Summary
يصف هذا البروتوكول الإعداد المجهر رقة الضوء وتنفيذها لفي الجسم الحي التصوير من C. ايليجانس الأجنة.
Abstract
تقنيات التصوير الضوئية سريعة ومنخفضة هي شرط مسبق لدراسة تطوير الكائنات جملة وتفصيلا. المجهر ضوء ورقة تستند يقلل الصورة تبيض والتأثيرات الضوئية مقارنة المجهري متحد البؤر، مع توفير صور 3D مع قرار التحت خلوية. هنا نقدم الإعداد من ورقة القائمة على ضوء المجهر، التي تتألف من المجهر تستقيم ومجموعة صغيرة من عناصر البصريات الميكانيكية لتوليد ضوء ورقة. يصف البروتوكول كيفية بناء ومحاذاة المجهر وتميز ورقة الخفيفة. بالإضافة إلى ذلك، أنها تبين بالتفصيل كيفية تنفيذ أسلوب في التصوير جملة وتفصيلا من C. ايليجانس أجنة باستخدام غرفة الملاحظة البسيطة. الأسلوب يسمح للأسر 3D-ونين الأفلام الوقت الفاصل بين أكثر من ساعات قليلة من التنمية. وهذا ينبغي أن تخفف من تتبع شكل الخلية، انقسامات الخلية والبروتينات الموسومة على مدى فترات طويلة من الزمن.
Introduction
تشكيل وصياغة كائن حي ينطوي على تحركات الخلية، ويتغير شكل الخلية، وانقسام الخلايا وتمايز الخلايا. فهم تطور وتنسيق هذه العمليات تتطلب أدوات التصوير السريع مع القدرة على ثلاثة أبعاد وقرار التحت خلوية. من بين التقنيات مع هذه في الجسم الحي قدرات التصوير، ودعا ضوء ورقة واحدة أيضا إضاءة المجهر / انتقائية الإضاءة الطائرة المجهر لديه ميزة فريدة من نوعها لإنتاج تأثيرات المنخفض الضوئية وانخفاض photobleaching من 1،2.
في ورقة إضاءة المجهر، مضاءة العينة من الجانب بواسطة ورقة الضوء، الذي يؤدي وباجتزاء البصرية. المسار الإضاءة ومسار الكشف هي متعامدة مع بعضها البعض، ويتم محاذاة الورقة الضوء ليتزامن مع المستوى البؤري كائن الكشف عدسة الهدف. يتم وضع العينة عند تقاطع المسارين، والثانية يمكن نقلها على طول محور الكشف للسماح 3D التصوير. يضيء فقط الطائرة من الاهتمام ويتم الكشف عن جميع النقاط من هذه الطائرة في نفس الوقت. هذا يزيد بشكل كبير من سرعة اكتساب ويقلل photobleaching من الضيائية وكذلك بالمقارنة مع المجهري متحد البؤر 3.
عمليا، والإضاءة ورقة المجهر هو سهل الإعداد ومحاذاة: للتصوير ثنائي الأبعاد، لا المسح ضروري لا بالنسبة للجزء الكشف، ولا بالنسبة للجزء الإضاءة؛ كأسلوب واسعة المجال مع باجتزاء القدرة، ويمكن الحصول على تصوير ثلاثي الأبعاد من قبل حركة محور واحد من مرحلة عقد العينة.
نحن هنا تقديم إقامة المجهر ضوء ورقة بسيطة وتنفيذها لفي التصوير جملة وتفصيلا من C. ايليجانس الأجنة. C. هي مناسبة بشكل جيد ايليجانس الأجنة في العيش في فيفو معهد العالم العربيجينج بسبب شفافيتها، النسب ثابتة ونمطية خلية مواقف 4،5. ويستند إعداد ورقة وضعت على ضوء المجهر تستقيم القياسية للكشف. بروتوكول المعروضة أدناه تفاصيل كيفية بناء ومحاذاة الإثارة وحدة / المسار واختبار وتميز ورقة الضوء وجبل العينة للتصوير 3D. كما يوفر أمثلة من الأفلام مرور الزمن اكتسب مع الإعداد على سلالات مختلفة معربا عن علامات الفلورسنت.
Protocol
1. إعداد ورقة الضوء والكشف عن مسار
يعطي الشكل 1 مخطط العام من الإعداد البصرية.
