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Neuroscience

Proteína Consenso Brain-derivada, protocolo de extração para o Estudo do cérebro humano e murino Proteome Usando ambas 2D DIGE e Mini 2DE Immunoblotting

Published: April 10, 2014 doi: 10.3791/51339

Summary

Um protocolo de extração de proteínas comum utilizando tampão uréia / tiouréia / SDS para tecido cerebral humano e camundongos permite indentification de proteínas por 2D-DIGE e sua posterior caracterização por mini-immunoblotting 2DE. Este método permite a obtenção de resultados mais reprodutíveis e confiáveis ​​a partir de biópsias humanos e modelos experimentais.

Abstract

Electroforese em gel bidimensional (2DE) é uma ferramenta poderosa para detectar modificações proteoma potencialmente relacionados com diferentes condições fisiológicas ou patológicas. Basicamente, esta técnica baseia-se na separação de proteínas de acordo com o seu ponto isoelétrico, num primeiro passo, e em segundo lugar de acordo com os seus pesos moleculares por electroforese SDS em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). Neste relatório, um protocolo de preparação da amostra otimizado para pouca quantidade de post-mortem e cérebro do rato tecido humano é descrito. Este método permite efectuar tanto a electroforese bidimensional em gel diferença de fluorescência (2D-DIGE) e mini-imunotransferência 2DE. A combinação destas abordagens permite não só para encontrar novas proteínas e / ou modificações de proteínas em sua expressão, graças à sua compatibilidade com detecção por espectrometria de massa, mas também uma nova visão sobre a validação de marcadores. Assim, mini-2DE acoplado a licenças de Western blotting para identificar e validar pós-Translacionais modificações, proteínas catabolismo e fornece uma comparação qualitativa entre diferentes condições e / ou tratamentos. Aqui, nós fornecemos um método para estudar componentes de agregados de proteínas encontradas na DA e demência de Lewy, como o peptídeo beta-amilóide e da alfa-sinucleína. O nosso método pode assim ser adaptado para a análise do proteoma e proteínas insolúveis extrair a partir de modelos de tecido do cérebro e ratos humanos também. Em paralelo, pode fornecer informações úteis para o estudo de vias celulares e moleculares envolvidos em doenças neurodegenerativas, bem como potenciais novos biomarcadores e alvos terapêuticos.

Introduction

Os transtornos mentais e neurológicos representam 13% da carga global de doenças, novos desafios, como os mecanismos fisiopatológicos, fatores de risco e biomarcadores prodromal deve ser explorado 1. Em linha com esse objetivo, proteômica estudos do cérebro humano tornou indispensável para descobrir vias moleculares envolvidas em processos como a memória, o comportamento, as emoções e plasticidade neuronal, por exemplo, não só para o fisiológico, mas também para condições patológicas. Portanto, a utilização de modelos animais e, mais especificamente, os ratinhos transgénicos, leva uma ampla gama de possibilidades para imitar a etiologia de desordens neurodegenerativas humanas 2.

Abordagens proteômicas estão hoje disponíveis, a fim de realizar estas novas perspectivas no campo da neurociência. Electroforese em gel bidimensional (2DE) é um método simples e potente provável que permite comparar o proteoma de uma vasta gama de amostras. Além disso, é também umpoderoso método para isolar uma proteína a partir de uma mistura complexa, a fim de identificar e analisar mais por espectrometria de massa. Esta técnica consiste, essencialmente, em duas etapas sucessivas: 1) a separação de proteínas de acordo com o seu ponto isoeléctrico (pi) por isoelectrofocusing (IEF). Mais precisamente, um potencial elétrico é aplicado através das tiras de acrilamida Immobiline entre um gradiente de pH e, em seguida, as proteínas irão migrar e se concentrar em um pI determinado em função de sua carga líquida global. 2) proteínas Isoelectrically focadas são desnaturados e negativamente carregados pela adição de dodecilsulfato de sódio (SDS), desse modo as proteínas na sua primeira estrutura são separadas de acordo com o seu peso molecular aparente (MW) por SDS-PAGE 3. Estas duas propriedades distintas nos permitem enfrentar um duplo valor para ir mais longe no estudo do proteoma. Por um lado, esta abordagem oferece a possibilidade de realizar uma análise quantitativa utilizando corantes mínimas método 2D-DIGE, e por outro lado um qualitativanálise e por mini-2DE acoplada a transferência de western.

