Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Het opzetten van een eenvoudige Light Sheet Microscope voor Published: May 5, 2014 doi: 10.3791/51342
* These authors contributed equally

Summary

Dit protocol beschrijft de installatie van een lichte plaat microscoop en de uitvoering ervan in vivo beeldvorming van C. elegans embryo's.

Abstract

Snelle en lage fototoxiciteit beeldvormende technieken voorwaarde voor de ontwikkeling van organismen in toto bestuderen. Licht vel gebaseerd microscopie vermindert fotoblekingsreactie en fototoxische effecten in vergelijking met confocale microscopie, terwijl het verstrekken van 3D-beelden met subcellulaire resolutie. Hier presenteren we de opstart van een lichtwaaier gebaseerd microscoop, die bestaat uit een rechtopstaande microscoop en een kleine set van opto-mechanische elementen voor het genereren van de lichtwaaier. Het protocol beschrijft hoe te bouwen, lijnt de microscoop en karakteriseren het licht vel. Bovendien beschrijft hoe de methode te implementeren in toto beeldvorming van C. elegans embryo's met behulp van een eenvoudige observatie kamer. De methode maakt het vastleggen van 3D-twee-kleuren time-lapse filmpjes meer dan enkele uren van ontwikkeling. Dit zou het volgen van celvorm, celdelingen en gemerkte eiwitten gedurende lange tijd te verlichten.

Introduction

De vorming en de vorming van een organisme omvat cel bewegingen, veranderingen cel vorm, celdeling en celdifferentiatie. Inzicht in de progressie en de coördinatie van deze processen vereisen een snelle imaging-tools met drie-dimensies vermogen en subcellulaire resolutie. Onder de technieken met deze in vivo imaging-mogelijkheden, licht blad verlichting microscopie ook wel single / selectieve vliegtuig verlichting microscopie heeft het unieke voordeel van het produceren van low-fototoxische effecten en lage-fotobleking 1,2.

In sheet verlichting microscopie wordt het monster verlicht van opzij door een lichtbron blad dat de optische sectie uitvoert. De verlichting pad en de detectie pad loodrecht op elkaar en de lichtwaaier is uitgelijnd om samen te vallen met het doel brandvlak van de detectie objectieflens. Het monster wordt geplaatst op het snijpunt van de twee paden, eennd kan langs de detectie as worden verplaatst naar 3D-beelden mogelijk te maken. Slechts het vlak van belang wordt verlicht en alle punten van dit vlak worden gedetecteerd op hetzelfde moment. Dit verhoogt de opnamesnelheid en vermindert fotobleken en fototoxiciteit in vergelijking met confocale microscopie 3.

Praktisch, blad verlichting microscopie is eenvoudig te installeren en align: voor twee dimensionale beeldvorming, geen scannen is noodzakelijk noch voor de detectie deel, noch voor de verlichting deel; als een wide-field techniek met het snijden vermogen, kunnen driedimensionale beelden worden verkregen door een enkele as beweging van het podium met het monster.

Hier presenteren we het opzetten van een eenvoudige lichte plaat microscoop en de uitvoering ervan in toto beeldvorming van C. elegans embryo's. C. elegans embryo's zijn zeer geschikt om te leven in vivo imaGing door hun transparantie, invariante afstamming en stereotiepe cel positioneert 4,5. De ontwikkelde lichtwaaier installatie is gebaseerd op een standaard microscoop rechtop voor detectie. De hieronder gepresenteerde protocol beschrijft hoe te bouwen en af ​​te stemmen de excitatie module / pad, testen en karakteriseren van de lichte plaat en monteer het monster voor 3D-beeldvorming. Het geeft ook voorbeelden van time-lapse filmpjes verworven met de opstelling die op verschillende stammen die fluorescente markers.

Protocol

1. Instellen van de Light Sheet en de detectie Pad

Figuur 1 geeft een algemene regeling van de optische opstelling.

