Summary
Протокол добыча общего белка с использованием мочевины / тиомочевины / SDS буфера для человека и мышей мозговой ткани позволяет Идентификация белков по 2D-Dige и их последующей характеристики по мини 2DE иммуноблоттинга. Этот метод позволяет получить более воспроизводимые и надежные результаты от человека биопсии и экспериментальных моделей.
Abstract
Электрофорез Двумерная гель (2DE) является мощным инструментом, чтобы раскрыть Proteome изменения потенциально связанные с различными физиологическими или патологическими состояниями. В основном, этот метод основан на разделении белков в соответствии с их изоэлектрической точке на первой стадии, а во-вторых в соответствии с их молекул рной массы методом SDS электрофореза в полиакриламидном геле (SDS-PAGE). В этом докладе оптимизирован протокол пробоподготовки для небольшого количества человеческой посмертного и мышь мозговой ткани описывается. Этот метод позволяет выполнять как двумерный электрофорез разница флуоресценции геля (2D-Dige) и мини-2DE иммуноблоттинга. Сочетание этих подходов позволяет не только найти новые белки и / или модификации белка в их экспрессии, благодаря его совместимости с массовой обнаружения спектрометрии, но и новый взгляд на проверки маркеров. Таким образом, мини-2DE сочетании с западными блоттинга разрешений для идентификации и проверки постЦионные модификации, белки катаболизм и обеспечивает качественное сравнение между различными условий и / или лечения. В данном случае мы предлагаем способ для изучения компонентов белковых агрегатов, найденные в БА и деменцию с тельцами Леви, такие как бета-амилоида пептида и альфа-синуклеина. Наш способ может быть адаптирован таким образом, для анализа протеома и нерастворимые белки извлечь из мозговой ткани и мышей моделей человека слишком. Параллельно, он может дать полезную информацию для изучения молекулярных и клеточных путей, участвующих в нейродегенеративных заболеваний, а также потенциальных биомаркеров новых и терапевтических целей.
Introduction
Психические и неврологические расстройства составляют 13% от глобального бремени болезней, новые проблемы как патофизиологических механизмов, факторов риска и продромальными биомаркеров должны быть изучены 1. В соответствии с этой целью, протеомики исследования человеческого мозга стали незаменимыми, чтобы раскрыть молекулярные пути, участвующие в таких процессах, как память, поведение, эмоции и нейронной пластичности, например, не только для физиологического, но и для патологических состояний. Таким образом, использование животных моделей и, в частности трансгенные мыши, приносит широкий спектр возможностей, чтобы имитировать этиологии нейродегенеративных расстройств человека 2.
Протеомики подходы в настоящее время доступны для того, чтобы выполнить эти новые перспективы в области неврологии. Двухмерным электрофорезом в геле (2DE) является мощным и, вероятно, простой метод, который позволяет сравнивать протеом широкого круга образцов. Кроме того, это такжемощный метод для выделения белка из сложной смеси с целью выявления и дальнейшего анализа методом масс-спектрометрии. Этот метод по существу состоит в две последовательные стадии: 1) разделения белков в зависимости от их изоэлектрической точки (PI) по изоэлектрофокусирование (IEF). Точнее, электрический потенциал создают на акриламидных полос immobiline среди градиентом рН, а затем белки будут мигрировать и сосредоточиться на определенной интерфейса в зависимости от их глобальной сети бесплатно. 2) изоэлектрически ориентированные белки денатурируют и отрицательно заряженные добавлением додецилсульфата натрия (SDS), в результате чего белки в их первой структуры разделены в зависимости от их кажущейся молекулярной массой (Mw) в ДСН-ПААГ 3. Эти два различных свойства позволяют нам решать двойное значение пойти дальше в изучении протеома. С одной стороны, этот подход дает возможность выполнить количественный анализ с использованием метода минимальные красители 2D-Dige, а с другой стороны КАЧЕСТВЕННЫХэ анализ мини-2DE соединен с вестерн-блоттинга.
Количественный анализ по 2D-Dige дарует экспрессии белка меняется во всем образца протеома. Вкратце, пробы помечены трех цианинов (CY2, Cy3 и Cy5), излучающих на трех различных длин волн (синий, зеленый и красный). Эти минимальные Fluor красители, содержащие N-гидрокси группу сукцинимидил эфира реагирует с ε-аминогруппой лизина остатков белков в результате чего ковалентных амидных связей 4. Остатков лизина помечены только между 1-3% и таким образом предотвращая несколько ярлыков дополнительно за белка и серьезные изменения суммарного заряда 5, 6. Су3 и Су5 часто используется для обозначения двух независимых выборок в то время как Су2 теги сочетание равной пропорции образцов для сравнения. Два основных преимущества, что все меченые образцы смешиваются и МЭФ и SDS-PAGE осуществляются в одном геле сразу для каждого шага, избегая среди вариабельность экспериментов из-за Гели сравнение. Кроме того, он представляет высокий порог обнаружения составляет около 1 femtomole белка 7. Гели сканируются и 2D программное обеспечение сравнивает 2D флуоресцентные изображения гель, где Cy2 служит в качестве внутреннего стандарта, позволяющего для идентификации статистических различий между местами для их идентификации задней методом масс-спектрометрии. Программное обеспечение 2D анализ с использованием внутреннего стандарта достигает быстрое обнаружение менее 10% различий между образцами с более чем 95% от статистической достоверности 8.