A análise quantitativa por 2D-DIGE concede a expressão da proteína muda todo o proteoma amostra. Resumidamente, as amostras são rotulados com três cianinas (Cy2, Cy3 e Cy5) emitindo em três comprimentos de onda diferentes (azul, verde e vermelho). Estes corantes fluor mínimo contendo grupo de éster N-hidroxi succinimidil reagir com o grupo ε-amino de lisinas de resíduos de proteínas, resultando em ligações covalentes amida 4. Resíduos de lisina são rotulados apenas entre 1-3% e evitando assim várias etiquetas por adição de proteína e grandes modificações carga líquida 5, 6. Cy3 e Cy5 são muitas vezes utilizados para rotular duas amostras independentes, enquanto Cy2 Tag uma mistura de igual proporção das amostras para comparar. As duas principais vantagens são de que todas as amostras marcadas são misturadas e IEF e SDS-PAGE são realizadas em um gel de uma só vez para cada passo, evitando inter variabilidade entre experiências, devido à géis de comparação. Além disso, apresenta-se um limiar de detecção de pico de cerca de 1 femtomole de proteína 7. Géis são digitalizados e software 2D compara as imagens de fluorescência de gel 2D, onde Cy2 serve como padrão interno permitindo a identificação de diferenças estatísticas entre os pontos para a sua posterior identificação por espectrometria de massa. O software de análise de 2D utilizando o padrão interno atinge uma rápida detecção de menos do que 10% das diferenças entre as amostras com mais de 95% de confiança estatística 8.

A análise qualitativa por mini-2DE é um passo crucial para a caracterização de proteínas. O princípio é o mesmo que anteriormente descrito para a separação de pI e PM, mas, neste caso, as proteínas são transferidas a partir de um pequeno gel de poliacrilamida para uma membrana e imunotransferência é executada posteriormente. Enquanto uma dimensão de electroforese em gel proporciona as alterações na expressão de proteína por um ou vários epitopos da proteína em função do anticorpo, o INFORMAÇÃOn de mini-2DE dota com dois parâmetros adicionais. Em primeiro lugar, os isovariants proteína mudar em função do pI, indicando que as modificações pós-traducionais pode ter lugar. Em segundo lugar, a identificação de espectrometria de massa pode ser um indicativo de zimogénios plausíveis e produtos do catabolismo de proteínas. Portanto, as modificações observadas por 2D-DIGE provavelmente indicativo dos mecanismos de mudanças no perfil global proteoma subjacentes. Alinhamentos de immunoblots entre várias amostras para o mesmo epítopo de proteína / s por mini-2DE podem refletir mudanças de acidez derramando luz em variações pós-traducionais pouco observados ou até mesmo não por immunoblotting monodimensional 9, 10. Além disso, esta análise informa sobre os potenciais locais de clivagem, devido ao conhecimento do pI e PM dos resíduos metabólicos 11,12.

A combinação destas duas técnicas proporciona uma análise proteômica complementar. Por um lado 2D DIGE oferece um tipe das diferenças, permitindo um isolamento precisa de polipéptidos, cuja expressão é diferente. Essas diferenças consistem essencialmente no aparecimento ou desaparecimento de uma mancha ou aumento / diminuição da intensidade de um dado, uma a análise dos géis fluorescentes software. No entanto, estas observações são, por si só não consegue explicar a natureza da modificação observada. Por estas razões, uma vez que o polipéptido é isolado e identificado por espectrometria de massa, a utilização de mini-2DE permite confirmar precisamente 1) A identidade da proteína isolada e 2) a natureza da diferença: a mudança no nível isovariant / isoforma expressão, modificações pós-traducionais e os processos de clivagem, por exemplo. No entanto, é necessário o desenvolvimento de um tampão de lise a partir tanto compatíveis com o 2D-DIGE e com mini-2DE, a fim de limitar as dispersões potenciais resultantes da utilização de protocolos de extracção que são muito diferentes.

No presente artigo, desdescrito um protocolo adaptado para a preparação, extracção e desempenho de 2D-DIGE e técnicas de mini-2DE de proteínas cerebrais provenientes de tecido humano e de rato.