  1. Plaats en bevestig de microscoop en de lasers op de optische tafel.
  2. Combineer laser 488 nm, 561 nm en 405 nm met de bijbehorende dichroitische spiegels. Na de dichroïsche spiegels, de lasers moet nauwkeurig samen uitgelijnd. NB: De keuze van de laser-golflengten, dichroïsche spiegels en optische filters wordt bepaald door de absorptiespectra van de specifieke fluorescerende labels gebruikt in de experimenten.
  3. Plaats de akoestisch-optische afstembare filter (AOTF). Gebruik de test plaat die door de leverancier aan de frequentie en de kracht van de AOTF passen. Wanneer goed uitgelijnd, wordt ongeveer 90% van het laservermogen op maximaal tuning uitgezonden gemeten door een PowerMeter. Merk op dat sommige lasers kan volledig worden geregeld door software die de AOTF overbodig kunnen maken.
  4. Plaats en bevestigde telescoop. Merk op dat de telescoop bestaat uit twee lenzen die de bundel breiden tot een breedte gelijk aan of groter dan de diameter van de achterkant van het belichtingsstelsel objectieflens. De lens met de kleinste brandpuntsafstand moet eerst komen.
  5. Plaats, het richten en bevestig de periscoop te brengen boven de optische weg dichter bij de achterkant opening van de cilindrische lens. Merk op dat de twee spiegels van de periscoop zodanig dat de lange as tot op de helling van de spiegel, teneinde de volledig geëxpandeerde bundel tijdens zijn gemonteerd.
  6. Plaats de cilindrische lens naast de uitgang periscoop. Merk op dat de cilindrische lens focusseert de bundel in een richting en laat het gecollimeerd in de andere richting, waardoor een lichte folievormingswerkwijze.
  7. Heroriëntatie van het resulterende licht blad met behulp van de verlichting objectief. Merk op dat het beeld brandpunt van de verlichting doel moet samenvallen met het voorwerp brandpunt van de objectieve detectie. Projecteer de balkop een scherm (bijvoorbeeld een wand) op grote afstand. Beweeg de verlichting doel langs de belichtingsbundel as te verkrijgen op het scherm scherpe contouren van het licht vel.
  8. Plaats de quad lijn (405/488/561/638) emissie-filter in de plaats gereserveerd in de microscoop (kubus).
  9. Plaats de EMCCD camera op de microscoop uitgang.
  10. Bevestig de eerste handmatige vertaling etappe op de microscoop podium door middel van schroeven in gaten geboord in de microscoop podium. Merk op dat de rand van de translatietrap moet worden geplaatst op ongeveer 2 cm van het midden van de microscoop podium, zodat de cuvet wordt gecentreerd onder de detectiegrens objectieflens.
  11. Bevestig de tweede handmatige vertaling etappe op de eerste. De richtingen van de twee fasen loodrecht (X en Y vertalingen) te zijn.
  12. Bevestig de Z piëzo-elektrische fase aan de bovenkant van de twee vorige fasen. Merk op dat een gemotoriseerde fase kan worden gebruikt in plaats van de piëzo-elektrische fase.
  13. Bevestig de cuvet Holder (zie figuur 2) aan de bovenzijde van de fasen. De cuvette wordt dus geplaatst op het snijpunt van het belichtingsstelsel pad en het detectiepad, die loodrecht op elkaar staan.

2. Controle van de Light Sheet

  1. Vul een glas cuvet met fluorescerende oplossing, en plaats het op de monsterhouder op het snijpunt van de twee optische paden. Het licht plaat is dus zichtbaar. Het heeft horizontaal zijn en symmetrisch / gecentreerd ten opzichte van de detectie objectieflens.
  2. Verwijder de cilindrische lens en het verwerven van een afbeelding om de dikte van de plaat licht te meten. Merk op dat de dikte van de lichtwaaier afhankelijk van de numerieke apertuur (NA) van het belichtingsstelsel objectieflens (ongeveer 3-4 urn voor NA = 0,3). Merk op dat voor een gegeven lens, kan de dikte van de licht-plaat worden verhoogd door de grootte van de bundel via de achterkant opening met een spleet. Merk op dat fluorescerende microbolletjes kunnen worden gebruikt om de as te metenial en laterale resolutie van de microscoop.
  3. Plaats de cilindrische lens terug voordat het experiment.