- وضع وإصلاح المجهر وأشعة الليزر على الطاولة البصرية.
- الجمع بين الليزر 488 نانومتر، 561 نانومتر و 405 نانومتر مع المرايا مزدوج اللون المطابق. بعد المرايا مزدوج اللون، وأشعة الليزر يجب أن تكون بالضبط شارك الانحياز. لاحظ أن يتم تحديد خيار من موجات الليزر، مرايا مزدوج اللون، والمرشحات الضوئية من أطياف امتصاص التسميات الفلورسنت المحددة المستخدمة في التجارب.
- وضع مرشح الانضباطي الصوتية البصرية (AOTF). استخدام ورقة الاختبار المقدمة من الموردين لضبط وتيرة وقوة AOTF. عندما تتماشى جيدا، تبث حوالي 90٪ من طاقة الليزر في أقصى ضبط مقاسا powermeter. لاحظ أن بعض أجهزة الليزر يمكن التحكم بالكامل من قبل البرمجيات، والتي يمكن أن تجعل AOTF لا لزوم لها.
- وضع وإصلاحالتلسكوب. نلاحظ أن المنظار يتكون من اثنين من العدسات التي تعمل على توسيع شعاع لعرض يساوي أو أكبر من قطر الفتحة الخلفية للإضاءة عدسة الهدف. العدسة مع أصغر البؤري ينبغي أن يأتي أولا.
- المكان، ومحاذاة إصلاح بيريسكوب جلب صعودا مسار بصري أقرب إلى الفتحة الخلفية للعدسة أسطواني. نلاحظ أن اثنين من المرايا من المنظار هي التي شنت بطريقة المحور الطويل هو زرع على الميل للمرآة لكي تعكس شعاع توسعت بشكل كامل.
- وضع عدسة اسطوانية المقبل للخروج المنظار. لاحظ أن عدسة اسطوانية يركز شعاع في اتجاه واحد وتترك موازى في الاتجاه الآخر، وبالتالي تكوين ورقة الخفيفة.
- إعادة تركيز الورقة الضوء الناتج باستخدام الإضاءة عدسة الهدف. لاحظ أن النقطة المحورية صورة الهدف الإضاءة يجب أن يتزامن مع النقطة المحورية موضوع الكشف عن الهدف. المشروع شعاععلى شاشة (مثل الجدار) على مسافة طويلة. تحرك الهدف الإضاءة على طول محور الإضاءة شعاع للحصول على الشاشة ملامح حادة من ورقة الخفيفة.
- وضع خط رباعية (405/488/561/638) تصفية الانبعاثات في المكان المخصص في المجهر (المكعب).
- وضع الكاميرا EMCCD في منفذ إخراج المجهر.
- إصلاح أول مرحلة الترجمة دليل على المسرح المجهر بواسطة مسامير في الثقوب المحفورة في المرحلة المجهر. نلاحظ أن حافة مرحلة الترجمة لابد من وضعه في حوالي 2 سم بعيدا عن وسط المسرح المجهر، بحيث يتم توسيط كفيت أدناه كشف عدسة الهدف.
- إصلاح الثانية مرحلة الترجمة دليل على أول واحد. توجيهات المرحلتين يجب أن تكون متعامدة (X و Y الترجمات).
- إصلاح المرحلة Z كهرضغطية في الجزء العلوي من اثنين من المراحل السابقة. لاحظ أن مرحلة الآلية يمكن أن تستخدم بدلا من مرحلة كهرضغطية.
- إصلاح holde كفيتص (انظر الشكل 2) في الجزء العلوي من المراحل. سيوضعون كفيت عند تقاطع الطريق الإضاءة ومسار الكشف، والتي هي متعامدة مع بعضها البعض.
2. التحقق من ورقة الخفيفة
- ملء كفيت الزجاج بمحلول فلوري، ووضعه على صاحب العينة عند تقاطع اثنين من المسارات البصرية. ورقة الضوء وبالتالي مرئية. فإنه يجب أن يكون أفقيا، ومتماثل / تركزت فيما يتعلق كشف عدسة الهدف.
