Summary
本文提供的详细方法为使用三维（3D）测定法来量化乳腺癌细胞的侵袭。具体来说，我们将讨论建立这样的检测要求的程序，量化和数据分析，以及方法来探讨及细胞膜的完整性，当细胞侵入发生的损失。
Abstract
现在是众所周知的细胞和组织微环境是影响肿瘤起始和进展的关键调节因子。此外，细胞外基质（ECM）已被证明是在培养和稳态体内细胞行为的关键调节剂。在二维（2D）培养细胞的当前方法中，塑料表面的结果的细胞和它们的微环境之间复杂的相互作用的干扰和丢失。通过使用三维（3D）培养物测定，用于细胞的微环境相互作用的条件成立类似的体内微环境。本文提供了详细的方法生长的乳腺癌细胞在三维基底膜蛋白基质，体现三维培养的细胞侵袭的评估潜在进入周围环境。此外，我们将讨论这些3D分析如何有潜力，研究信号molec的损失ULES，通过免疫组化方法调节上皮细胞的形态。这些研究有助于识别重要的机械细节成调节入侵的方法中，需要对乳腺癌的扩散。
Introduction
迁移和侵袭能力的个人或集体的细胞是癌症的两大特色，以及所需癌细胞1-4的转移扩散。癌症细胞的启动转移的能力取决于它们的能力来迁移和侵入使用的invadopodia以降解细胞基底膜邻近组织。 invadopodia的是动态的肌动蛋白富含基质降解的突起，通过基质降解蛋白酶5的释放使胞外基质的降解。癌细胞侵袭涉及矩阵接着癌症细胞迁移的降解，这是伴随着所述三维（3D）矩阵环境2的重组。因此，为了穿过基质，细胞必须改变其形状和与细胞外基质（ECM）2交互。
乳腺组织完整性的维持依赖于紧密微机控制三维组织体系结构，因为细胞-细胞外基质和细胞-细胞粘附路口影响基因表达和上皮极性的破坏可导致癌症6-10的发作。然而，大多数体外迁移和侵袭测定法如Transwell小室测定法或伤划痕测定是2维（2D），因此这些忽视的细胞和它们的相邻环境3,6,8,11-14之间的错综复杂的相互作用。相当大的形态和功能的多样性包括不同的细胞形态，细胞分化，细胞-基质粘连和基因表达模式已经由培养细胞在三维培养那些在一般2D缺乏实验2,6,8,11检测。因此，采用了3D试验是显著有益的扼要体内的状况更符合生理，导致基础研究到临床6-10更好的翻译突破性的发现。然而，应该注意的尽管获得与使用三维培养的诸多优点，这种模式不能捕获所有的体内肿瘤微环境，包括各种细胞类型的复杂性。然而，有可能把基质细胞分化成的三维模型（例如，成纤维细胞，白细胞，巨噬细胞），研究了对癌症的细胞粘附和侵入15-17肿瘤-基质的相互作用的影响。
乳腺上皮细胞的培养生长最有效的，当细胞外基质蛋白，如层粘连蛋白和胶原蛋白都存在。与该已知的，市售的基质混合物是来自于Engelbreth-的Holm-群（EHS）小鼠肿瘤和被称为基质胶基底膜基质2,8。已经建立了多种技术来增加上皮细胞的3D殖民地基底膜基质2,8。三维基底膜基质的模型是有效的建立既恶性及非恶性乳腺细胞生长，类似什么是发生在体内环境18,19。 MCF10A细胞非恶性乳腺上皮细胞。当在基底膜基质生长，这些细胞表现出在正常乳腺细胞的体内特性，并进行控制，细胞增殖，细胞分化，凋亡和建立的内腔空间8,12,20。此外，MCF10A细胞的形成在三维培养腺泡细胞的细胞核的外观更接近于乳腺上皮细胞在组织中比在单层培养21。通过研究比塞尔和同事们首次揭示了恶性乳腺细胞可以从非恶性乳腺细胞相鉴别时，层粘连蛋白丰富的环境中成长，因为恶性细胞显示高度混乱的表型，增加增殖，降低细胞对细胞粘附，间质标记物的表达增加，并增加了侵入结构的数量形成3,6,22。
在细胞环境中的异常可影响肿瘤的形成20。在三维培养方法可用于有效地学习，肿瘤细胞和其周围环境之间发生的通信，并确定如何蛋白表达的影响，例如通信14,20,21,23。本文提供了详细的方法生长的MDA-MB-231乳腺癌细胞在三维培养分析侵袭，并研究上皮形态的利用上皮标志物层粘连蛋白，细胞基底膜18,19,24的一个组成部分的损失， 25。详细的程序提供准确和可重复地量化星状（侵入型）结构形成由任何侵入性肿瘤细胞，而不是限定的共同的乳腺癌细胞系（如MDA-MB-231，HS578T，MCF-7，T47D或能力）。因此，该测定可以作为评价或在细胞如何表达治疗与平台亲或反侵入性化合物调节细胞外基质的降解，由单个或多个细胞。
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Protocol
1，三维基底膜基质乳腺癌细胞培养（埋置技术）