3. De montage van C. elegans embryo

De volgende stappen zijn afgebeeld in figuur 3.

  1. Gebruik een diamant-markering pen om een ​​stuk van een glasplaatje van 10 x 20 x 1 mm snijden.
  2. Bereid 5% bacto-agar in water, koken en te onderhouden in een verwarmingsblok bij 60 ° C.
  3. Voeg 50 ul van poly-L-lysine aan een zijde van het losse stuk dia laten drogen.
  4. Plaats een microscoop dia op de bank en zet het vast.
  5. Naast elkaar de gesneden stuk van dia met de vaste glijbaan en voeg een druppel gesmolten agar op de bovenkant. Knijp de agar met een andere schone microscoopdia een dunne agarkussen verkrijgen.
  6. Laat de agar pad te drogen voordat u de bovenste schuif.
  7. Snijd de agar pad op de zijde van het vaste slede om een ​​overmaat van ongeveer 3 mm o verlatenf agar en verwijder voorzichtig de vaste glijbaan.
  8. Voeg 50 ul van poly-L-lysine op de agar en laat het drogen.
  9. Zet gravid wormen in M9 medium in een horlogeglas.
  10. Snijd de wormen op het niveau van de vulva met een scalpel om de embryo's vrij.
  11. Onder een binoculair identificeren embryo's in het stadium plaats en verzamelen met een microcapillaire pipet.
  12. Plaats de embryo's van de kant van de agar bekleed met poly-L-lysine die uitsteekt uit de losse stuk dia. Plaats de embryo's net naast de rand van de dia. Laat de embryo's niet te plaatsen op de grens van de agar, omdat ze niet stabiel genoeg zal zijn. Verwijder voorzichtig de vloeistof, zodat de embryo's blijft plakken op de poly-L-lysine laag.
  13. Snel uitlijnen van de embryo's om uitdroging te voorkomen.
  14. Leg de gesneden dia in een plastic petrischaal en voeg zachtjes M9 medium om de dia te dekken.
  15. Controleer onder een binoculaire dat de eieren nog steeds vast aan de agar.

    4. Registratie van C. elegans Ontwikkeling

    1. Bevestig de vorige voorbereiding (cut glijbaan, agar plus embryo's) in het monster houder en plaats het in een cuvet. Figuur 4 beschrijft de zelfgemaakte houder en Figuur 5 toont een mening van de cuvet in observatie context.
    2. Bevestig de cuvette op de piëzo-elektrische podium.
    3. Identificeer de positie van de embryo's met helderveld.
    4. Start de zelfgemaakte software regelen van de AOTF, de camera en de piëzo-elektrische podium. Merk op dat een vrije software, zoals micromanager, kunnen ook worden gebruikt.
    5. Selecteer de laser lijn en vermogen (AOTF).
    6. Pas de positie van het licht plaat met behulp van de 3 richtingen stadium ondersteuning van de cilindrische lens en de verlichting lens. Beweeg de fase langs de laterale richting (X) de helderste signaal te verkrijgen. Pas dan is de Z-positie van de licht opgenomen, en de longitudinale positie (Y) om e te verkrijgene beste signaal-ruisverhouding. Merk op dat de positie van de lichtwaaier aandacht moet worden aangepast van een embryo naar elkaar verschillen gezien weglengte corrigeren.
    7. Om time-lapse beelden verwerven, selecteer de belichtingstijd, winnen, tijd tussen twee beelden, evenals het aantal beelden te verkrijgen, en het laservermogen. Voor 2 kleuren overname, selecteert u een tweede laserlijn. Twee kleuren beelden worden na elkaar verworven.
    8. Om az stack te verwerven, de afstand tussen de twee plakken, en de begin-en eindpositie van de piëzo-elektrische kiezen ook.