- إزالة عدسة اسطوانية والحصول على صورة لقياس سمك الورقة الضوء. لاحظ أن سمك الورقة الضوء يعتمد على الفتحة العددية (NA) من إضاءة عدسة الهدف (حوالي 3-4 ميكرون لNA = 0.3). لاحظ أن عدسة معينة، ويمكن زيادة سمك الورقة للضوء عن طريق الحد من حجم شعاع دخول الفتحة مرة أخرى مع فتحة. نلاحظ أن المجهرية الفلورسنت يمكن استخدامها لقياس الفأسقرار الاتحاد العالمي للتعليم والوحشي المجهر.
- اعادة وضع عدسة اسطوانية قبل بدء التجربة.
3. وتصاعد من C. ايليجانس الأجنة
والصورة الخطوات التالية في الشكل 3.
- استخدام قلم علامات الماس لقطع قطعة من شريحة زجاجية من 10 × 20 × 1 مم.
- إعداد 5٪ bacto أجار في الماء، وأنها تغلي والحفاظ عليه في كتلة سخان في 60 درجة مئوية.
- إضافة 50 ميكرولتر من بولي-L-يسين على جانب واحد من قطعة من قطع الشريحة، اتركه حتى يجف.
- وضع شريحة المجهر على مقاعد البدلاء وإصلاحه.
- سيجمع قطعة من قطع الشريحة مع الشريحة الثابتة وإضافة قطرة من آغار ذاب على القمة. ضغط على أجار باستخدام شريحة المجهر نظيفة أخرى للحصول على لوحة آغار رقيقة.
- تسمح لوحة أجار لتجف قبل إزالة الشريحة العليا.
- قطع لوحة أجار على جانب من الشريحة ثابتة من أجل ترك وجود فائض من حوالي 3 ملم سو أجار وإزالة بلطف الشريحة الثابتة.
- إضافة 50 ميكرولتر من بولي-L-يسين على أجار واتركها تجف تماما.
- وضع الديدان حامل في M9 المتوسطة في كوب ووتش.
- قطع الديدان على مستوى الفرج مع مشرط للافراج عن الأجنة.
- تحت مجهر التعرف على الأجنة في مرحلة الفائدة وجمعها باستخدام ماصة microcapillary.
- وضع الأجنة من جانب آغار المغلفة مع بولي-L-يسين أن يبرز من قطعة من قطع الشريحة. وضع الأجنة فقط بجانب الحدود من الشريحة. لا وضع الأجنة في حدود أجار لأنها لن تكون مستقرة بما فيه الكفاية. إزالة بلطف السائل بحيث الأجنة ستلتزم على طبقة بولي-L-يسين.
- محاذاة بسرعة الأجنة لتجنب الجفاف.
- وضع الشريحة قطع في طبق بتري البلاستيكية وإضافة بلطف M9 المتوسطة لتغطية الشريحة.
- الاختيار تحت مجهر أن البيض لا تزال عالقة على أجار.
4. تسجيل من C. التنمية ايليجانس
- إصلاح إعداد السابقة (قطع الشريحة، بالإضافة إلى أجار الأجنة) في صاحب العينة ووضعها في كوفيت. يصف الشكل 4 حامل محلية الصنع ويبين الشكل 5 إطلالة على كفيت في سياق المراقبة.
- إصلاح كفيت على المسرح كهرضغطية.
- تحديد موقف الأجنة مع إضاءة حقل مشرق.
- بدء البرنامج الصنع السيطرة على AOTF، والكاميرا والمرحلة كهرضغطية. نلاحظ أن البرمجيات الحرة، مثل micromanager، يمكن أن تستخدم أيضا.
- حدد خط ليزر والطاقة (AOTF).
- ضبط الموقف من الورقة الضوء باستخدام المرحلة 3 اتجاهات دعم عدسة اسطوانية وعدسة الإضاءة. نقل المرحلة على طول اتجاه الجانبي (X) للحصول على إشارة ألمع. ضبط ثم موقف Z الورقة الضوء، والموقف الطولي (Y) للحصول على اله أفضل إشارة إلى نسبة الضوضاء. لاحظ أن موقف التركيز رقة ضوء قد تحتاج إلى تعديل من جنين واحد إلى آخر لتصحيح الاختلافات في أطوال مسار الضوء.
- للحصول على صور عالية الفاصل الزمني، حدد وقت التعرض، واكتساب، والوقت بين صورتين، فضلا عن عدد من الصور التي سيتم شراؤها، وقوة الليزر. لاكتساب اللون 2، حدد خط ليزر ثاني. يتم الحصول على اثنين من الصور الملونة على التوالي.