Качественный анализ по мини-2DE является важным шагом для белка характеристики. Принцип такой же, как было описано ранее для пи и разделения МВт, но в этом случае белки передаются из небольшого полиакриламидном геле с мембраной и иммуноблоттинга выполняется после этого. В то время как один электрофорез измерение гель обеспечивает изменения в экспрессии белка для одного или нескольких белковых эпитопов в зависимости от антитела, в ИНФОРМАЦИЯн мини-2DE наделяет двух дополнительных параметров. Во-первых, белковые isovariants изменяться в зависимости от ПИ, указывая, что посттрансляционные модификации может иметь место. Во-вторых, масса спектрометрия идентификация может свидетельствовать о возможных зимогенов и катаболических продуктов белков. Таким образом, изменения, наблюдаемые 2D-Dige, скорее всего, свидетельствует о механизмах, лежащих в основе изменений в глобальной профиль протеома. Трассы из иммуноблотах среди нескольких образцов за тот же белок эпитопной / с по мини-2DE может отражать кислотности изменения проливают свет на пост-трансляционных изменений немного, наблюдаемых или даже не monodimensional иммуноблотинга 9, 10. Кроме того, этот анализ информирует о потенциальных сайтов расщепления из-за ведома ИП и МВт метаболических остатков 11,12.
Сочетание этих двух методов обеспечивает дополнительный анализ протеомики. С одной стороны 2D-ПГЛП дает А типэ различий, позволяющих точное выделение полипептидов, экспрессия которых отличается. Эти различия состоят в основном в появления или исчезновения пятна или увеличения / уменьшения интенсивности данной одного программным обеспечением анализа флуоресцентных гелей. Тем не менее, эти наблюдения сами по себе вряд ли объяснить природу модификации наблюдается. По этим причинам, как только полипептид выделен и идентифицирован методом масс-спектрометрии, использование мини-2DE позволяет точно подтвердить 1) личность белка, выделенного и 2) характер разницы: изменение в уровне изовариантным / изоформы Выражение, пост-трансляционные модификации и процессы расщепления например. Тем не менее, необходимо разработать начальный лизирующего буфера и совместимый с 2D-Dige и с мини-2DE того, чтобы ограничить возможные дисперсий в результате использования экстракции протоколов, которые очень различны.
В настоящей статье мы деописано адаптированный протокол для подготовки, добычи и выполнения 2D-Dige и методов мини-2DE для белков мозга, поступающих из человека и мыши ткани.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Гомогенизация и общего белка Добыча человека и мыши, ткани головного мозга
- Мозговая ткань гомогенизации. Однородный ткани головного мозга 10% (вес / объем) в 8 М мочевине, 2 М тиомочевины и 1% вес / объем SDS буфера (ОТС) с использованием Поттер стекло (для образцов человека) или гомогенизатор Teflon (для мышей образцов). Разрушать ультразвуком при 60 Гц 30 импульсов с ультразвуковым генератором, применяющие 0,5 сек для полного ткани распада 13, 14.
- Определить концентрацию белка с Бредфорда, используя BSA в качестве стандарта. Это UTS добыча буфер полностью совместим с одним размерности SDS-PAGE, пока лизаты не чрезмерно нагревается, чтобы избежать карбамилирования 15.
- Добавить 1% (вес / объем) из Amberlite и инкубировать при осторожном перемешивании в течение 10 мин при комнатной температуре. После этого фильтр на 0,22 мкм шприцев фильтров и, наконец, добавить SDS к мочевины / тиомочевины решения. Этот шаг уменьшает количество мочевой кислоты и изоциановой кислоты, которые находятся в эквилибрНМУ с мочевиной в растворе и способствовать ее деградации.
- Осаждение белка хлороформ / метанол. Осадок между 100-150 мкг белка на 11 см IPG полосы и 1-1,5 мг в течение 18 см из них (независимо от диапазона рН выбранной для выполнения МЭФ).
- Выполните все шаги на льду или при 4 ° С. Холодный хлороформа и метанола при 4 ° С в течение 30 мин перед началом процедуры осадков.
- Добавьте три объемов метанола и один объем хлороформа к одному объему ОТС лизата. Взболтать вручную смесь и добавить три объемов холодной воды. Vortex в течение 1 мин и осаждения белков центрифугированием при 12000 х г в течение 30 мин при 4 ° С.
- Жидкость над осадком сливают с помощью пипетки Пастера и добавить три объемы холодного метанола. Vortex снова и центрифуге при 12000 х г в течение 30 мин при 4 ° С. Наконец отбросить супернатант и сухой осадок под N 2.
- Подготовка белков для 2D анализа.Ресуспендируют гранул белка высушенного в 2D-буфера (8 М мочевина, 2 М тиомочевины с добавлением 4% CHAPS). Вымойте решение с Amberlite, как указано выше, и попытаться сохранить долю 500 мкг белка на 200 мкл 2D буфера для 2D-Dige. Примечание: 2D буфер можно хранить при -80 ° С или выдерживают при 4 ° С в течение одной недели (для предотвращения деградации мочевины).
- Разрушать ультразвуком и хранить образцы при -80 ° С до проведения следующий шаг. Примечательно, что этот протокол может быть использован после солюбилизации муравьиная кислота белковых агрегатов 10. Вкратце, испаряться муравьиной кислоты в атмосфере N2 и ресуспендируют осадок, как описано.
2. 2D-ПГЛП
- Образцы испытать качество. Образцы дозы еще раз, используя метод Брэдфорд. Развести 15 мкг белков в LDS буфера для образцов, нагревают при 37 ° С и 15 загружают на 4-12% полиакриламидных гелях.
- Кумасси окрашивания. Пятно полиакриламидный гель с 0,1% (вес / объем) CoomassieГолубой G-250, 50% EtOH и 10% (объем / объем) раствор уксусной кислоты по крайней мере 1 часа. Пусть фон destain в течение ночи в 7%-ной уксусной кислоты и 10% (об / об) этанола раствора.
- Pre-электрофореза маркировка образцов. Перед выполнением маркировки краситель цианиновый, проверить рН образца, который должен быть основным или даже нейтральной, так как N-гидроксисукцинимид замена более эффективным при щелочном рН и дано будет оптимальным при рН 8,6.
- Этикетка минимально два образцы исследования с Cy3 или Cy5 флуоресцентных красителей с соотношении 50 мкг protein/400 пмоль красителя и держать в течение 1 часа при 4 ° С в темноте для облегчения NHS эфир реактивную группу из цианинов с непротонированной амина группы лизинов.
- Уменьшить колебания Образец делая поперечное маркировку с Cy3 и Cy5 красителей, избегая преимущественное связывание одного образца к определенному цианин. Следует отметить, что цианин-краситель минимальный маркировка может быть адаптирован для небольшого количества белков с сохранением доли 1 мкг прotein за 8 пмоль цианинового-красителя. Если это так, система мини-2DE может быть использован вместо большого 2D системы геле. Это позволит анализ 2D-Dige для небольшого количества ткани головного мозга.
- Этикетка пул обоих образцов с тем же количеством белка (50 мкг всего) с су2 флуоресцентным красителем и использовали в качестве внутреннего стандарта. Используйте те же условия, как указано ранее.
- Полное до общего объема 350 мкл с 2D буфере, содержащем 1,1% Destreak реагент, 1,2% IPG буфера и следы бромфенолового синего всего 150 мкг меченых белков (50 мкг Cy2, 50 мкг Cy3 и 50 мкг Cy2). Выполните этот шаг в четырех помощью четырех независимых полос. Кроме того, подготовить два дополнительных не-меченых полосы (один для каждого образца) с 350-450 мкг протеина для препаративных гелей.
- Оставьте шесть груженых ленты с минерального масла на ночь для пассивного регидратации.
- Изоэлектрофокусирование. Провести МЭФ при 206; С. Для рН 3-11NL, 18 см лишить протокол является: максимальное значение тока 50 мкА / полоса в течение 8 этапов: 1) 150 В шаг в течение 1 часа, 2) 200 В шаг в течение 5 часов, 3) 500 В градиента для 2 часа, 4) 1000 V градиент в течение 2 часов, 5) 2000 V градиент в течение 2 ч, 6) 4000 V градиент в течение 2 часов, 7) V 8000 градиент в течение 2 часов и 8) в общей сложности 24000 V · ч шаг . После IEF, направить избыток минерального масла с помощью хроматографии бумагу и хранить полоски при температуре от -20 ° С до второго измерения.
- IPG полосы уравновешивание. Равновесие полосы в 6 М мочевины, 2% SDS, 30% глицерина, 50 мМ трис-HCl рН 8,6 буфере с 1% DTT в течение 15 мин и после с 4,7% иодацетамидом в том же буфере, но без DTT.
- Второе измерение или SDS-PAGE электрофореза. Выполните шесть 12% ПААГ с ДСН (1,5 М Трис-HCl рН 8,6, 12% акриламид / бис-акриламид, 0,1% (вес / объем) SDS, 0,072% (вес / объем) APS и 0,1% (объем / объем) TEMED ) одновременно с использованием большого 2D системы, с четырьмя стеклянными пластинами с низким уровнем флуоресценции для StrIпс с образцами флуоресценции и двух других стеклянных пластин с 1,5 мм толщины для препаративных гелей в целях акцизным белковые пятна.
- Загрузить шесть IPG полосы в верхней части гелей и более слоистых с 0,5% (вес / объем) из агарозы. Запуск буфер состоит из 25 мМ Трис, 192 мМ глицина и 0,1% (вес / объем) SDS. Провести миграцию на уровне 2,5 Вт / гель на ночь с системой охлаждения, установленной на 4 ° C 16,17.
- Сбор и анализ Флуоресцентные изображения. Используйте Тайфун 9400 сканер для получения изображения флуоресценции гели (12 изображений для одного эксперимента). Сканирование Су2, Cy3 и Cy5 изображения для каждого геля на 488/520 нм, 532/580 нм и возбуждении 630/670 нм / длин волн излучения, соответственно. Используйте Информатик программное обеспечение для анализа изображений. Данные являются репрезентативными для изменения объема пятна, связанных с распределением сигнала по четырем гелей среди двух исследованных образцов.
- Кумасси окрашивания для больших гелей. Закрепите препаративные гели в 50% (объем / объем) этанола и 3% (объем / объем) раствор ортофосфорной кислоты, по крайней мере 24 часов. Затем, после, дважды промывали ультрачистой водой в течение 20 мин. Выполнение окраску в 34% (объем / объем) метанола, 17% (вес / объем) сульфат аммония и 2% ортофосфорной кислоты в течение 1 часа перед добавлением 0,1% (вес / объем) Кумасси синим G-250. Держите гели по окраске, по крайней мере 48 часов и обесцвечивают в ультра чистой воды.
- Пятна для идентификации MS. После того, как флуоресцентные изображения анализируются, программное обеспечение предоставляет список мест, экспрессия которых статистически отличается. Вручную вырезать эти пятна от препаративных гелей. Эта процедура требует практики и некоторые ловкость рук, чтобы избежать кератина загрязнения. Затем образцы не могут быть сохранены в воде при температуре от -20 ° С до отправки в MS. Идентификация пятно полностью совместима с тандемной масс-спектрометрии (МС / МС) и актуальности белковых идентичностей судят в соответствии с вероятностью основе счетом Mowse рассчитывается с р-значение 0,05 (р <0,05) 18. </ Ол>
3. Качественный Анализ Мини-2DE
- Ресуспендируют максимальный 100 мкг образца белка в 2D буфера до конечного объема 200 мкл в течение 11 см IPG полосы. В случае системы повышенной экспрессией или очищенного белка, исходный объем может быть снижена до 20 мкг.
- Добавить 1,1% (V / V) Destreak реагента, 0,55% (объем / объем) IPG буфер и следы бромфенолового синего до конечного объема 200 мкл. Затем вихрь, сделать быстрый спин и загрузить в полосе IPG для пассивного регидратации (довести полосу своей первоначальной толщины) в течение ночи, покрытой минеральным маслом. Примечание: доля IPG буфера является одинаковым для всех интервале рН желаемого (рН 3-11, 4-7, 7-11 и т.д.), но его состав меняется в зависимости от диапазона рН выбранной.
- Isoelectrofocalisation. Выполните МЭФ при 20 ° С. Продолжительность программы зависит от интервала рН выбранной. Обращает на себя внимание такие параметры, как electroendosmosis может нарушить профиля IEF и в этих случаях,оптимизация во времени electrofocalisation требуется 19. Примечание: это не обязательно больше МЭФ, что обеспечивает лучшие результаты, но сократить время ИЭФ также может улучшить разрешение. После ИЭФ, IPG полосы могут храниться при температуре -20 ° С в течение нескольких месяцев.
- IPG полосы уравновешивание. Равновесие полосы в буфере, содержащем 25 мМ Трис-HCl рН 6,8, 20 мМ ДТТ, 10% глицерина, 5% ДСН, 0,05% бромфенолового синего. Сделать три уравновешивание ванны в течение 15 мин с изменением буферного раствора между каждой ванне.
- SDS-PAGE. Слой полосу IPG на сборного геля (IPG +1 хорошо 11 см IPG полосы) с процентом полиакриламид выбирают в зависимости от молекулярной массой белка, представляющего интерес. Затем промокните гель на нитроцеллюлозы / PVDF мембрану при 100 мВ в течение 33 мин.
- Выдержите в течение ночи с необходимой антитела и визуализировать на активности пероксидазы. Выполните выравнивание иммуноблотов использованием несвязанных полипептидов, выявленных в ходе вторичного антитела. Reach полу-QuantitAtive анализ с помощью денситометрии объема и интенсивности для следов / пятна с ImageJ программного обеспечения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Протеомика на ткани головного мозга остается сложной, так как существует идеального буфер не существует, чтобы восстановить 100% белков, особенно ассоциированных с мембранами или цитоскелета белки. Первый набор экспериментов были сосредоточены на поиске подходящего буфера для лизиса, совместимой с этими двумя подходами и что позволяет восстановить большую панель белка. Таким образом, три лизиса буферы были проанализированы, чтобы определить наиболее подходящую. Во-первых, он был использован общий биохимических и молекулярных биологии буфер Tris-HCl 20 на 10 мм с 1% (вес / объем) SDS (рис. 1А). Кроме того, Трис-HCl имеет надежную применение в качестве буфера для электрофореза для полиакриламида и агарозном геле. Два других лизиса буферы были ОТС (рис. 1b) и один 2DE. Трис-SDS дают плохое разрешение и число пятен было значительно снижено (рис. 1b) по сравнению с профилем, наблюдаемым при ОТС, где высокая разделения пятно, отсутствие искажение и фаг лучше восстанавливается белков наблюдались (рис. 1В). Эта точка подтверждается тем фактом, что ОТС экстракции урожайности почти не остаточный окатышей, в то время как трис-HCl обязан толстый один за скамейке центрифугированием. Образец показал на фиг.1В четко свидетельствует о более высокой растворимости белка в ОТС в отношении других буферах, таких как трис-HCl. Notheworthy, что даже 2DE буфер был также испытан, его использование было исключено, так как несмотря на гранулы не было ни наблюдали, липиды не раствор и они оставались в верхнем слое difficulting манипуляции. В соответствии с этими данными, рекомендуется использование ОТС буфера по нескольким причинам: 1) его нейтрально хаотропа что денатурирует белки, нарушая nonconvalent и ионные связи между аминокислотных остатков и избежать активность протеаз, которые разрушают клеточные белки 21 2) сложение тиомочевины в растворе мочевины повышает растворимость резко гидрофобных мембранных белкови белки, склонные к совокупной 22, 23 и 3) присоединение из анионного детергента SDS ломает липиды белки связываются с помощью гидрофобных взаимодействий, а также увеличивает протеазы и ингибирование активности фосфатазы 24,25. Кроме того, было решено добавить осадков шаг для устранения impureties, которые могут нарушить МЭФ. Таким образом, как метод осадки определяет растворимость белков 26 и метанол уже было описано как наиболее подходящем растворителе для удаления липидов, которые в изобилии в ткани головного мозга, он привел нас выбрать осаждение хлороформ / метанол 27. Использование из цвиттерионных детергентных CHAPS (3 - [(3-холамидопропил) диметиламмонио]-1-сульфонат) для ресуспендирования белков гранул в 2D буфера обусловлено его пригодности для облегчения вход белка в первой размерности этапе 28.