Representative Results

Drie 3D time-lapse opname experimenten uit drie verschillende C. elegans stammen illustreren de aard van de gegevens die kunnen worden verkregen met behulp van het licht vel microscoop setup hierboven beschreven. Checkten we dat onder deze omstandigheden ontwikkelt het embryo zich op normale snelheid en overleven de beeldvorming, in overeenstemming met eerdere rapporten waaruit blijkt dat SPIM beeldvorming leidt slechts lage fototoxiciteit niveaus in C. elegans embryo 6,7.

De eerste stam drukt een histon gefuseerd met GFP (zuIs178; stIs10024). De opname werd uitgevoerd gedurende 2 uur met een stapel 20 segmenten (afstand tussen plakken 1 um) die elke 37 sec. Figuur 6 toont een vlak van de stapel op verschillende tijdstippen. Beide interfase kernen (pijl) en gecondenseerde mitotische chromatine (pijlpunt) zijn duidelijk zichtbaar.

De tweede stam drukt een tubuline gefuseerd met GFP (ruIs57) en een histongefuseerd met mCherry (itIs37; stIs10226). De opname werd uitgevoerd gedurende 16 min met een stapel 20 segmenten (afstand tussen plakken 1 um) die elk 105 sec. Figuur 7 illustreert verschillende vlakken van de stapel en verschillende tijdstippen. De bijbehorende film 1 toont 3D-reconstructies op 3 opeenvolgende tijdstippen. Tijdens divisie, de mitotische spindel (groen) en gecondenseerde chromosomen (rood) zijn duidelijk zichtbaar waardoor het volgen van de celdeling oriëntaties tijdens de ontwikkeling.

De derde stam drukt de apolipoproteïne VIT-2 gefuseerd met GFP (pwIs23) en een membraan gebonden mCherry (ltIs44). De opname werd uitgevoerd gedurende 25 min met een stapel van 10 schijven (afstand tussen plakken 1 um) die elke 30 sec. Figuur 8 illustreert verschillende vlakken van de stapel en verschillende tijdstippen. De snelle bewegingen van de dooier lipoproteïne deeltjes (groen) in de cellen kan gemakkelijkgevolgd.

Figuur 1
Figuur 1: SPIM optische opstelling bestaat uit de verlichting en detectie-eenheden, voor-en onderkant uitzicht. In de verlichtingseenheid de lasers gecombineerd door de dichroïsche spiegels alstublieft de AOTF, die de kracht van elke laser onafhankelijk bestuurt. Vervolgens wordt de telescoop neemt de grootte van de bundel van 4-voudige en periscoop brengt het aan de hoogte van de microscoop. De cilindrische lens vormt het licht blad, dat wordt geheroriënteerd door de verlichting doelstelling. De detectie-eenheid is geïntegreerd in verticale microscoop en wordt hoofdzakelijk samengesteld door de detectie lens, het filter, de buis lens en EMCCD. Het monster wordt geplaatst op de kruising tussen de verlichting en detectie paden. Piëzoëlektrische fase kan verticaal (Z) verplaatsingen van het monstervoor 3D-acquisitie.

Figuur 2
Figuur 2:. Cuvethouder De houder bestaat uit 3 aluminium platen en is geschroefd op de piëzo-elektrische podium. De glazen kuvet wordt gehouden door een veer (in rood).

Figuur 3
Figuur 3: Montage protocol van C. elegans embryo's voor SPIM experimenten. Een gesneden stuk glas is bekleed met poly-L-lysine. Een kussen van agar wordt op het beklede oppervlak. Poly-L-lysine wordt vervolgens toegevoegd aan de agar pad. Tenslotte C. elegans embryo's worden aangepast aan de poly-L-lysine gecoate agarkussen.