- للحصول على كومة من الألف إلى الياء، أيضا تحديد المسافة بين شرائح اثنين، والبداية والنهاية مواقف كهرضغطية.
Representative Results
ثلاث تجارب تسجيل الوقت الفاصل 3D من ثلاث C. مختلفة ايليجانس توضيح سلالات نوع البيانات التي يمكن الحصول عليها باستخدام ضوء الإعداد المجهر رقة المذكورة أعلاه. بحثنا أنه في ظل هذه الظروف الأجنة في تطوير السرعة العادية والبقاء على قيد الحياة في التصوير، بما يتفق مع تقارير سابقة تشير إلى أن التصوير SPIM يسبب مستويات منخفضة الضيائية فقط في C. ايليجانس الأجنة 6،7.
سلالة الأولى يعبر عن هيستون تنصهر إلى GFP (zuIs178؛ stIs10024). تم إجراء التسجيل خلال 2 ساعة مع كومة من 20 شرائح (المسافة بين شرائح 1 ميكرون) اتخاذ كل 37 ثانية. الشكل 6 يوضح طائرة واحدة من المكدس في نقاط زمنية مختلفة. كل من نوى interphasic (السهم) ومكثف لونين الإنقسامية (رأس السهم) واضحة للعيان.
سلالة الثاني يعبر عن تويولين تنصهر إلى GFP (ruIs57) وهيستونتنصهر mCherry (itIs37؛ stIs10226). تم إجراء تسجيل خلال 16 دقيقة مع كومة من 20 شرائح (المسافة بين شرائح 1 ميكرون) اتخاذ كل 105 ثانية. الشكل 7 يوضح طائرات مختلفة من المكدس ونقاط زمنية مختلفة. الفيلم يعرض 3D المرتبطة 1 اعادة البناء في الوقت 3 نقاط على التوالي. خلال الانقسام، المغزل الإنقسامية (الأخضر) والكروموسومات مكثف (الحمراء) مرئية مما يتيح تتبع توجهات انقسام الخلايا أثناء التطور بشكل واضح.
سلالة الثالث يعبر عن ئي VIT-2 تنصهر إلى GFP (pwIs23) وغشاء ملزمة mCherry (ltIs44). تم إجراء تسجيل خلال 25 دقيقة مع كومة من 10 شرائح (المسافة بين شرائح 1 ميكرون) اتخاذ كل 30 ثانية. الشكل 8 يوضح طائرات مختلفة من المكدس ونقاط زمنية مختلفة. تحركات سريعة من جزيئات البروتين الدهني صفار (الخضراء) داخل الخلايا يمكن بسهولةيليه.
الشكل 1: الإعداد البصرية SPIM تتألف من الإضاءة والكشف وحدات، الأمامي وجهات النظر أسفل. في وحدة الإضاءة والليزر جنبا إلى جنب بواسطة المرايا مزدوج اللون دخول AOTF، التي تسيطر على السلطة من كل الليزر بشكل مستقل. ثم، التلسكوب يزيد حجم شعاع بنسبة 4 أضعاف وبيريسكوب يجلب إلى ارتفاع المجهر. عدسة اسطوانية تشكل ورقة الضوء، الذي هو تركيز من قبل الهدف الإضاءة. تم دمج وحدة الكشف في المجهر تستقيم ويتكون أساسا من عدسة الكشف والتصفية، أنبوب العدسة وEMCCD. يتم وضع العينة في التقاطع بين الإضاءة والكشف عن المسارات. يسمح مرحلة كهرضغطية العمودي (Z) النزوح من العينة لاقتناء 3D.
الشكل 2: حامل كوفيت يتكون حامل من 3 صفائح الألمنيوم ومشدود على المسرح كهرضغطية. يقام كفيت الزجاج قبل الربيع (باللون الأحمر).
الرقم 3: تركيب بروتوكول C. الأجنة ايليجانس للتجارب SPIM. وهي مغلفة قطعة قطع من الزجاج مع بولي-L-يسين. يتم وضع وسادة من أجار على السطح المطلي. ثم يضاف بولي-L-يسين على لوحة أجار. أخيرا، C. يتم محاذاة ايليجانس الأجنة على بولي-L-يسين المغلفة لوحة أجار.
ther.within صفحة = "دائما"> 
الشكل 4: حامل العينة. حامل يناسب للأبعاد الداخلية للكفيت الزجاج. اثنين من الينابيع (باللون الأحمر) عقد شريحة زجاجية (موضح في الشكل 3). ثم يتم وضع هذا حامل داخل كفيت الزجاج.