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Protocol

1. Homogeneização e extração de proteínas de tecido do cérebro humano e do rato

  1. Homogeneização do tecido cerebral. Homogeneizar o tecido cerebral de 10% (w / v) em 8 M de ureia, 2 M tioureia e 1% w / v de tampão de SDS (UTS) com um vidro Potter (para amostras humanas) ou Teflon homogeneizador (para as amostras de ratos). Sonicate a 60 Hz 30 pulsos com um gerador de ultra-som de aplicar 0,5 seg para a desintegração do tecido total de 13, 14.
    1. Determinar a concentração de proteína, com ensaio de Bradford, utilizando BSA como padrão. Este tampão de extracção de UTS é totalmente compatível com uma dimensão de SDS-PAGE, enquanto lisados ​​não são sobre-aquecido para evitar a carbamilação 15.
    2. Adicionar 1% (w / v) de Amberlite e incubar com agitação suave durante 10 minutos à temperatura ambiente. A partir de então filtrar para 0,22 filtros de seringa e, finalmente, adicionar a SDS para a solução de uréia / tiouréia. Este passo reduz a quantidade de ácido úrico e ácido isociânico, que estão em equilibrio com uréia em solução e facilitar a sua degradação.
  2. A precipitação da proteína de clorofórmio / metanol. Precipitar entre 100-150 mg de proteína para 11 centímetros Tiras IPG e 1-1,5 mg para 18 centímetros queridos (independentemente da faixa de pH selecionado para realizar o IEF).
    1. Realize todos os passos no gelo ou a 4 ° C. Clorofórmio fresco e metanol a 4 ° C durante 30 min antes de iniciar o procedimento de precipitação.
    2. Adicionar três volumes de metanol e um volume de clorofórmio para um volume de UTS lisado. Agite manualmente a mistura e adicione três volumes de água fria. Vortex durante 1 min e sedimentar as proteínas por centrifugação a 12.000 xg durante 30 min a 4 ° C.
    3. Descartar o sobrenadante utilizando uma pipeta de Pasteur e adicionar três volumes de MeOH frio. Vortex novamente e centrifugar a 12000 xg durante 30 min a 4 ° C. Finalmente descartar o sobrenadante e secar o sedimento sob N 2.
  3. A preparação de proteínas para análise 2D.Ressuspender o sedimento seco ao proteína em 2D-tampão (8 M de ureia, 2 M tioureia, suplementado com 4% de CHAPS). Lava-se a solução com Amberlite tal como indicado acima e tentar manter a proporção de 500 mg de proteína por 200 ul de tampão para o 2D-2D DIGE. Nota: tampão 2D pode ser armazenada a -80 ° C ou mantido a 4 ° C durante uma semana (para evitar a degradação de ureia).
    1. Sonicar e armazenar as amostras à temperatura de -80 ° C até à realização da etapa seguinte. Notável, este protocolo pode ser usado após a solubilização ácido fórmico de proteína agrega 10. Resumidamente, evapora-se o ácido fórmico sob N2 e ressuspender o sedimento como descrito.