- 处理基底膜基底膜基质：在4℃下在冰上解冻过夜基底膜基质是液体在低温下固化，但在室温下。保持基底膜基质冰（ 图1A-B）上。
- 覆盖共聚焦一号玻璃底培养皿用50μl基底膜基质的利用P-200的Pipetman的前端在螺旋形图案（ 图1C）扩频矩阵的装置。传播基底膜基质时避免气泡的形成谨慎使用。同样，避免传播矩阵到接近玻璃底菜的边界，以防止半月板形成。如果没有经验的操作基底膜基质，然后预冷的菜，P-200的Pipetman移液管，并能在冰上（可替换地，在4℃放置过夜，在冰箱）。这一步报价额外的时间凝固之前扩散基底膜基质。放置在培养皿（ES）在细胞培养孵育箱（37℃，5％CO 2）为至少30分钟，以使基底膜基质固化（ 图1D）。
- 而基质正在发生凝固，胰蛋白酶消化细胞的70-80％汇合100毫米的钢板。一旦细胞已开始剥离所述板，它们悬浮在10ml含10％（V / V）胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培养基中，以灭活胰蛋白酶（ 图1E）。然后将悬浮的细胞转移到15毫升锥形管中（ 图1F）。
- 在一个专门的细胞培养物离心分离（ 图1G-H）旋转的细胞（存在于锥形管中），在100×g离心3分钟。
- 虽然在细胞被离心下来，等份加入50μl基质成1毫升微量离心管（注意：各玻底培养皿被分配一个微量离心管中，因此，如果实验要求3的菜肴，那么它遵循3微量离心管是必要的也一样），然后将管置于冰上（ 图1B）。
- 从锥形管从步骤1.4吸出培养基，同时保留原状（ 图1I）的粒料。重悬细胞（已降速）1毫升FBS的RPMI培养基（ 图1J）的。
- 一旦细胞被使用血细胞计数器（ 图1K），或细胞颗粒计数器等分试样2.5×10 4细胞放入离心管中计数，并用适当的介质，以获得50微升（ 图1L），总体积为顶它关闭。
- 从步骤1.7（25,000个细胞在50μl）与来自步骤1.5以1:1的比例的含有基质的离心管中的细胞混合;最终体积为100微升（ 图1M）。
- 从步骤1.8细胞混合到S：轻轻板100微升的矩阵olidified基底膜基质涂层菜从步骤1.2（ 图1N）。这使得细胞将要被嵌入在基底膜基质。
- 传送盘（ES）到细胞培养孵化器中（37℃，5％CO 2），并允许矩阵：细胞混合物以固化至少30分钟。
- 一旦矩阵：细胞混合物凝固后，加入2ml FBS的RPMI媒体的菜（ 图1-10），并采取了菜回到原来的位置将被保存为实验（ 图1P）的其余部分的孵化器。
- 每一天，为期5天更换介质（或按照客户要求进行化验，化验的MDA-MB-231细胞的持续时间为5天的）。
- 使用光学显微镜，采取微分干涉对比的MDA-MB-231的菌落悬浮在基底膜基质（ 图3A）条 （DIC）的图像。每天一次图像20代表地区在10倍物镜5天，测定菌落形态（ 图3C）。
- 盲目地分析图像，以确定细胞的集落形成星状（ 图3B）。一个群体被认为是星状，如果从细胞的球状体一个或多个突起被感知到。以确定的侵入星状菌落的百分比，由每所获取的图像的细胞集落的总数除以星状的菌落数，然后平均20个图像的每一天的星状菌落的百分比。
图1：MDA-MB-231乳腺癌细胞的基底膜基质（在嵌入技术）的三维培养。 AB）的实验装置（在通风橱中进行）的玻底培养皿涂层的。 三）良好的示意图用50μl基底膜基质的D）美食放置在细胞培养孵育箱（37℃，5％CO 2），以使矩阵以固化至少30分钟。E）的细胞用胰蛋白酶处理。F ）将细胞重悬于15毫升锥形管中。GH）细胞（存在于锥形管）是在组织培养离心机离心沉降，在100×g离心3分钟。Ⅰ）细胞沉淀J）细胞（已停止旋转）重新悬浮于1ml FBS的RPMI培养基中的K）细胞用血细胞计数器：L计数）2.5×10 4个细胞等分至微量离心管，并配上关闭使用适当的介质，以便得到50μl的总体积：M从步骤1.7（25,000个细胞在50μl）与来自步骤1.5以1:1的比例的含有基质的微量离心管）混合细胞;最终体积为100μ从第8步细胞混合物至步骤1.2固化基质涂层菜O）一旦矩阵：，L N）轻轻板100微升基质细胞混合物凝固后，加入2ml FBS的RPMI媒体来。菜，P）将菜在那里将被储存在余下的实验孵化器。
的三维培养与免疫荧光形态发生特点2。考试
- 取出培养皿（ES）之前（ 图2A），80％甲醇（固定溶液）和3％牛血清白蛋白（封闭液BSA）：设置在冰托盘，冷磷酸盐缓冲溶液（PBS）中，20％丙酮从培养箱中。