الرقم 5:. حامل عينة في سياق المراقبة ويجمد الأجنة على شريحة زجاجية وفقا لخصت البروتوكول حتى في الشكل 3 يقام الشريحة من قبل صاحب العينة هو موضح في الشكل (4) يتم إدراج صاحب العينة في كوفيت الزجاج، عقدت من قبل صاحب موضح في الشكل 2. ورقة الضوء الأفقي وطlluminates الأجنة من الجانب. عدسة الهدف هو الكشف العمودي، فوق العينة.
الرقم 6: تسجيل من C. ايليجانس الجنين إبداء الانصهار هيستون :: GFP الصور طائرة واحدة من الجنين وراثيا إبداء هيستون :: الانصهار GFP (zuIs178؛ stIs10024) في نقاط زمنية مختلفة الصور المستخرجة من تسجيل الوقت الفاصل 3D:. مداخن مصنوعة من شرائح 20 ( المسافة بين شرائح 1 ميكرون)؛ زمن التعرض لكل شريحة: 30 ميللي ثانية؛ الفاصل الزمني بين أكوام: 37 ثانية؛ مجموع اكتساب الوقت: 2 ساعة. السهم: نواة interphasic، رأس السهم: مكثف لونين الإنقسامية. في ر = 0 دقيقة الجنين في مرحلة 2 خلية وعلى ر = 120 دقيقة الجنين يحتوي على حوالي 70 الخلايا كما هو متوقع في ظل ق التنموية العاديةتبول (لاحظ أن فقط الخلايا الواردة في طائرة واحدة واضحة في الصور وليس كل خلايا الجنين). كانت قوة الإضاءة 30 μW في 488 نانومتر (تقاس في الخروج من الهدف إضاءة). الرجاء النقر هنا لعرض هذا الفيديو.
الرقم 7: تسجيل لC. ايليجانس الجنين تعبر عن تويولين :: الانصهار GFP وهيستون :: mCherry الانصهار. الصور المستخرجة من 3D الوقت الفاصل بين تسجيل لC. ايليجانس الجنين تعبر عن تويولين :: الانصهار GFP (ruIs57) وهيستون :: mCherry الانصهار (itIs37؛ stIs10226). ظروف التسجيل: الاستحواذ على كومة من 20 شرائح (المسافة بين شرائح 1ميكرون) كل 105 ثانية؛ مجموع اكتساب الوقت: 16 دقيقة؛ وقت التعرض: 200 ميللي ثانية لكل قناة. لوحة ويظهر 10 شرائح من نفس كومة. يظهر لوحة ب نفس شريحة كل 210 ثانية. كانت قوة الإضاءة 30 μW و 300 μW، ل488 و 561 نانومتر ليزر، على التوالي (قياس في الخروج من الهدف إضاءة). الرجاء النقر هنا لعرض هذا الفيديو.
الرقم 8: تسجيل من C. ايليجانس الجنين تعبر عن VIT-2 :: GFP الانصهار والتي تستهدف غشاء mCherry. الصور المستخرجة من 3D الوقت الفاصل بين تسجيل لC. ايليجانس الجنين تعبر عن الانصهار VIT-2 :: GFP (PWIS23) وmCherry التي تستهدف الغشاء (ltIs44). شروط تسجيل: الاستحواذ على كومة من 10 شرائح (المسافة بين شرائح 1 ميكرون) كل 30 ثانية؛ مجموع اكتساب الوقت: 25 دقيقة؛ زمن التعرض لكل قناة: 200 ميللي ثانية. لوحة ويظهر شرائح الأولى من نفس كومة 5. يظهر لوحة ب نفس شريحة كل 30sec. الرجاء النقر هنا لعرض هذا الفيديو.
Discussion
يصف هذا البروتوكول وسهلة الإعداد المجهر ضوء ورقة لفي الجسم الحي التصوير من C. ايليجانس الأجنة. العناصر البصرية الضرورية لإنشاء ومحاذاة الورقة الضوء، بما في ذلك أشعة الليزر، وشعاع المتوسع، إيزاء وعدسات التركيز، ويمكن تركيبه بسهولة على مقاعد البدلاء البصرية. في تركيبة مع المجهر تستقيم لمسار كشف والكاميرا، وهذا يوفر حلا بسيطا لإعداد ورقة المجهر الخفيفة.
