ghetti, B., Lilley, K. S., Spillantini, M. G. Ubiquitination of alpha-synuclein in Lewy bodies is a pathological event not associated with impairment of proteasome function. J Biol Chem. 278, 44405-44411 (2003).
- Sergeant, N., et al. Truncated beta-amyloid peptide species in pre-clinical Alzheimer's disease as new targets for the vaccination approach. J Neurochem. 85, 1581-1591 (2003).
- Le Freche, H., et al. Tau phosphorylation and sevoflurane anesthesia: an association to postoperative cognitive impairment. Anesthesiology. 116, 779-787 (2012).
- Leboucher, A., et al. Detrimental effects of diet-induced obesity on tau pathology are independent of insulin resistance in tau transgenic mice. Diabetes. 62, 1681-1688 (2013).
- Deramecourt, V., et al. Clinical, neuropathological, and biochemical characterization of the novel tau mutation P332S. J Alzheimers Dis. 31, 741-749 (2012).
- Birdsill, A. C., Walker, D. G., Lue, L., Sue, L. I., Beach, T. G. Postmortem interval effect on RNA and gene expression in human brain tissue. Cell Tissue Bank. 12, 311-318 (2011).
- Bell, J. E., et al. Management of a twenty-first century brain bank: experience in the BrainNet Europe consortium. Acta Neuropathol. 115, 497-507 (2008).
- Crecelius, A., et al. Assessing quantitative post-mortem changes in the gray matter of the human frontal cortex proteome by 2-D DIGE. Proteomics. 8, 1276-1291 (2008).
- Swatton, J. E., Prabakaran, S., Karp, N. A., Lilley, K. S., Bahn, S. Protein profiling of human postmortem brain using 2-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis (2-D DIGE). Mol Psychiatry. 9, 128-143 (2004).
- Viswanathan, S., Unlu, M., Minden, J. S. Two-dimensional difference gel electrophoresis. Nat Protoc. 1, 1351-1358 (2006).
- Tannu, N. S., Hemby, S. E. Two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis for comparative proteomics profiling. Nat Protoc. 1, 1732-1742 (2006).