- 将菜（ES）上的冰盘和抽吸介质，然后用2毫升冷的PBS（ 图2B）洗3次。
- 一旦最后的PBS冲洗吸出，加2 mL 20％的丙酮：80％甲醇溶液放入盘中（ES）（ 图2C 图2D）。
- 一旦固定的20分钟结束时，使菜回到室温，吸出固定液，并随后用PBS洗涤3次。一旦最后的PBS洗涤被吸入，加入2ml的3％BSA中的菜（ES）在室温下（ 图2E），以阻断至少30分钟。
- 期间的抑制期间准备的主（层粘连蛋白V 1:100）和二级抗体（在适当的稀释度）溶解在3％牛血清白蛋白（BSA）封闭缓冲液中稀释。请注意：400-500微升的“BSA +初级抗体的解决方案应直接加入到基质：细胞混合物。
- 一旦阻塞的30分钟已经过期，添加一级抗体并孵育至少1小时，在室温下（ 图2F）。请注意，没有PBS洗涤应遵循30分钟blockin进行克期。
- 根据步骤2.6完成后，除去'BSA +初级抗体“溶液，并用PBS洗涤3次。
- 加溶解在3％BSA的二级抗体（在适当的稀释度），直接在基质：细胞混合物，盖菜和孵育1小时，在室温下（ 图2G）。
- 删除'的BSA +二次抗体“溶液，并用PBS洗涤3次。
- 加入2ml的Hoechst 33258（1:10000）溶解在PBS的核染色，孵育铝箔下5分钟（或覆盖不透明的容器，以限制光漂白）（ 图2H）。
- 一旦5分钟孵化用Hoechst33258吨已过期，用PBS洗碟（ES）5倍。
- 添加封固剂直接喷在矩阵：在共聚焦培养皿细胞混合物，并用盖玻片覆盖小心，以防止诱发任何中断在基底膜马特里殖民地的完整性X：细胞混合物（ 图2I）。
- 让培养皿（ES），以在室温下（ 图2I）干燥过夜（或24小时）。一旦干燥，菜（ES）可以储存在-20°C，但它强烈建议他们应该尽可能快地成像。
- 用荧光显微镜使用（ 图3D-E）抗体的合适的激光波长采集图像。
图2。考试3D培养免疫荧光的。 A）实验装置的示意图B）美食置于冰盘和媒体吸气;随后洗涤细胞三次，用2ml冷的PBS C）2毫升20％丙酮：80％的甲醇溶液加入到培养皿（ES）D）固定细胞。20分钟，在4℃下（无论是在冰上或在冰箱中）。E）2×3％BSA的添加到培养皿（ES）在室温下阻断了至少30分钟。F）一旦的30分钟阻挡已过期，添加一级抗体并孵育至少1小时，在室温下G）溶解在3％BSA（在适当的稀释）次级抗体进行直接添加到基底膜基质：细胞混合物; 。随后菜肴覆盖并温育1小时，在室温下高）2毫升Hoechst公司（1:10,000;溶于PBS中）加入到dishe（ES）细胞和培养下铝箔5分钟I）的安装介质直接添加。到矩阵：在共聚焦菜和菜细胞混合物覆盖着玻璃盖玻片。菜（ES）在室温下干燥过夜（或24小时）。
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Representative Results
在MDA-MB-231细胞侵入在三维矩阵的一个例子示于图3C。将细胞包埋在基质（第1天），并开始由第3天形成侵入性（星状）结构，以及完全侵入到基质由5天（ 图3C）。形成星状的菌落数进行计数，并表示为每培养皿的菌落（侵入性和非侵入性）的总数的百分比。另外，由于测量是为五天每日进行，入侵的速率也可以进行评价。
建立形态发生事件的时间线提供了一个基础，以测试在这些测定中众多参数。例如，乳腺癌细胞可以与抗癌药物或药物可促进细胞骨架重排进行治疗，而这些药物对入侵的影响可以被确定，相对于未刺激的细胞和车辆控制24。另外，乳房的产能CER细胞形成浸润性突可根据遗传修饰细胞利用RNA干扰（如shRNA的）18,24,25来表示一个潜在的癌基因或降低基因的表达进行定量。
使用3D细胞培养作为实验工具的主要优点是研究在细胞形态变化的重要信号分子的时空特征的能力。利用免疫荧光染色中，这些分子的表达可以在视觉上的三维培养中检测到。在图3E中，我们展示了MDA-MB-231细胞显示的细胞膜的完整性和基底膜层粘连蛋白V 24的漫本地化亏损代表性的侵入（星状）菌落。与之形成鲜明对比的是什么在乳腺癌细胞中观察到，层粘连蛋白V的本地化，以一个完整的基底膜层包围未处理的非恶性MCF10A细胞的乳腺腺泡（ 图3E）24。