هذه الهندسة يجعل البيئة عينة بسيطة. يتم وضع العينة يعيشون في كوفيت الزجاج، والذي يقام المتمركزة وانتقلت من مجموعة صغيرة من القطع الميكانيكية. كما الإضاءة رقة المجهري هو أسلوب حقل واسع مع باجتزاء القدرة، مطلوب فقط محور واحد آلية الحركة للتصوير 3D. وهذا يحد من شرط التزامن إلى عنصر واحد المسح الضوئي ويسهل تطوير البرمجيات. مقارنة iSPIM 6 دينا geomet تستقيمراي يسمح باستخدام عدسة الهدف NA عالية للكشف. مقارنة مع الاجهزة SPIM مع العدسات الهدف في المستوى الأفقي وتركيب العينة والتصوير من سلسلة من الأجنة هي أسهل. تماما، وتنفيذ هذه التقنية واضحة ومباشرة، ويمكن أن يتحقق مع القليل الخبرة في مجال البصريات. هذا هو بديل أرخص لالمجاهر مبائر مع مزايا أعلى سرعة وانخفاض الضيائية ولكن العيب قرار المحوري أقل.
نحن أيضا تطوير وسيلة سهلة وقابلة للتكرار لجبل C. الأجنة ايليجانس لفي الجسم الحي التصوير باستخدام هذا النظام. الإجراء تصاعد سريع (15 دقيقة) وغير مناسبة لإجراء التجارب اليومية. لC. ايليجانس التصوير، ومزايا هذا الإعداد بسيطة ما لا يقل عن اثنين من طيات: (ط) في التصوير توتو هو ممكن من دون دوران، وبالتالي إعادة الإعمار 3D واضح وصريح؛ (ب) عينة من السهل تركيب والأجنة متعددة ولا يمكن تصوير بالتسلسلعلى نفس الشريحة. أظهرنا أمثلة من الأفلام الوقت الفاصل بين لقرار الزمنية كافية لمراقبة انقسامات الخلية ويتغير شكل الخلية. قوة المجهر ضوء ورقة لدراسة C. التنمية ايليجانس كما تم توضيح مؤخرا من قبل الآخرين 6، 7، 8، ولذلك فإن هذا الأسلوب أن تكون مفيدة جدا لدراسة التشكل والزخرفة من C. ايليجانس الجنين.
يمكن لهذا النظام أيضا أن تستخدم لتحليل تطور الكائنات نموذج آخر؟ من المهم أن ندرك أن تنفيذ ورقة إضاءة المجهر لكائن صغير وشفافة مثل C. ايليجانس أقل صرامة من لكائنات أكبر مثل أجنة ذبابة الفاكهة. في التصوير جملة وتفصيلا من ذبابة الفاكهة يتطلب عادة التناوب ومتعددة بغية إعادة بناء 9، 10. الإثارة من الجانبين مع خط واحد العدسات الهدف الإثارة يمكن أيضا تقليل تأثيرات الظل الناجمة عن attenuatايون الضوء 11. حتى الآن، والإعداد المقدمة هنا لا تزال تتكيف مع الجانب صورة واحدة من أجنة ذبابة الفاكهة، مع انخفاض تبيض وانخفاض photoxicity. هذا الإعداد يمكن أن تكون مفيدة لصورة أجنة صغيرة وشفافة مثل المزقييات أو الزرد أيضا.
Disclosures
والكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
نشكر جميع أعضاء Lenne ومختبرات برتراند، ولا سيما اوليفييه بلان لتطوير البرمجيات وجيريمي Capoulade للمناقشة. نشكر أيضا مرفق التصوير PICsL-IBDM، ولا سيما كلود موريتي وبرايس Detailleur للدعم التقني.
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من ATIP CNRS (لP.-FL وVB)، وLabex إنفورم منحة (لP.-FL وVB) ومنحة من شركة سانوفي أفنتيس (لVB). نحن نعترف البنية التحتية فرانس BioImaging بدعم من الوكالة الوطنية دي لا بحوث (ANR-10-INSB-04-01، والدعوة "INVESTISSEMENTS كوت أفينير").