Figuur 4: Voorbeeld houder. De houder past bij de inwendige afmetingen van het glas cuvet. Twee veren (in rood) houden het glaasje (beschreven in figuur 3). Deze houder wordt vervolgens in het glas cuvet.

Figuur 5
Figuur 5:... Monsterhouder de waarneming context Embryo's worden geïmmobiliseerd op het glaasje volgens het protocol samengevat in Figuur 3 De slede wordt gehouden door de monsterhouder in figuur 4 beschreven De monsterhouder in het glas cuvet geplaatst, gehouden door de in figuur 2 beschreven houder. Het licht blad horizontale en illuminates de embryo's van de zijkant. De detectie objectieflens verticaal, boven het monster.

Figuur 6
Figuur 6: De opname van een C. elegans embryo uitdrukking brengen van een histon :: GFP fusie Single vliegtuig beelden van een transgene embryo uitdrukking brengen van een histon :: GFP fusie (zuIs178; stIs10024) op verschillende tijdstippen Beelden gewonnen uit een 3D time-lapse-opname:.. stapels gemaakt van 20 plakken ( afstand tussen plakjes 1 micrometer); belichtingstijd per plakje: 30 ms; tijdsinterval tussen de stapels: 37 sec; totale acquisitie tijd: 2 uur. Arrow: interfase kern, pijlpunt: gecondenseerd mitotische chromatine. Op t = 0 min het embryo is de 2-cel stadium en op t = 120 min de embryo bevat ongeveer 70 cellen zoals verwacht onder normale ontwikkeling enpeed (Alleen de cellen die in een enkel vlak zijn zichtbaar in de foto's en niet alle cellen van het embryo). De kracht van verlichting was 30 μW bij 488 nm (gemeten bij de uitgang van de verlichting doel). Klik hier om deze video te bekijken.

Figuur 7
Figuur 7: Opname van een C. elegans embryo uitdrukken van een Tubuline :: GFP fusie en een histon :: mCherry fusie. Beelden gewonnen uit een 3D time-lapse opname van een C. elegans embryo uitdrukken van een Tubuline :: GFP fusie (ruIs57) en een histon :: mCherry fusie (itIs37; stIs10226). Opnameomstandigheden: verwerving van een stapel van 20 schijfjes (afstand tussen plakjes 1um) iedere 105 seconden; totale acquisitie tijd: 16 min; belichtingstijd: 200 msec voor elk kanaal. Panel een toont 10 plakjes van dezelfde stapel. Paneel B toont dezelfde plak elke 210 sec. De kracht van verlichting was 30 μW en 300 μW, voor 488 en 561 nm lasers, respectievelijk (gemeten bij de uitgang van de doelstelling verlichting). Klik hier om deze video te bekijken.

Figuur 8
Figuur 8: De opname van een C. elegans embryo uitdrukken van een VIT-2 :: GFP fusie en een membraan-gerichte mCherry. Beelden gewonnen uit een 3D time-lapse opname van een C. elegans embryo uitdrukken van een VIT-2 :: GFP-fusie (PWIS23) en een membraan gerichte mCherry (ltIs44). Opnameomstandigheden: verwerving van een stapel van 10 schijven (afstand tussen plakjes 1 micrometer) om de 30 seconden; totale acquisitie tijd: 25 min; belichtingstijd per kanaal: 200 msec. Paneel een toont de 5 eerste plakjes van dezelfde stapel. Paneel B toont dezelfde slice elke 30sec. Klik hier om deze video te bekijken.

Discussion

Dit protocol beschrijft een eenvoudige setup van licht blad microscopie voor in vivo beeldvorming van C. elegans embryo's. De optische elementen noodzakelijk maken en lijn het licht daarin opgenomen lasers, straalexpander collimatie en focusseerlenzen kan gemakkelijk worden gemonteerd op een optische bank. In combinatie met een rechtopstaande microscoop voor de detectie pad en de camera, biedt dit een eenvoudige oplossing voor het inrichten van een lichtwaaier microscoop.