2. 2D DIGE

  1. As amostras de teste de qualidade. Amostras de dose novamente usando método de Bradford. Dilui-se 15 ug de proteínas no tampão de amostra LDS, aquece-se a 37 ° C e 15 carregar em 4-12% de gel de poliacrilamida.
  2. Coloração com Coomassie. Mancha de gel de poliacrilamida com 0,1% (w / v) de CoomassieBlue G-250, 50% de EtOH e 10% (v / v) de solução de ácido acético durante pelo menos 1 hr. Vamos fundo Destain durante a noite em 7% de ácido acético e 10% (v / v) da solução de etanol.
  3. Rotulagem pré-eletroforética das amostras. Antes de realizar marcação com corante de cianina, verificar o pH da amostra, o qual deve ser de base ou mesmo neutro uma vez que a substituição de N-hidroxissuccinimida é mais eficiente a pH básico e dado que a duração óptima a pH 8,6.
    1. Rotular minimamente as duas amostras de estudo com corantes Cy3 ou Cy5 fluorescentes, com uma razão de 50 ug protein/400 corante pmol e manter durante 1 hora a 4 ° C na escuridão para facilitar o grupo éster reactivo NHS dos cianinas com a amina não protonada grupos de lisinas.
    2. Reduzir variações de amostra fazendo uma rotulagem cruz com Cy3 e Cy5 corantes, evitando um acoplamento preferencial de uma amostra para uma cyanine particular. Note-se que a marcação mínima cianina-corante pode ser adaptado para a pequena quantidade de proteínas em manter a proporção de 1 ug protein por 8 pmol cyanine-dye. Se assim for, o sistema de mini-2DE pode ser usado em vez de um grande sistema de gel 2D. Isto irá permitir a análise 2D-DIGE por uma pequena quantidade de tecido cerebral.
    3. Rotular um conjunto de ambas as amostras com a mesma quantidade de proteína (50 ug no total) com o corante fluorescente Cy2 e usado como padrão interno. Use as mesmas condições, como indicado anteriormente.
    4. Completar até um volume total de 350 ul com tampão de 2D que contém 1,1% de reagente de Destreak, 1,2% de tampão de IPG e vestígios de Azul de Bromofenol o total de 150 ug de proteínas marcadas (50 ug de Cy2, 50 ug de Cy3 e 50 ug de Cy2). Execute esta etapa em quadruplicado utilizando quatro faixas independentes. Além disso, preparar duas tiras não-rotulados adicionais (um para cada amostra) com 350-450 mg de proteína para os geles de preparação.
    5. Deixe as seis faixas carregadas durante a noite coberto com óleo mineral para reidratação passiva.
  4. Isoelectrofocusing. Realizar o IEF a 206; C. Para um pH de 3 11NL, 18 cm de tira do protocolo é: configuração máxima atual é 50 mA / faixa durante 8 etapas: 1) 150 V etapa por 1 hora, 2) 200 V etapa, durante 5 horas, 3) 500 V gradiente para 2 horas, 4) gradiente 1.000 V para 2 horas, 5) 2.000 V gradiente de 2 horas, 6) 4.000 V gradiente de 2 horas, 7) 8.000 V gradiente de 2 horas e 8) para um total de 24.000 V · passo hr . Depois de IEF, despachar o excesso de óleo mineral utilizando papel de cromatografia e armazenar as tiras a -20 ° C até que a segunda dimensão.
  5. IPG Tiras equilíbrio. Equilibrar as tiras em 6 M de ureia, 2% de SDS, 30% glicerol, 50 mM Tris-HCl pH 8,6, tampão com 1% de DTT, durante 15 min e depois com 4,7% de iodoacetamida no mesmo tampão mas sem DTT.
  6. A segunda dimensão ou eletroforese SDS-PAGE. Adicione os seis géis de 12% SDS-PAGE (1,5 M Tris-HCl pH 8,6, 12% de acrilamida / bis-acrilamida, 0,1% (w / v) de SDS, 0,072% (w / v) de APS e 0,1% (v / v) TEMED ), ao mesmo tempo, utilizando um grande sistema 2D, com quatro placas de vidro de baixa fluorescência para o strips com amostras de fluorescência e outras duas placas de vidro com 1,5 mm de espessura para géis de preparação, a fim de extirpar os spots de proteínas.
    1. Carregar os seis tiras de IPG no topo dos géis e mais camadas com 0,5% (w / v) de agarose. O tampão de corrida é composto de Tris 25 mM, glicina 192 mM e 0,1% (w / v) de SDS. Efectuar a migração de 2,5 W / gel durante a noite com um sistema de refrigeração definida para 4 ° C 16,17.
  7. Aquisição e análise de imagens de fluorescência. Use um scanner Typhoon 9400 para obter as imagens géis de fluorescência (12 imagens para um experimento). Digitalização Cy2, imagens Cy3 e Cy5 para cada gel em 488/520 nm, 532/580 nm e 630/670 nm de excitação / emissão de comprimentos de onda, respectivamente. Use um software de informática para analisar as imagens. Os dados são representativos das alterações do volume de ponto associadas com a distribuição do sinal de entre os quatro géis entre as duas amostras estudadas.
  8. Coloração Coomassie para grandes géis. Corrigir os géis de preparação em 50% (v / v) de EtOH e 3% (v / v) de solução de ácido fosfórico durante pelo menos 24 horas. Em seguida, depois, lavar duas vezes com água ultra-pura, durante 20 min. Realizar coloração em 34% (v / v) de MeOH, 17% (w / v) de sulfato de amónio e 2% de ácido ortofosfórico durante 1 h antes da adição de 0,1% (w / v) de Coomassie Blue G-250. Mantenha os géis na coloração por pelo menos 48 horas e descorados em água ultra-pura.
    1. Spots para a identificação de MS. Uma vez que imagens de fluorescência são analisados, o software fornece uma lista de pontos cuja expressão é estatisticamente diferente. Excisar manualmente essas manchas de geles preparativos. Este procedimento requer a prática e alguns destreza manual, a fim de evitar a contaminação da queratina. Em seguida, as amostras podem ser mantidas em água à temperatura de -20 ° C até que o envio para o MS. Identificação Spot é perfeitamente compatível com a espectrometria de massa em tandem (MS / MS) e da relevância das identidades de proteína é julgado de acordo com a pontuação baseada Mowse calculado com um valor-p de 0,05 (p <0,05) 18 probabilidade.
    2. </ Ol>

    3. Qualitativa ensaio Mini-2DE

    1. Ressuspender máximo de 100 ug de proteína em tampão de amostra 2D, até um volume final de 200 ul de uma tira de IPG 11 centímetros. No caso do sistema de sobre-expressão ou a proteína purificada, a quantidade de partida pode ser reduzido para 20 mg.
    2. Adicionar 1,1% (v / v) de reagente Destreak, 0,55% (v / v) de tampão de IPG e vestígios de azul de bromofenol para um volume final de 200 ul. Então, vortex, fazer um giro rápido e carregar em uma tira de IPG para reidratação passiva (para trazer a tira a sua espessura original) durante a noite coberto com óleo mineral. Nota: a proporção de tampão de IPG é a mesma para todos o intervalo de pH desejado (pH 3-11, 4-7, 7-11, etc), mas a sua composição varia em função da gama de pH seleccionada.
    3. Isoelectrofocalisation. Realizar IEF a 20 ° C. A duração do programa depende do intervalo de pH seleccionado. Notável, parâmetros como electroendosmosis pode perturbar o perfil IEF e, nestes casos,optimização em tempo electrofocalisation é necessário 19. Nota: não é necessariamente um IEF já que proporciona melhores resultados, mas a diminuição do tempo de IEF pode também melhorar a resolução. Depois de IEF, as tiras de IPG pode ser armazenada a -20 ° C, durante meses.
    4. IPG tiras equilíbrio. Equilibrar as tiras num tampão contendo 25 mM Tris-HCl pH 6,8, DTT 20 mM, 10% glicerol, 5% de SDS, 0,05% de azul de bromofenol. Adicione três banha equilíbrio durante 15 minutos com a solução tampão de mudança entre cada banho.
    5. SDS-PAGE. A camada de tira de IPG num gel pré-moldado (IPG um poço, 11 centímetros tira de IPG) com uma percentagem de poliacrilamida escolhido dependendo do MW da proteína de interesse. Em seguida, seque o gel para uma membrana de nitrocelulose / PVDF de 100 mV durante 33 min.
    6. Incubar durante a noite com o anticorpo necessário e visualizar pela atividade da peroxidase. Realize os alinhamentos de immunoblots usando polipeptídeos não relacionados revelados pelo anticorpo secundário. Chegar a um semi-quantitative análise por densitometria do volume e intensidade para os vestígios / manchas com software ImageJ.

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Representative Results

Proteômica no tecido cerebral continua sendo um desafio uma vez que não existe tampão ideal para recuperar 100% de proteínas, as proteínas do citoesqueleto, especialmente associada membrana ou. O primeiro conjunto de experimentos foram focados na busca de um tampão de lise adequado compatível com as duas abordagens e que permite recuperar um grande painel de proteína. Assim, três tampões de lise foram ensaiadas para determinar o mais adequado. Em primeiro lugar, utilizou-se o tampão de biologia molecular e bioquímica comum de Tris-HCl 20 mM a 10 com 1% (w / v) de SDS (Figura 1A). Além disso, Tris-HCl tem uma aplicação robusta como um tampão de electroforese de poliacrilamida e agarose gels. Os outros dois tampões de lise foram UTS (Figura 1B) e a uma 2DE. Tris-SDS produzir uma baixa resolução e o número de manchas foram consideravelmente reduzido (Figura 1B), em comparação com o perfil observado com UTS, onde um ponto de separação elevada, sem distorção e uma far uma melhor recuperação das proteínas foi observada (Figura 1B). Este ponto é apoiada pelo fato de que UTS rendimentos de extração quase nenhum sedimento residual, enquanto Tris-HCl deve um um grosso após banco centrifugação. O padrão mostrado na Figura 1B apresenta claramente a evidência de que a solubilidade da proteína mais elevada em relação a UTS outros tampões, tais como Tris-HCl. Notheworthy que mesmo tampão 2DE também foi testada, a sua utilização foi descartada já que, apesar de pellet foi nem observado, lipídios não foram dissolvidos e permaneceram na camada superior dificultando a manipulação. De acordo com estes dados, é recomendável a utilização de tampão de UTS para várias razões: 1) o agente caotrópico neutro que desnatura as proteínas por perturbar nonconvalent ligações iônicas e entre os resíduos de aminoácidos e evitar a actividade de proteases que degradam proteínas celulares 21 2) Adição da tioureia para a solução de ureia aumenta drasticamente a solubilidade de proteínas de membrana hidrófobase proteínas sujeitas a agregado 22, 23, e 3) a adjunção de detergente aniónico SDS quebra lípidos ligarem a proteínas por meio de interacções hidrofóbicas, bem como aumenta a actividade de protease e fosfatase inibição 24,25. Além disso, decidiu-se adicionar uma etapa de precipitação para eliminar impureties que podem perturbar o IEF. Desta forma, como método de precipitação determina a solubilidade das proteínas 26 e metanol já foi descrito como o solvente mais apropriado para remover os lípidos que são abundantes no tecido cerebral, que nos levou a escolher a precipitação de clorofórmio / metanol 27. A utilização dos detergentes zwitteriónicos CHAPS (3 - [(3-colamidopropil) dimetilamónio]-1-sulfonato de propano) para ressuspender as proteínas granulação no tampão 2D é devido à sua aptidão para facilitar a entrada da proteína no primeiro passo de dimensão 28.

O perfil do pr cérebro humano e ratinhosoteome por 2D-DIGE é mostrado nas Figuras 2A e 2B, respectivamente. Na Figura 2A fundiu imagens fluorescentes provenientes do controlo humano e amostras de córtex AD pode ser observado, na figura 2B idem para amostras de ratos a partir de hipocampo de um modelo de AD-29 como patologia tau. Cy2, Cy3 e Cy5 são, respectivamente, ilustrada para as amostras humanas em Figuras 2C-2E. Ambos os padrões de fundidos (Figura 2A e 2B) apresentam uma elevada resolução de ponto reflectindo um IEF de alta qualidade e a segunda dimensão de separação de acordo com o perfil observado na Figura 1B. Esta qualidade de definição local, juntamente com o facto de que a reticulação é executada, a fim de eliminar uma eventual preferência das proteínas para uma cianina em particular, fazer estas imagens de fluorescência (Figura 2C-2E) muito fácil para alinhar todo o software de análise. Além disso, os géis preparativos corados com azul de Coevidência omassie um mapa enriquecido com manchas abundantes em todo o intervalo de pH utilizados, permitindo um para extirpar os pontos após a análise de software e para a sua posterior identificação por MS / MS.

O mini análise qualitativa 2DE por imunotransferência de proteína fornece informação de elevado valor para a sua identificação e modificações, não só para os pós-tradução, mas também por oligómeros e truncagens (Figuras 3A e 3B). A viabilidade de executar esta técnica em mini-2DE fornece dados rápidos e precisos sobre a proteína de interesse. Quanto tecido de um paciente afectado pela Demência do Corpo de Lewy (LBD), a caracterização da alfa-sinucleína permite visualizar um perfil de pH de 4-7 bem definida, em que a proteína nativa é de um pi de 4,67 e um peso molecular de 18 kDa, no entanto, com a mini-2DE pode ser visto mais a presença de dímeros (Figura 3A, asterisco) ao mesmo pi do que as formas nativas, mas também a existência de Ubiquitinated formas que são mais básicos e com um peso molecular superior quando eles são mais ubiquitinated (Figura 3A, setas). Outra proteína intimamente ligada a AD é o peptídeo beta-amilóide, gerado pelo catabolismo complexo da proteína precursora de amilóide (APP). Na Figura 3B é comparado o enredo de um caso esporádica com um familiar. No caso de o AD familiarizados pode ser observado como beta-amilóide 1-42 é diminuída relativamente ao AD esporádica, e, além disso, os isovariants amilóide-beta x-42 (4 kDa) são também regulada em todo o intervalo Enquanto isso os oligómeros encontrados em 8 kDa reflectem que este facto não é devido a uma quantidade inferior da proteína, uma vez que os pontos de intensidade é mais relevante no AD familiares (Figura 3B).

Figura 1
Figura 1: 2DE proFile depois 10 mM de Tris a 1% de SDS a extracção tampão w / v (A) e o padrão obtido após a utilização do UTS (B). No painel B pode ser visto como o número de pontos, a intensidade ea resolução é muito mais elevado do que aquele do painel (A). O uso de UTS permite uma extração de proteínas quase total que se reflete na coloração 2DE Coomassie. Clique aqui para ver imagem ampliada.

Figura 2
Figura 2: Perfis de 2D para DIGE humana (A) e de ratos (B) são ilustrados imagens (A) e (B) representa as imagens fundidas para as três cianinas em um intervalo de 18 cm tira pH 3-11.. Nas imagens (C), (D) e (<strong> E) cianinas são expostos de forma independente (Cy2 em azul, Cy3 em verde e Cy5 em vermelho). Clique aqui para ver imagem ampliada.

Figura 3
Figura 3: No painel superior, pode ser observado o perfil de mini-2DE da proteína alfa sinucleína num paciente LBD O pi nativa (4,4) e as alterações MW (18 kDa) em função da dimerização (asterisco), onde o MW. é o dobro, e ubiquitinação que desloca o pI até um mais básico (setas) (A). O quadro abaixo mostra o perfil de um anticorpo de péptido beta-amilóide em um caso esporádico e genética de AD. Padrão 2DE mostrar como oligomerização e degradação ocorrem de forma diferente de acordo com a etiologia da disease. Este immunoblot aponta claramente as diferenças no catabolismo APP entre as duas condições. Por um lado, existe um aumento dos produtos do catabolismo no no esporádica respeito a um familiar (setas), enquanto que os oligómeros parece ser menos acentuada (B). Estas experiências foram realizadas em tiras de 11 centímetros em um intervalo de pH de 4-7, em gel de 12% de Bis-Tris e em 16,5% de Tris-Tricina, respectivamente um (A, B). clique aqui para ampliar.

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Discussion

Descobrindo as mudanças de expressão de proteínas patológicas, busca de biomarcadores ea modulação de vias potenciais para alvos farmacológicos estão entre os objectivos dos neuroproteomics aproxima 30. Entre as ferramentas emergentes, o campo 2DE adiciona uma expectativa promissora. No entanto, um consenso deve ser atingido de modo a minimizar a variabilidade e aumentar a reprodutibilidade dos experimentos. Na linha de esta ideia de um protocolo padronizado para realizar 2D-DIGE (Figura 2) e a subsequente imunoblot 2DE (Figura 3) para o tecido do cérebro humano e ratinhos totalmente compatível com imunotransferência mono-dimensional é aqui descrito em pormenor.

Um dos maiores dilemas da proteômica é a escolha tampão de solubilização. A fim de aumentar a reprodutibilidade entre os diferentes abordagens, UTS foi escolhida uma vez que é completamente compatível com a IEF. Além disso, o tampão de extracção UTS não produz Pellet ou um muito ligeiro, uma após a centrifugação a 12.000 xg (não confundir com a precipitação de SDS a 4 ° C). Este é um ponto fundamental tendo em conta que a agregação de muitas doenças neurodegenerativas presentes proteínas, incluindo o AD. O facto de não existir nenhum sedimento simplifica o desempenho e a interpretação dos dados, uma vez que não há estudos independentes deve ser feito para a fracção solúvel e insolúvel.

Seja qual for 2D DIGE ou mini-2D abordagens vão ser realizadas, existem algumas limitações que devem ser indicados. Em primeiro lugar, as propriedades químicas do tampão UTS, esta solução não deve ser sobreaquecido, ou carbamilação ocorre sobre as aminas primárias e, portanto, pode interferir tanto com acoplamento de corante de cianina e perfil 2D, piora resolução pontos, ao alterar o IEF 15. Em segundo lugar, as gamas de pH disponíveis, hoje em dia o intervalo de pH mais amplo é entre 3 a 11, juntou-se a este factor a probabilidade de que nem todas as proteínas de entrada sobre a tira de IPG pode explain as proteínas bandas empilhadas em ambos os lados dos géis após a coloração. Essa limitação pode explicar por que não todo o proteoma pode ser estudado por 2D. Outra limitação importante é a utilização de controvérsia a precipitação. Por um lado, é altamente recomendável fazer a etapa de precipitação com clorofórmio / metanol, que permite reduzir de forma eficiente o conteúdo lipídico 27, sais, ácidos nucléicos e detergentes carregadas que possam interferir com os parâmetros do IEF e impactar a resolução e / ou reprodutibilidade 2D. Além disso, por outro lado, não se pode excluir que algumas proteínas fortemente ligadas à membrana pode ser perdido. No entanto, no caso em que outros tampões de extracção são usados ​​em vez de UTS, com ou sem a adição de proteases ou inibidores de fosfatases, o uso do passo de precipitação é altamente recomendada para as armadilhas durante IEF. Por fim, vale ressaltar que a análise de imagens 2D DIGE apresenta o inconveniente que se sobrepunham fluorescênciamanchas podem levar a uma perda de informação, uma vez que a análise de software não considera isso como uma variação significativa.

A novidade deste processo reside na sua combinado reprodutibilidade, versatilidade e caracterização de proteínas. Apenas um tampão de extracção permite realizar duas técnicas complementares. 2D-DIGE fornece informações quantitativas sobre as mudanças de expressão de proteínas e sua posterior identificação por MS / MS. No entanto, é possível que as isoformas, isovariants, zimogénios, modificações pós-traducionais e produtos catabólicos não podia ser identificada desde a fluorescência sobreposta com outras proteínas. Para superar essa limitação é proposto em paralelo ao uso de mini-2DE. Na verdade, a nosso conhecimento um dos armadilha mais importante que pode ser cometido é levar o immunoblotting mono-dimensional como uma validação completa dos resultados 2D DIGE, ou até mesmo a considerar que qualquer modificação proteômica não é necessário para validar. Furthermore, vantagens técnicas da mini-2DE são: 1) a viabilidade do uso de sistemas de SDS-PAGE pequenas, 2) a relativamente baixa de material necessário, 3) as grandes faixas de pH disponíveis, 4) a sensibilidade immunoblot e 5) a estimativa fácil do mudanças. Os aspectos mais agitado dos técnica mini-2DE é a quantificação, apesar de mini-2DE não pode ser considerada uma abordagem quantitativa, depois de manchas ou parcelas de alinhamento, é possível estabelecer uma relação entre a parte ácida e básica, ou vice-versa, fornecendo desta forma uma fiável estimativa das alterações observadas 9.

Vários dados da literatura a utilização exacta de mini-2DE para realizar a caracterização da proteína, tais como as proteínas sobre-expressas com e sem a modificação pós-tradução 31, oligomerização e degradação vias descritas para a demência com corpos de Lewy e 32-33 na Figura 3A para uma AD paciente. Outro exemplo das informações fornecidas por m ini 2DE é o truncamento de espécies de amilóide beta e realizados em casos de DA não-dementes como um alvo potencial para abordagem de vacinação 34. A presença de oligómeros e sua degradação diferencial também é mostrado na Figura 3B, dependendo de um paciente com DA esporádica ou familiar. Além disso, a abordagem de mini 2DE abre uma ampla e prático janela de possibilidades desde tratamentos diferentes pode ser realizada. Por exemplo, no campo da AD, inibidores de fosfatase podem ser adicionados e descobrir o seu impacto na fosforilação tau. Além disso, o efeito farmacológico drogas em vias de proteólise, uma vez que o pi e identificação MW das formas truncadas podem proporcionar o local de clivagem de acordo com o epitopo do anticorpo 34. Curiosamente, os dados recentes elucidaram usando mini-2DE a associação de estilo de vida e tratamentos medicamentosos com deficiências cognitivas em modelos de ratos, bem como o perfil bioquímico de uma nova mutação Tau 35-37.

ntent "> O desenvolvimento de um método que permite a 2D-DIGE de tecido cerebral obter de origem humana ou rato, bem como a validação usando mini-2DE trás, pode lançar luz para descobrir novos alvos e biomarcadores para o estudo de doenças neurológicas farmacológicas. O fato de que esses transtornos têm a sua origem no cérebro, obrigar a estudar este órgão como fonte de informação ideal. Entretanto, amostras humanas são limitadas, por isso, o uso de modelos animais torna-se indispensável para atingir esse objetivo. Aqui a importância da utilização de abordagens em paralelamente para ambos os tipos de amostras e validar os resultados. É desejável que, num futuro próximo candidatos fiáveis ​​será encontrado e testado em fluidos corporais tais como o plasma e fluido cerebrospinal, a fim de estabelecer um diagnóstico precoce, na avaliação da progressão da doença e, eventualmente a avaliação dos tratamentos disponíveis plausíveis.

As etapas críticas no âmbito do protocolo deve ser levado em conta para a sua suitabaplicação le. No caso de 2D DIGE, a qualidade do teste de amostras é um ponto crucial. Este teste permite conhecer o perfil de proteínas e validar a quantidade real de proteínas extrato existente no buffer 2D após a precipitação. Perfis manchados nos dar informações sobre a qualidade e homogeneidade entre as amostras. Somente amostras com padrões similares devem ser utilizados para estudos 2D DIGE, caso contrário o 2D DIGE pode levar a coloração fraca e baixa resolução de perfil protéico. As diferenças nestas amostras padrões são mais comuns em humanos do que no tecido cerebral do rato, uma vez que amostras de cérebro humano para lidar com a pesquisa muitos inconveniente 38,39. Além disso, a identificação da proteína, devido à degradação do intervalo post mortem já foi relatada por 2D-DIGE 40,41. A verificação do pH antes da rotulagem corante cyanine, esta etapa deve comprometer todo procedimento posterior. Rotulagem corante Cyanine e eletroforese SDS-PAGE deve ser feito na escuridão comotanto quanto possível, de modo que não interfere com a rotulagem de fluorescência. Finalmente, géis de poliacrilamida deve ser tão homogénea quanto possível, entre eles, a fim de eliminar a variabilidade inter-durante a migração electroforética e para facilitar padrões se sobrepõem e posterior análise 42,43.

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Disclosures

Autores têm nenhum conflito de interesses a declarar.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pelo Inserm, da Universidade de Lille 2, MEDIALZ, Labex (laboratório de excelência, programa investir para o futuro) e DISTALZ (desenvolvimento de estratégias inovadoras para uma abordagem transdisciplinar para a doença de Alzheimer). FJ.FG é atualmente uma bolsa destinatário da ANR (Agência Nacional de Pesquisa Francês / NeuroSplice de Tau Projet ANR-2010-BLAN-1114 01), mas este trabalho foi também com o apoio de uma bolsa da JCCM (Espanha).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CyDye DIGE FLUOR MIN KIT 5 nmol 1 * 5 Nmo GE Healtcare 25-8010-65
Immobiline DryStrip GE Healtcare Reference in function of the pH interval/size
IPG Buffer, pH X-X GE Healtcare Reference in function of the pH interval desired
AMBERLITE IRN-150L MIXED BED RESIN 1  GE Healtcare 551797N
DRYSTRIP COVER FLUID IMMOBILINE 1 * 1 l GE Healtcare 17-1335-01
KIT BOX IPG 1 * 1 KIT GE Healtcare 28-9334-92 Plastic box to make the passive rehydration 
MILLEX GS Filter Millipore SLGS033SB
Criterion XT Precast Gels 13.3 x 8.7 cm (W x L) Bio-Rad Reference in function of the MW to separate
IPGphor III Isoelectric Focusing Unit GE Healtcare 11-0033-64
Ettan DALTsix Large Electrophoresis System GE Healtcare 80-6485-08
OneTouch 2D Gel SpotPicker 1.5 mm  Gel Company P2D1.5

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Tecido Neurociência Edição 86 proteômica neurodegeneração 2DE ratos eo cérebro humano fluorescência immunoblotting. 2D-DIGE (eletroforese bidimensional em gel diferença de fluorescência) mini-2DE (mini immunoblotting 2DE) IPG (imobilizadas gradientes de pH) IEF (isoelectrofocusing) AD (doença de Alzheimer )
Proteína Consenso Brain-derivada, protocolo de extração para o Estudo do cérebro humano e murino Proteome Usando ambas 2D DIGE e Mini 2DE Immunoblotting
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Fernandez-Gomez, F. J., Jumeau, F.,More

Fernandez-Gomez, F. J., Jumeau, F., Derisbourg, M., Burnouf, S., Tran, H., Eddarkaoui, S., Obriot, H., Dutoit-Lefevre, V., Deramecourt, V., Mitchell, V., Lefranc, D., Hamdane, M., Blum, D., Buée, L., Buée-Scherrer, V., Sergeant, N. Consensus Brain-derived Protein, Extraction Protocol for the Study of Human and Murine Brain Proteome Using Both 2D-DIGE and Mini 2DE Immunoblotting. J. Vis. Exp. (86), e51339, doi:10.3791/51339 (2014).

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