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SPIM | |||
| Detection | |||
| upright microscope | ZEISS | Axiophot 1 | |
| 100x W objective (NA 1.1, W.D. 2.5mm) | NIKON | ||
| EMCCD back illuminated | ANDOR | DU-885K-CS0-#VP | |
| Illumination | |||
| LASER 488 nm / 60 mW | TOPTICA | iBeam smart | |
| LASER 405 nm / 120 mW | TOPTICA | iBeam smart | |
| LASER 561 nm / 500 mW | COBOLT | JIVE 500 | for time lapse imaging, 50 or 100mW is enough |
| filter Quad line laser rejectionband ZET 405/488/561/638 | AHF | F57-405 | |
| Dichroic 405 | AHF | F38-405 | |
| Dichroic 488 | SEMROCK | Di01-R488 | |
| AOTF | AA | AOTFnC-400.650-TN | |
| mirror | |||
| lens 50 mm | THORLABS | telescope 5X | |
| lens 200 mm | THORLABS | telescope 5X | |
| periscope | THORLABS | RS99/M | |
| cylindrical lens f=100mm | THORLABS | ACY254-100-A | |
| 10X NA 0,3 | NIKON | ||
| xyz stage | NEWPORT | ||
| Sample | |||
| Bacto Agar | Bectkton Dickinson | 214010 | 5% in water |
| Poly-L-Lysine solution | Sigma | P8920 | |
| Capillaries GC100F-10, 1.0mm oD, 0,58mm ID, 100 mm L | Havard Appartus | 30-0019 | |
| Aspiration tube (mouth pipette) | Dutsher | 55005 | |
| M9 medium: | |||
| KH2PO4 (3g/L) | Any supplier | ||
| Na2HPO4 (6g/L) | Any supplier | ||
| NaCL (5g/L) | Any supplier | ||
| MgSO4 (1 mM final) | Any supplier | ||
| cuvette holder | HOME MADE | made by Brice Detailleur | |
| sample holder | HOME MADE | made by Claude Moretti | |
| x stage | NEWPORT | ||
| coverslip 50x20x1 mm | MARIENFELD | cut then in 10x20x1mm | |
| piezo electric stage with amplifier/controller | PI | P-622.ZCD / E-625.CR | |
| cuvette 40mmx40mmx10mm | HELLMA | 704.002-OG.40 mm- 10mm high | |
| Diamond Point Glass Marking Pencil | VWR | ||
| Software | |||
| C++ (Qt) home made software | developed by Olivier Blanc and Claire Chardès, available on request. Alternative solutions: micromanager or labview | ||
References
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305, 1007-1009 (2004).
- Huisken, J., Stainier, D. Y. Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology. Development. 136, 1963-1975 (2009).
- Reynaud, E. G., Krzic, U., Greger, K., Stelzer, E. H. Light sheet-based fluorescence microscopy: more dimensions, more photons, and less photodamage. HFSP J. 2, 266-275 (2008).
- Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Dev Biol. 100, 64-119 (1983).
- Hardin, J. Imaging embryonic morphogenesis in C. elegans. Methods Cell Biol. 106, 377-412 (2011).
- Wu, Y., et al. Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 17708-17713 (2011).
- Giurumescu, C. A., Kang, S., Planchon, T. A., Betzig, E., Bloomekatz, J., Yelon, D., Cosman, P., Chisholm, A. D. Quantitative semi-automated analysis of morphogenesis with single-cell resolution in complex embryos. Development. 139, 4271-4279 (2012).
- Gao, L., Shao, L., Higgins, C. D., Poulton, J. S., Peifer, M., Davidson, M. W., Wu, X. F. Noninvasive Imaging beyond the Diffraction Limit of 3D Dynamics in Thickly Fluorescent Specimens. Cell. 151, 1370-1385 (2012).
- Krzic, U., Gunther, S., Saunders, T. E., Streichan, S. J., Hufnagel, L. Multiview light-sheet microscope for rapid in toto imaging. Nat Methods. 9, 730-733 (2012).
- Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy. Nat Methods. 9, 755-763 (2012).
- Huisken, J., Stainier, D. Y. Even fluorescence excitation by multidirectional selective plane illumination microscopy (mSPIM). Opt Lett. 32, 2608-2610 (2007).