Deze geometrie maakt het monster omgeving eenvoudig. De levende monster wordt geplaatst in een glazen cuvet, die wordt gehouden, gepositioneerd en bewogen door een kleine set van mechanische onderdelen. Zoals sheet verlichting microscopie is een breed veld techniek met het snijden vermogen, wordt slechts een enkele as gemotoriseerd verkeer nodig voor 3D-beeldvorming. Dit beperkt de vereiste synchronisatie een enkel aftastorgaan en faciliteert softwareontwikkeling. Vergeleken met ISPIM 6 onze rechtop geometry maakt het gebruik van hoge NA objectieflens voor detectie. Vergeleken met SPIM opstellingen met objectieven in het horizontale vlak de montage van het monster en de beeldvorming van een reeks embryo gemakkelijker. Totaal de uitvoering van deze techniek is eenvoudig en kan worden bereikt met weinig ervaring in de optica. Dit is een goedkoper alternatief voor confocale microscopen met de voordelen van een hogere snelheid en verminderde fototoxiciteit maar nadeel van een lagere axiale resolutie.

We ontwikkelden ook een gemakkelijke en reproduceerbare manier te monteren C. elegans embryo in vivo beeldvorming met behulp van dit systeem. De montageprocedure is snel (15 minuten) en is geschikt voor dagelijks experimenten. Voor C. elegans beeldvorming, de voordelen van deze eenvoudige opstelling ten minste twee vouwen: (i) in zijn geheel beeldvorming mogelijk zonder rotatie en dus 3D reconstructie is eenvoudig; (Ii) sample montage is eenvoudig en meerdere embryo's kunnen opeenvolgend worden afgebeeldop dezelfde dia. We toonden voorbeelden van time-lapse filmpjes met voldoende temporele resolutie te celdelingen en veranderingen cel vorm waarnemen. De kracht van het licht vel microscopie aan C. studeren elegans ontwikkeling is onlangs ook geïllustreerd door anderen 6, 7, 8. Daarom zal deze techniek zeer nuttig zijn voor de morfogenese en patroonvorming van de C. bestuderen elegans embryo.

Dit systeem kan ook worden gebruikt om de ontwikkeling van andere modelorganismen analyseren? Het is belangrijk te erkennen dat de toepassing van plaatstaal verlichting microscopie voor kleine en transparante organismen zoals C. elegans is minder streng dan voor grotere organismen zoals Drosophila embryo's. In toto beeldvorming van Drosophila vereist normaal rotatie en multi-view reconstructies 9, 10. excitatie van twee kanten met collineair excitatie objectief lenzen mogen ook verlaagde de schaduw effecten veroorzaakt door de attenuation van het licht 11. Toch wordt de setup hier gepresenteerde steeds aangepast aan het ene kant van de Drosophila embryo's, met lage bleken en lage photoxicity. Deze opstelling kan ook nuttig zijn om de afbeelding kleine en transparante embryo's zoals zakpijpen of zebravis zijn.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Wij danken alle leden van de Lenne en Bertrand laboratoria, met name Olivier Blanc voor software ontwikkeling en Jeremie Capoulade voor discussie. We danken ook de PICsL-IBDM imaging faciliteit, in het bijzonder Claude Moretti en Brice Detailleur voor technische ondersteuning.

Dit werk werd ondersteund door subsidies van ATIP CNRS (naar P.-FL en VB), de Labex INFORM subsidie ​​(naar P.-FL en VB) en een subsidie ​​van Sanofi-Aventis (VB). Wij erkennen France-BioImaging infrastructuur ondersteund door de Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-InSb-04-01, roepen "Investissements d'Avenir").