Профиль человеческого и мышей пр. мозгаoteome по 2D-Dige показано на рисунках 2А и 2В соответственно. В рисунке 2А объединены флуоресцентные изображения, поступающие от человеческого контроля и образцы AD коры можно наблюдать, на рисунке 2B То же для мышей образцов из гиппокампе модели AD-как Тау патологии 29. Су2, Су3 и Су5 соответственно показано для образцов человека в рисунках 2C-2E. Оба объединены узоры (рис. 2А и 2В) представить высокое разрешение пятна, отражающий качественную МЭФ и второй разделение измерения в соглашения с профилем наблюдается на рисунке 1b. Это качество определение место вместе с тем фактом, что сшивание выполняется для устранения возможного предпочтение белков к конкретному цианин, чтобы эти флуоресцентные изображения (фиг. 2C-2E) очень легко выравнивать по всей анализа программного обеспечения. Кроме того, подготовительные гели окрашивали синим Coomassie доказательств обогащенный белком карта с обильными пятнами по всему диапазоне рН используемой, позволяя вырезать пятна после анализа программного обеспечения и для их идентификации задней по MS / MS.
Качественный анализ мини 2DE с помощью иммуноблоттинга белок содержит информацию высокое значение для его идентификации и модификации, не только для посттрансляционных них, но и для олигомеров и усечения (фиг. 3A и 3B). Возможность выполнять эту технику в мини 2DE обеспечивает быстрые и точные данные о интересующего белка. Что касается ткани от пациента, пострадавших от деменции с тельцами Леви (LBD), характеристика альфа-синуклеина позволяет визуализировать хорошо определенный профиль рН 4-7, где нативный белок находится на ИЭТ 4,67 и МВт 18 кДа, тем не менее, с мини-2DE в дальнейшем может рассматриваться наличие димеров (рис. 3А, звездочка), в то же изоэлектрической чем нативных форм, но и существование UBIQuitinated формы, которые являются более основной и с более высоким МВт при более убиквитинированных они (рис. 3а, стрелки). Другой белок тесно связаны с AD является амилоид-бета-пептид, порожденный комплексной катаболизма белка-предшественника амилоида (APP). В фигуре 3В он сравнил сюжет Широкоэкранный AD случае с семейной один. В случае знакомой AD можно видеть, как бета-амилоида 1-42 уменьшается уважение к спорадической AD, а кроме того, isovariants амилоид-бета-х 42 (4 кДа), также подавляется во всем промежутке , тем временем олигомеры, найденные в 8 кДа отражают, что этот факт не связан с более низкой количества белка, так как пятна интенсивность более актуальной в знакомой нашей эры (рис. 3В).
Рисунок 1: 2DE пр.вых_файл после 10 мМ Трис-1% SDS вес / объем буфера для экстракции (A) и образец, полученный после использования UTS (б). В панели B можно видеть, как число пятен, интенсивности и разрешения значительно выше, чем тот, панели (А). Использование ОТС позволяет почти полное извлечение белка, что находит свое отражение в окрашивании 2DE Coomassie. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 2: 2D-Dige профили для человека (А) и мышей (В) показаны изображения (A) и (B) представляют объединенные изображения для трех цианинов в 3-11 диапазоне рН 18 см полосы.. На снимках (С), (D) и (<сильные> E) цианины подвергаются самостоятельно (Су2 в синий, Су3 в зеленый и Су5 красным цветом). Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 3: В верхней панели можно заметить профиля мини-2DE белковой альфа-синуклеина в LBD пациента Родное PI (4,4) и МВт (18 кДа) изменение функции димеризации (звездочкой), где МВт. является двойным, и убиквитинирование, что не смещает Pi до более простой одного (стрелки) (А). Вниз картинка показывает профиля пептида антитела бета-амилоида в спорадической и генетической случае нашей эры. 2DE шаблон показать, как олигомеризации и деградация происходить по-разному в зависимости от этиологии Diseазы. Это иммуноблот четко указывает на различия в катаболизма APP между двумя условиями. С одной стороны есть увеличение в катаболических продуктов в в спорадических н.э. в отношении семейной одного (стрелки), в то время как олигомеры, кажется, менее заметным (B). Эти эксперименты были проведены на 11 см полосы в зазоре 4-7 рН в 12% бис-Трис геля и в 16,5% Трис-трицин один соответственно (А, В). Нажмите сюда, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Открывая патологические изменения экспрессии белков, поиск биомаркеров и модуляция потенциальных путей фармакологических мишеней являются одними из целей neuroproteomics подходы 30. На фоне развивающихся инструментов, поле 2DE добавляет многообещающее ожидаемый. Тем не менее, консенсус должен быть достигнут, чтобы минимизировать вариабельность и повысить воспроизводимость в экспериментах. В соответствии этой идеи стандартизированный протокол для выполнения 2D-Dige (рис. 2) и последующее 2DE иммуноблоттинга (рис. 3) для человека и мышей мозговой ткани полностью совместимой с моно-мерного иммуноблотинга описано здесь в подробный.
Одна из самых больших дилемм в протеомики является выбор растворение буфера. Для того чтобы увеличить воспроизводимость между различными подходами, ОТС был выбран, так как он полностью совместим с IEF. Кроме того, ОТС экстракционный буфер не дает Pelleт или действительно небольшое один после центрифугирования при 12000 мкг (не путать с выделением SDS при 4 ° С). Это важный момент, учитывая, что многие нейродегенеративные расстройства представляют белки агрегации, в том числе нашей эры. Тот факт, что нет никакого гранул упрощает работу и интерпретации данных, так как никаких независимых исследований не должно быть сделано для растворимого и не растворимой фракции.
Независимо 2D-Dige или мини-2D подходы будут выполнены, есть некоторые ограничения, которые должны быть указаны. Во-первых химические свойства буфера ОТС, это решение не должно быть перегрет или карбамоилирование происходит на первичных аминов и поэтому может помешать как связи органического красителя и 2D профиль, ухудшение разрешение пятна, нарушая МЭФ 15. Во-вторых, имеющиеся диапазоны рН, в настоящее время самый широкий интервал рН является одним 3 до 11, этот фактор присоединился к вероятности того, что не все запись белки на полосу IPG может EXPLайн сложенные белки полосы в обе стороны гелей после окрашивания. Это ограничение может изложить, почему не вся протеом можно изучать с помощью 2D. Другим важным ограничением является полемика использование осадков. С одной стороны, это настоятельно рекомендуется сделать осадков шаг с хлороформ / метанол, который позволяет эффективно снижать содержание липидов 27, соли, нуклеиновые кислоты и заряженные моющие средства, которые могли бы помешать параметров IEF и влияют на разрешение и / или воспроизводимости 2D. Кроме того, с другой стороны, она не может быть исключено, что некоторые белки сильно прикрепленные к мембране могут быть потеряны. Тем не менее, в случае, когда другие буферы экстракции, используемого вместо ОТС, с или без добавления протеазы или ингибиторов фосфатазы, использование стадии осаждения рекомендуется любых ошибок во время IEF. Наконец, следует отметить, что анализ 2D-Dige изображения представляет неудобства, которые перекрываются флуоресценциипятна могут привести к потере информации, так как в анализе программного обеспечения не считает это как существенного колебания.
Новинка этого комбинированного метода заключается в их воспроизводимость, универсальность и белков характеристики. Только один экстракционный буфер позволяет выполнять два дополнительных методов. 2D-ПГЛП предоставляет количественную информацию о белках изменения экспрессии и их последующей идентификации по MS / MS. Тем не менее, не исключено, что изоформы, isovariants, зимогены, посттрансляционных модификаций и катаболические продукты не могут быть идентифицированы с перекрытой флуоресценции с другими белками. Чтобы преодолеть это ограничение, предлагается параллельно использования мини-2DE. На самом деле, по нашим данным один из наиболее важных ловушку, которая может быть совершено это взять моно-мерного иммуноблоттинга как полный проверки результатов 2D-Dige, или даже считать, что любое изменение протеомика не надо проверять. Furthermore, технические преимущества мини 2DE являются: 1) возможность использования небольших систем СДС-странице 2) относительно низкая материальные необходимости, 3) широкие диапазоны рН доступные, 4) иммуноблот чувствительность и 5) легко вычислить изменения. Самый суетливый аспекты мини 2DE метода является количественная, несмотря мини-2DE не может считаться количественный подход, после пятна или участки выравнивания можно установить соотношение между кислой и основной части или наоборот, с мебелью, таким образом, является надежным оценка изменения наблюдались 9.
Несколько данные в литературе точным использование мини-2DE для достижения белка характеристику, например, для сверхэкспрессируется белков с и без пост-трансляционной модификации 31, олигомеризации и деградации путей, описанных деменции с тельцами Леви 32,33 и в фигуре 3А для AD пациент. Другой пример информации, предоставленной м ини 2DE является усечение бета видов амилоидных выполненных в без деменции и случаев AD как потенциальная цель для вакцинации подхода 34. Наличие олигомеров и его дифференциально деградации также показано на фиг.3В в зависимости от Широкоэкранный знакомой AD пациента. Кроме того, мини-подход 2DE открывает широкое и практическое окно возможностей, так как различные виды лечения могут быть выполнены. Например, в области нашей эры, могут быть добавлены ингибиторы фосфатазы и раскрыть их влияние в Тау фосфорилирования. Кроме того, фармакологические препараты эффект на протеолиза путей, при условии, что ИП и идентификационный МВт усеченные формы могут обеспечить сайт расщепления согласно эпитопа антитела по 34. Интересно, что последние данные выяснены с помощью мини-2DE ассоциацию образа жизни и медикаментозного лечения с когнитивными нарушениями в мышиных моделях, а также биохимический профиль нового Тау мутации 35-37.
ntent "> разработка метода, позволяющего 2D-Dige мозговой ткани получить от человека или мыши происхождения, а также проверки с использованием мини-2DE позади, может пролить свет на раскрытие новых фармакологических целей и биомаркеров для изучения неврологических заболеваний. Тот факт, что эти нарушения имеют свое происхождение в мозге, обязать изучить этот орган как идеальный источник информации. Тем не менее, образцы человека ограничены, поэтому использование животных моделей становится незаменимой для достижения этой цели. в данном документе важность использования подходов в параллельно для обоих типов образцов и проверки результатов. Желательно, чтобы в ближайшем будущем надежные кандидаты будут найдены и испытаны в телесных жидкостей, таких как плазме и спинномозговой жидкости, чтобы установить раннюю диагностику, оценку прогрессирования заболевания и в конечном счете оценка возможных процедур.Критические шаги в протоколе должны быть приняты во внимание для его suitabПриложение ле. В случае 2D-Dige, качество теста образцы очень важный момент. Этот тест позволяет, чтобы знать белки профиль и проверить реальную количество белков экстракта существующие в 2D буфера после осаждения. Витражи профили дают нам информацию о качестве и однородности между образцами. Образцы только со схожими должны использоваться для исследований 2D-Dige, в противном случае 2D-ПГЛП может привести к ухудшению окрашивания и плохим разрешением профиля белка. Различия в этих образцах шаблонов являются более распространенными в человека, чем в мыши мозговой ткани, так как образцы человеческого мозга для исследований сделки с многих неудобное 38,39. Кроме того, идентификация деградации белков в связи с интервалом посмертного уже сообщалось на 2D-Dige 40,41. Проверка рН перед маркировки органического красителя, этот шаг должен ухудшить всю процедуру заднюю. Маркировки краситель цианиновых и SDS-PAGE электрофореза должно быть сделано в темноте, какнасколько это возможно для того, чтобы не повлиять на флуоресценции маркировки. Наконец, полиакриламидных гелях должны быть как можно более однородными между ними, с тем чтобы устранить интер-изменчивость во электрофоретической миграции и облегчить модели перекрывают друг друга и задней анализа 42,43.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют конфликта интересов объявить.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Inserm, Университет Лилль 2, MEDIALZ, LabEx (совершенство лаборатории, программа инвестировать в будущее) и DISTALZ (Разработка инновационных стратегий для Transdisciplinary подхода к болезни Альцгеймера). FJ.FG в настоящее время является получателем общение ANR (Французское национальное агентство Исследования / NeuroSplice де Тау Projet ANR-2010-BLAN-1114 01), но эта работа была также при поддержке гранта от JCCM (Испания).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CyDye DIGE FLUOR MIN KIT 5 nmol 1 * 5 Nmo | GE Healtcare | 25-8010-65 | |
| Immobiline DryStrip | GE Healtcare | Reference in function of the pH interval/size | |
| IPG Buffer, pH X-X | GE Healtcare | Reference in function of the pH interval desired | |
| AMBERLITE IRN-150L MIXED BED RESIN 1 | GE Healtcare | 551797N | |
| DRYSTRIP COVER FLUID IMMOBILINE 1 * 1 l | GE Healtcare | 17-1335-01 | |
| KIT BOX IPG 1 * 1 KIT | GE Healtcare | 28-9334-92 | Plastic box to make the passive rehydration |
| MILLEX GS Filter | Millipore | SLGS033SB | |
| Criterion XT Precast Gels 13.3 x 8.7 cm (W x L) | Bio-Rad | Reference in function of the MW to separate | |
| IPGphor III Isoelectric Focusing Unit | GE Healtcare | 11-0033-64 | |
| Ettan DALTsix Large Electrophoresis System | GE Healtcare | 80-6485-08 | |
| OneTouch 2D Gel SpotPicker 1.5 mm | Gel Company | P2D1.5 |
References
- Collins, P. Y., et al. Grand challenges in global mental health. Nature. 475, 27-30 (2011).
- De Deyn, P. P., Van Dam, D., Sergeant, N., Buée, L. Animal Models of Dementia Vol. 48 Neuromethods 449-468. , Humana Press. 449-468 (2011).
- O'Farrell, P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J Biol Chem. 250, 4007-4021 (1975).
- Riederer, B. M. Non-covalent and covalent protein labeling in two-dimensional gel electrophoresis. J Proteomics. 71, 231-244 (2008).
- Marouga, R., David, S., Hawkins, E. The development of the DIGE system: 2D fluorescence difference gel analysis technology. Anal Bioanal Chem. 382, 669-678 (2005).
- Westermeier, R., Scheibe, B. Difference gel electrophoresis based on lys/cys tagging. Methods Mol Biol. 424, 73-85 (2008).
- Gong, L., et al. Drosophila ventral furrow morphogenesis: a proteomic analysis. Development. 131, 643-656 (2004).
- Gharbi, S., et al. Evaluation of two-dimensional differential gel electrophoresis for proteomic expression analysis of a model breast cancer cell system. Mol Cell Proteomics. 1, 91-98 (2002).
- Ando, K., et al. Tau pathology modulates Pin1 post-translational modifications and may be relevant as biomarker. Neurobiol Aging. 34, 757-769 (2013).
- Bretteville, A., et al. Two-dimensional electrophoresis of tau mutants reveals specific phosphorylation pattern likely linked to early tau conformational changes. PLoS One. 4, 4843 (2009).
- Sergeant, N., et al. Two-dimensional characterization of paired helical filament-tau from Alzheimer's disease: demonstration of an additional 74-kDa component and age-related biochemical modifications. J Neurochem. 69, 834-844 (1997).
- Sergeant, N., et al. Different distribution of phosphorylated tau protein isoforms in Alzheimer's and Pick's diseases. FEBS Lett. 412, 578-582 (1997).
- Rabilloud, T., Luche, S., Santoni, V., Chevallet, M. Detergents and chaotropes for protein solubilization before two-dimensional electrophoresis. Methods Mol Biol. 355, 111-119 (2007).
- Wrobel, K., Caruso, J. A. Pretreatment procedures for characterization of arsenic and selenium species in complex samples utilizing coupled techniques with mass spectrometric detection. Anal Bioanal Chem. 381, 317-331 (2005).
- McCarthy, J., et al. Carbamylation of proteins in 2-D electrophoresis--myth or reality. J Proteome Res. 2, 239-242 (2003).
- Chafey, P., et al. Proteomic analysis of beta-catenin activation in mouse liver by DIGE analysis identifies glucose metabolism as a new target of the Wnt pathway. Proteomics. 9, 3889-3900 (2009).
- Kahn, J. E., et al. Comparative proteomic analysis of blood eosinophils reveals redox signaling modifications in patients with FIP1L1-PDGFRA-associated chronic eosinophilic leukemia. J Proteome Res. 10, 1468-1480 (2011).
- Pottiez, G., et al. A large-scale electrophoresis- and chromatography-based determination of gene expression profiles in bovine brain capillary endothelial cells after the re-induction of blood-brain barrier properties. Proteome Sci. 8, 57 (2010).
- Stochaj, W. R., Berkelman, T., Laird, N. Preparative 2D Gel Electrophoresis with Immobilized pH Gradients: IPG Strip Equilibration. CSH Protoc. , (2006).
- Azimzadeh, O., et al. Formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) proteome analysis using gel-free and gel-based proteomics. J Proteome Res. 9, 4710-4720 (2010).
- Singh, S., et al. Identification of the p16-Arc subunit of the Arp 2/3 complex as a substrate of MAPK-activated protein kinase 2 by proteomic analysis. J Biol Chem. 278, 36410-36417 (2003).
- Rabilloud, T. Use of thiourea to increase the solubility of membrane proteins in two-dimensional electrophoresis. Electrophoresis. 19, 758-760 (1998).
- Molloy, M. P., et al. Extraction of membrane proteins by differential solubilization for separation using two-dimensional gel electrophoresis. Electrophoresis. 19, 837-844 (1998).
- Ericsson, C., Peredo, I., Nister, M. Optimized protein extraction from cryopreserved brain tissue samples. Acta Oncol. 46, 10-20 (2007).
- Shaw, M. M., Riederer, B. M. Sample preparation for two-dimensional gel electrophoresis. Proteomics. 3, 1408-1417 (2003).
- Ye, X., et al. Optimization of protein solubilization for the analysis of the CD14 human monocyte membrane proteome using LC-MS/MS. J Proteomics. 73, 112-122 (2009).
- Centlow, M., Hansson, S. R., Welinder, C. Differential proteome analysis of the preeclamptic placenta using optimized protein extraction. J Biomed Biotechnol. 2010, 458-748 (2010).
- Perdew, G. H., Schaup, H. W., Selivonchick, D. P. The use of a zwitterionic detergent in two-dimensional gel electrophoresis of trout liver microsomes. Anal Biochem. 135, 453-455 (1983).
- Schindowski, K., et al. Alzheimer's disease-like tau neuropathology leads to memory deficits and loss of functional synapses in a novel mutated tau transgenic mouse without any motor deficits. Am J Pathol. 169, 599-616 (2006).
- Veenstra, T. D., Marcus, K. Multidimensional advancement of neuroproteomics. Expert Rev Proteomics. 5, 149-151 (2008).
- Hernandez-Hernandez, O., et al. Myotonic dystrophy CTG expansion affects synaptic vesicle proteins, neurotransmission and mouse. 136, 957-970 (2013).
- Deramecourt, V., et al. Biochemical staging of synucleinopathy and amyloid deposition in dementia with Lewy bodies. J Neuropathol Exp Neurol. 65, 278-288 (2006).
- Tofaris, G. K., Razzaq, A., Ghetti, B., Lilley, K. S., Spillantini, M. G. Ubiquitination of alpha-synuclein in Lewy bodies is a pathological event not associated with impairment of proteasome function. J Biol Chem. 278, 44405-44411 (2003).
- Sergeant, N., et al. Truncated beta-amyloid peptide species in pre-clinical Alzheimer's disease as new targets for the vaccination approach. J Neurochem. 85, 1581-1591 (2003).
- Le Freche, H., et al. Tau phosphorylation and sevoflurane anesthesia: an association to postoperative cognitive impairment. Anesthesiology. 116, 779-787 (2012).
- Leboucher, A., et al. Detrimental effects of diet-induced obesity on tau pathology are independent of insulin resistance in tau transgenic mice. Diabetes. 62, 1681-1688 (2013).
- Deramecourt, V., et al. Clinical, neuropathological, and biochemical characterization of the novel tau mutation P332S. J Alzheimers Dis. 31, 741-749 (2012).
- Birdsill, A. C., Walker, D. G., Lue, L., Sue, L. I., Beach, T. G. Postmortem interval effect on RNA and gene expression in human brain tissue. Cell Tissue Bank. 12, 311-318 (2011).
- Bell, J. E., et al. Management of a twenty-first century brain bank: experience in the BrainNet Europe consortium. Acta Neuropathol. 115, 497-507 (2008).
- Crecelius, A., et al. Assessing quantitative post-mortem changes in the gray matter of the human frontal cortex proteome by 2-D DIGE. Proteomics. 8, 1276-1291 (2008).
- Swatton, J. E., Prabakaran, S., Karp, N. A., Lilley, K. S., Bahn, S. Protein profiling of human postmortem brain using 2-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis (2-D DIGE). Mol Psychiatry. 9, 128-143 (2004).
- Viswanathan, S., Unlu, M., Minden, J. S. Two-dimensional difference gel electrophoresis. Nat Protoc. 1, 1351-1358 (2006).
- Tannu, N. S., Hemby, S. E. Two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis for comparative proteomics profiling. Nat Protoc. 1, 1732-1742 (2006).