图3。图像采集和插画代表图像。 A）用显微镜拍摄的图像B）微分干涉对比（DIC）的成像显微镜用来采集图像，并使用MDA-MB-231细胞的图像分析软件。 三）样本代表性DIC图像（采取每天一次，随后的图像分析5天）被示出。单向ANOVA，随后进行Dunnett多重比较检验：*，P <0.05;使用荧光显微镜比例尺，100微米D）图像采集E）免疫荧光样本图像描绘层粘连蛋白V定位在MDA-MB-231（培养5天）和MCF10A细胞（生长12天）所示。比例尺，20微米。
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Discussion
三维细胞培养技术的发展使得研究人员研究乳腺上皮细胞的转化，使我们能够想象的巨大的形态学变化。除了分析细胞的侵袭，单或多细胞的乳腺上皮细胞球体可用于评估改变细胞的粘附，增殖，大小和基底根尖极性。相反，以前报道的方法，其中所述细胞覆盖有ECM 8，我们的方法嵌入了细胞在细胞外基质18,19,24，这允许多方向侵入到被量化。这些创新的三维培养模型使研究人员在研究中学习的单层细胞，用传统的Transwell小室侵袭实验是不可能的表型变化。通过与细胞集落共聚焦免疫荧光分析生物化学和药理学策略的结合，3D模型提供了便利，以当心的能力Ÿ分析形态学改变与更多的复杂性和细节。因此，这种技术已经进一步推动我们的影响癌症的发生和发展机制的理解。
我们发现，每盘共聚焦MDA-MB-231细胞的电镀的最佳数量被确定为25000个细胞。增加该细胞数目可能会潜在地导致过度基底膜基质降解（简称“的起毛现象'），并且因此，将不被推荐。然而，如果其它参数被调节更高的细胞数可以工作，如与一个伴随增加基底膜基质体积。另外，基底膜基质的混合物可以在浓度变化从一个批次到另一个。因此，它的维持非恶性乳腺上皮细胞在三维测定的正常形态的能力，初步测试该混合物是重要的。当3D成像的文化，独特的问题出现的是在成像单层生长的培养时不存在。鉴于在基底膜基质生长的菌落是多维的，整个结构可以成像时，如果位于焦点的平面之外不容错过。这是通过使用共焦的Z-堆栈，使图像要采取在多个平面，因此，三维细胞集落的每个单独的侵入结构进行成像的成像克服。
我们还确定，20％丙酮：80％甲醇溶液是用于固定菌落嵌入在基底膜基质的最佳剂，相比于使用其它固定剂如多聚甲醛用Triton-X溶液。我们已经发现，在丙酮：甲醇固定液提高免疫标记，并趋于减少背景自发荧光。然而，染色过程的优化，需要在每一个实验中，为了确定可能不同于通常用于单层染色理想的抗体稀释液。大多数antibodiES上单分子膜的工作可用于三维免疫染色。然而，培养时间与抗体的长度可能会有所不同，这将不得不在个人基础上确定的。
3D成像的文化进行免疫荧光研究可以带来一些挑战8。为了克服'模糊/颗粒感'由于试样的厚度的问题，可采取若干步骤来改善图像的质量，例如获得的Z-堆栈的标本或增加曝光时间，并增加帧的数均。相比于球体形态，而不是在一个平面上获取图像，这也是非常有益的区分星状（侵入性）。的Z堆叠成像也可以加工来呈现表示免疫染色标本的3D图像。此外，使用MDA-MB-231或MCF10A细胞系，我们形成细胞聚集体在该时间段内成功生长。因此，我们能够检查的位置和变化的三维培养免疫荧光细胞极性标记物的表达。或者，细胞聚集可被放置到基底膜基质之前预先形成和感兴趣的蛋白质的定位可以被评估。
总括而言，各种可能的应用使得用三维培养物的动态检测，可与多种细胞的光谱可以使用，是否病理和/或正常的起源，允许固定的样品中的改变的细胞形态学和侵袭的评价或实时18,19,24。
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Disclosures
我们什么都没有透露。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml tubes | VWR | CA10011-700 | Sterile, disposable |
| 100-mm culture dish BD353003 | VWR | CABD353003 | Sterile, disposable |
| 15 ml Falcon tube | VWR | CA21008-918 | Sterile, disposable |
| 1 ml filtered tips | VWR | 10011-350 | Sterile, disposable |
| 200 μl filtered tips | VWR | 22234-016 | Sterile, disposable |
| 20 μl filtered tips | VWR | 22234-008 | Sterile, disposable |
| 35-mm glass-bottomed Confocal No.1 culture dishes | MatTek Corporation | P35G-1.0-14-C | Precooled before use |
| Bovine serum albumin (BSA) | BioShop | ALB003.100 | Used at 3% for IF |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, highly cross-adsorbed | Life Technologies | A11029 | 1:250 for IF |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A11011 | 1:1,200 for IF |
| Anti-Beta-Catenin | BD Transduction Laboratories | 610153 | Mouse-monoclonal; Used at 1:100 for IF |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F1051 | Used at 10% (v/v) |
| Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) - 10 mg⁄ml Solution in Water | Life Technologies | H3569 | Used at 0.1% (1:10,000 dilution) |
| InVivo Analyzer Suite | Media Cybernetics | Used for 3D culture imaging (DIC images at 10X and 40X) | |
| Kisspeptin-10 (KP-10) | EZ Biolabs | PT0512100601 | Used at 100 nM |
| Anti-Laminin | Cedarlane | AB19012(CH) | Rabbit-polyclonal full length human; Used at 1:100 for IF |
| LSM-510 META laser scanning microscope | Zeiss | Used at 63X objective; oil immersion lens | |
| Matrigel phenol red free (BD356237) | VWR | CACB356237 | Lot No.2180819; 10.4 mg/ml |
| Olympus IX-81 microscope | Olympus | Used for 3D culture imaging (DIC images at 10X and 40X) | |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | Antibiotic (added to media; used at 0.01%) |
| 10 ml pipette | VWR | CA53300-523 | Sterile, disposeable |
| RPMI 1640 Medium with Glutamine | Life Technologies | 11875-119 | Used for culturing of MDA-MB-231 cells |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x), Phenol Red | Life Technologies | 25200-072 | Used to trypsinize MDA-MB-231 cells |
| MEGM (bullet kit): MEBM (CC3151)+Single quots (CC4136) | Lonza | CC-3150 | Used for culturing of MCF10A cells |
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