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SPIM
Detection
upright microscope ZEISS Axiophot 1
100x W objective (NA 1.1, W.D. 2.5mm)  NIKON
EMCCD back illuminated ANDOR DU-885K-CS0-#VP
Illumination
LASER 488 nm / 60 mW TOPTICA iBeam smart
LASER 405 nm / 120 mW TOPTICA iBeam smart
LASER 561 nm / 500 mW COBOLT JIVE 500  for time lapse imaging, 50 or 100mW is enough
filter Quad line laser rejectionband ZET 405/488/561/638 AHF F57-405
Dichroic 405 AHF F38-405
Dichroic 488 SEMROCK Di01-R488
AOTF AA AOTFnC-400.650-TN
mirror
lens 50 mm THORLABS telescope 5X
lens 200 mm THORLABS telescope 5X
periscope THORLABS RS99/M
cylindrical lens f=100mm THORLABS ACY254-100-A
10X NA 0,3 NIKON
xyz stage NEWPORT
Sample
Bacto Agar Bectkton Dickinson 214010 5% in water
Poly-L-Lysine solution  Sigma P8920
Capillaries GC100F-10, 1.0mm oD, 0,58mm ID, 100 mm L Havard Appartus 30-0019
Aspiration tube (mouth pipette) Dutsher 55005
M9 medium:
KH2PO4 (3g/L) Any supplier
Na2HPO4 (6g/L) Any supplier
NaCL (5g/L) Any supplier
MgSO4 (1 mM final) Any supplier
cuvette holder HOME MADE made by Brice Detailleur 
sample holder HOME MADE made by Claude Moretti 
x stage NEWPORT
coverslip 50x20x1 mm MARIENFELD cut then in 10x20x1mm
piezo electric stage with amplifier/controller PI P-622.ZCD / E-625.CR
cuvette 40mmx40mmx10mm HELLMA 704.002-OG.40 mm- 10mm high
Diamond Point Glass Marking Pencil VWR
Software
C++ (Qt) home made software developed by Olivier Blanc and Claire Chardès, available on request. Alternative solutions: micromanager or labview 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305, 1007-1009 (2004).
  2. Huisken, J., Stainier, D. Y. Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology. Development. 136, 1963-1975 (2009).
  3. Reynaud, E. G., Krzic, U., Greger, K., Stelzer, E. H. Light sheet-based fluorescence microscopy: more dimensions, more photons, and less photodamage. HFSP J. 2, 266-275 (2008).
  4. Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Dev Biol. 100, 64-119 (1983).
  5. Hardin, J. Imaging embryonic morphogenesis in C. elegans. Methods Cell Biol. 106, 377-412 (2011).
  6. Wu, Y., et al. Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 17708-17713 (2011).
  7. Giurumescu, C. A., Kang, S., Planchon, T. A., Betzig, E., Bloomekatz, J., Yelon, D., Cosman, P., Chisholm, A. D. Quantitative semi-automated analysis of morphogenesis with single-cell resolution in complex embryos. Development. 139, 4271-4279 (2012).
  8. Gao, L., Shao, L., Higgins, C. D., Poulton, J. S., Peifer, M., Davidson, M. W., Wu, X. F. Noninvasive Imaging beyond the Diffraction Limit of 3D Dynamics in Thickly Fluorescent Specimens. Cell. 151, 1370-1385 (2012).
  9. Krzic, U., Gunther, S., Saunders, T. E., Streichan, S. J., Hufnagel, L. Multiview light-sheet microscope for rapid in toto imaging. Nat Methods. 9, 730-733 (2012).
  10. Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy. Nat Methods. 9, 755-763 (2012).
  11. Huisken, J., Stainier, D. Y. Even fluorescence excitation by multidirectional selective plane illumination microscopy (mSPIM). Opt Lett. 32, 2608-2610 (2007).

Tags

Developmental Biology Selectieve Plane Verlichting Microscopy Light Sheet,
Het opzetten van een eenvoudige Light Sheet Microscope voor<em&gt; In Toto</em&gt; Beeldvorming van<em&gt; C. elegans</em&gt; Ontwikkeling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chardès, C., Mélénec, More

Chardès, C., Mélénec, P., Bertrand, V., Lenne, P. F. Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development. J. Vis. Exp. (87), e51342, doi:10.3791/51342 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter