Summary
Ce protocole décrit la configuration d'une feuille microscope optique et sa mise en œuvre pour l'imagerie in vivo de C. elegans embryons.
Abstract
Techniques d'imagerie phototoxiques rapides et faibles sont pré-requis pour étudier le développement d'organismes dans sa totalité. Microscopie basée nappe de lumière réduit photo-blanchiment et les effets phototoxiques par rapport à la microscopie confocale, tout en fournissant des images en 3D avec une résolution subcellulaire. Ici, nous présentons la mise en place d'une feuille à base microscope optique, qui est composé d'un microscope droit et un petit ensemble d'éléments opto-mécaniques pour la production de la feuille de lumière. Le protocole décrit comment construire, aligner le microscope et de caractériser la nappe de lumière. En outre, il explique comment mettre en œuvre la méthode pour l'imagerie de toto de C. elegans embryons en utilisant une chambre d'observation simple. Le procédé permet la capture de deux couleurs 3D films time-lapse sur quelques heures de développement. Cela devrait faciliter le suivi de la forme des cellules, des divisions cellulaires et protéines marquées sur de longues périodes de temps.
Introduction
La formation et la mise en forme d'un organisme implique des mouvements cellulaires, les changements de forme cellulaire, la division cellulaire et la différenciation cellulaire. Comprendre l'évolution et de la coordination de ces processus nécessitent des outils d'imagerie rapide avec les trois dimensions et la capacité de résolution subcellulaire. Parmi les techniques in vivo avec ces capacités de l'imagerie, de la lumière éclairage microscopie feuille appelée aussi sélective unique microscopie / plan d'éclairage a l'avantage unique de produire des effets à faible phototoxique et bas-photoblanchiment 1,2.
Dans la feuille éclairage microscopie, l'échantillon est éclairé par le côté par une nappe de lumière, qui effectue le sectionnement optique. La voie d'éclairage et le trajet de détection sont perpendiculaires l'une à l'autre et de la nappe de lumière est aligné à coïncider avec le plan focal objet de la lentille d'objectif détection. L'échantillon est placé à l'intersection des deux trajets, une peut être déplacé le long de l'axe de détection pour permettre l'imagerie 3D. Seul le plan de l'intérêt est illuminée et tous les points de ce plan sont détectées en même temps. Cela augmente considérablement la vitesse d'acquisition et de réduire photoblanchiment ainsi que la phototoxicité par rapport à la microscopie confocale 3.
Pratiquement, la microscopie feuille d'éclairage est facile à installer et align: pour deux imagerie tridimensionnelle, aucun balayage est nécessaire ni pour la partie de détection, ni pour la partie de l'éclairage; comme une technique à grand champ avec sectionnement, l'imagerie en trois dimensions peut être obtenue par un déplacement d'axe unique de l'étage de maintien de l'échantillon.
Ici, nous présentons la mise en place d'un microscope simple de nappe de lumière et sa mise en œuvre pour l'imagerie de toto de C. elegans embryons. C. elegans embryons sont bien adaptés à vivre in vivo imaging en raison de leur transparence, de la lignée invariant et stéréotypée cellule positions 4,5. La configuration de la nappe de lumière développé est basé sur un microscope droit standard pour la détection. Le protocole présenté ci-dessous détaille la façon de construire et d'aligner le module d'excitation / chemin, tester et caractériser la nappe de lumière et de montage de l'échantillon pour l'imagerie 3D. Il fournit également des exemples de films time-lapse acquis avec l'installation sur différentes souches exprimant des marqueurs fluorescents.
Protocol
1. Mise en place de la nappe de lumière et le chemin de détection
La figure 1 donne un schéma général de l'installation optique.
- Placer et fixer le microscope et les lasers sur la table optique.
- Combinez lasers 488 nm, 561 nm et 405 nm avec des miroirs dichroïques correspondant. Après les miroirs dichroïques, les lasers doivent être précisément co-alignés. A noter que le choix des longueurs d'onde laser, des miroirs dichroïques et des filtres optiques est déterminée à partir des spectres d'absorption des marqueurs fluorescents spécifiques utilisés dans les expériences.
- Placer le filtre accordable acousto-optique (AOTF). Utilisez la feuille de test fourni par le fournisseur pour régler la fréquence et la puissance de la AOTF. Quand bien aligné, environ 90% de la puissance du laser est émis à un réglage maximal, telle que mesurée par un wattmètre. Notez que certains lasers peuvent être entièrement contrôlés par un logiciel, ce qui pourrait rendre la AOTF inutile.
- Placer et fixerle télescope. A noter que le télescope est constitué de deux lentilles qui élargissent le faisceau d'une largeur égale ou plus grande que le diamètre de l'ouverture arrière de la lentille d'objectif illumination. L'objectif avec la plus petite focale devrait venir en premier.
- Place, ajuster et fixer le périscope amener vers le haut du chemin optique plus près de l'ouverture arrière de la lentille cylindrique. A noter que les deux miroirs du périscope sont montés de manière que leur axe longitudinal s'étend sur l'inclinaison du miroir, afin de réfléchir le faisceau totalement expansée.
- Placer la lentille cylindrique à côté de la sortie de l'épiscope. A noter que la lentille cylindrique focalise le faisceau dans une direction et le laisse collimaté dans l'autre direction, en formant ainsi une nappe de lumière.
- Recentrer la feuille de lumière résultant en utilisant l'éclairage objectif. Notez que le point focal image de l'objectif d'éclairage devrait coïncider avec le point focal objet de l'objectif de détection. Projeter le faisceausur un écran (par exemple, un mur) à longue distance. Déplacer l'objectif d'illumination le long de l'axe du faisceau d'illumination afin d'obtenir des contours nets d'écran de la nappe de lumière.
- Placez la ligne de quad (405/488/561/638) de filtre d'émission à la place réservée au microscope (cube).
- Placer la caméra EMCCD à l'orifice de sortie du microscope.
- Fixer la première étape d'emploi de translation sur la platine du microscope par des vis dans des trous percés dans la platine du microscope. On notera que le bord de la platine de translation doit être positionné à environ 2 cm de distance depuis le centre de la platine du microscope, de sorte que la cuvette est centrée au-dessous de la lentille d'objectif détection.
- Fixer la deuxième étape manuel de traduction sur la première. Les directions des deux étapes doivent être perpendiculaires (X et Y) les traductions.
- Fixer le stade Z piézoélectrique au sommet des deux étapes précédentes. A noter qu'une platine motorisée peut être utilisé à la place de l'étage piézo-électrique.
- Fixer le holde de la cuvetter (voir figure 2) au sommet des étapes. La cuve va donc être placé à l'intersection de la voie d'éclairage et le trajet de détection, qui sont perpendiculaires l'une à l'autre.
2. Vérification de la nappe de lumière
- Remplir une cuve en verre avec une solution fluorescente, et le placer sur le porte-échantillon à l'intersection des deux trajets optiques. La nappe de lumière est donc visible. Il doit être horizontal et symétrique / centré par rapport à la détection de lentille d'objectif.
- Retirer la lentille cylindrique et d'acquérir une image de mesurer l'épaisseur de la nappe de lumière. A noter que l'épaisseur de la nappe de lumière dépend de l'ouverture numérique (NA) de la lentille d'objectif illumination (environ 4.3 um pour NA = 0,3). Notez que pour une lentille donnée, l'épaisseur de la feuille de lumière peut être augmentée en réduisant la taille du faisceau entrant dans l'orifice de retour avec une fente. Notez que microsphères fluorescentes peuvent être utilisés pour mesurer la hacheial et résolution latérale du microscope.
- Remettre la lentille cylindrique avant de commencer l'expérience.
3. C. Le montage d' elegans embryons
Les étapes suivantes sont illustrés dans la Figure 3.
- Utilisez un stylo de diamant marquage pour couper un morceau d'une lame de verre de 10 x 20 x 1 mm.
- Préparer Bacto-agar à 5% dans de l'eau, faire bouillir et le maintenir dans un bloc chauffant à 60 ° C.
- Ajouter 50 ul de poly-L-lysine sur un côté de la pièce de lame de coupe, le laisser sécher.
- Placez une lame de microscope sur le banc et le fixer.
- Juxtaposer le morceau de lame de coupe avec la lame fixe et ajouter une goutte d'agar fondu sur le dessus. Pressez la gélose en utilisant une autre lame de microscope propre pour obtenir un tampon d'agar mince.
- Laisser le pad agar sécher avant de retirer la lame supérieure.
- Découper la plaquette agar sur le côté de la lame fixe, afin de laisser un excès d'environ 3 mm oagar f et retirez délicatement la lame fixe.
- Ajouter 50 ul de poly-L-lysine sur l'agar et laissez sécher complètement.
- Mettez vers gravides dans un milieu M9 dans un verre de montre.
- Couper les vers au niveau de la vulve avec un scalpel pour libérer les embryons.
- En vertu d'un binoculaire identifier les embryons au stade de l'intérêt et de recueillir les à l'aide d'une pipette de micro-capillaire.
- Placer les embryons de la part de l'agar enduite de poly-L-lysine qui fait saillie de la pièce de lame de coupe. Placer les embryons juste à côté de la frontière de la diapositive. Ne placez pas les embryons à la frontière de l'agar-agar, car ils ne seront pas assez stable. Retirez doucement le liquide de sorte que les embryons vont coller sur la couche de poly-L-lysine.
- Aligner rapidement les embryons pour éviter la dessiccation.
- Placer la lame de coupe dans une boîte de Petri en plastique et ajouter doucement milieu M9 pour couvrir la diapositive.
- Vérifiez sous un binoculaire que les œufs sont encore coincés sur l'agar-agar.
4. Enregistrement de C. développement elegans
- Correction de la préparation précédente (lame de coupe, en plus de la gélose embryons) dans le porte-échantillon et le placer dans une cuvette. Figure 4 décrit le support fait maison et la figure 5 représente une vue de la cuvette dans le contexte d'observation.
- Fixer la cuvette sur la scène piézoélectrique.
- Identifier la position des embryons avec éclairage de champ lumineux.
- Démarrez le logiciel fait maison le contrôle de la AOTF, la caméra et la scène piézoélectrique. A noter qu'un logiciel libre, tel que microgestionnaire, peut également être utilisé.
- Sélectionnez la ligne de laser et la puissance (AOTF).
- Ajustez la position de la feuille de lumière en utilisant l'étape 3 directions support de la lentille cylindrique et la lentille d'éclairage. Déplacer la platine le long de la direction latérale (X) pour obtenir le signal lumineux. Ajuster ensuite la position Z de la nappe de lumière, et la position longitudinale (Y) pour obtenir ee meilleur rapport signal sur bruit. A noter que la position du foyer de la nappe de lumière peut être nécessaire de modifier d'un embryon à l'autre afin de corriger les différences de longueurs de trajet de lumière.
- Pour acquérir des images en accéléré, sélectionnez le temps d'exposition, le gain, le temps entre deux images, ainsi que le nombre d'images à acquérir, et la puissance du laser. Pour l'acquisition de couleur 2, sélectionnez une deuxième ligne de laser. Deux images couleurs sont acquises consécutivement.
- Pour acquérir pile de az, sélectionnez également la distance entre les deux tranches, et le début et la fin des positions de la piézo-électrique.
Representative Results
Trois expériences 3D d'enregistrement du temps de déchéance de trois C. différente elegans souches illustrent le type de données qui peut être obtenu en utilisant la configuration du microscope de nappe de lumière décrite ci-dessus. Nous avons vérifié que, dans ces conditions, les embryons se développent à une vitesse normale et survivent à l'imagerie, compatible avec des rapports antérieurs indiquant que l'imagerie SPIM provoque que de faibles niveaux de phototoxicité dans C. elegans embryons 6,7.
La première souche exprime une histone fusionnée à la GFP (zuIs178; stIs10024). L'enregistrement a été effectué pendant 2 heures avec un empilement de tranches 20 (distance entre les tranches 1 um) pris toutes les 37 sec. Figure 6 illustre un plan de la pile à différents points dans le temps. Les deux noyaux interphasiques (flèche) et la chromatine mitotique condensée (tête de flèche) sont clairement visibles.
La deuxième souche exprime un tubuline fusionnée à la GFP (ruIs57) et une histonefusionné à mCherry (itIs37; stIs10226). L'enregistrement a été effectué pendant 16 min avec un empilement de tranches 20 (distance entre les tranches 1 um) pris toutes les 105 secondes. Figure 7 illustre des plans différents de l'empilement et de différents points de temps. Le film associé une affiche reconstructions 3D à 3 points de temps successifs. Au cours de la division, le fuseau mitotique (vert) et les chromosomes condensés (rouge) sont clairement visibles permettant le suivi des orientations de la division cellulaire au cours du développement.
La troisième souche exprime l'apolipoprotéine VIT-2 fusionnée à la GFP (pwIs23) et une membrane lié mCherry (ltIs44). L'enregistrement a été effectué pendant 25 min avec un empilement de tranches 10 (distance entre les tranches 1 um) pris toutes les 30 secondes. Figure 8 illustre différents plans de l'empilement et de différents points de temps. Les mouvements rapides des particules de lipoprotéines jaune (vert) dans les cellules peuvent facilement êtresuivi.
Figure 1: Configuration optique SPIM composé des éclairage et de détection des unités, des vues de face et de fond. Dans l'unité d'éclairage, les lasers combinés par les miroirs dichroïques entrent dans le AOTF, qui commande la puissance de chaque laser indépendamment. Ensuite, le télescope augmente la taille du faisceau par 4 fois le périscope et le porte à la hauteur du microscope. La lentille cylindrique formant la nappe de lumière, qui est recentrée par l'objectif d'illumination. L'unité de détection est intégrée dans le microscope droit et se compose principalement par la lentille de détection, le filtrage, la lentille de tube et la EMCCD. L'échantillon est placé à l'intersection entre les chemins d'éclairement et de détection. Une étape piézoélectrique permet verticales (Z) des déplacements de l'échantillonpour l'acquisition 3D.
Figure 2:. Cuvette support Le support est constitué de trois plaques d'aluminium et est vissé sur la platine piézoélectrique. La cuvette de verre est maintenu par un ressort (en rouge).
Figure 3: Montage protocole de C. embryons elegans pour des expériences de SPIM. Un morceau de verre découpée est enduite avec de la poly-L-lysine. Un tapis de gélose est placée sur la surface revêtue. Poly-L-lysine est alors ajoutée sur le tampon de la gélose. Enfin, C. elegans embryons sont alignés sur la poly-L-lysine enduit tampon de gélose.
Figure 4: Exemple de titulaire. Le support s'adapte aux dimensions intérieures de la cuve de verre. Deux ressorts (en rouge) tiennent la lame de verre (décrit dans la figure 3). Ce support est ensuite mis à l'intérieur de la cuvette de verre.
Figure 5:... Porte-échantillon dans le cadre d'observation Les embryons sont immobilisés sur la lame de verre selon le protocole résumé dans la Figure 3 La lame est maintenue par le support d'échantillon décrit dans la figure 4, Le porte-échantillon est insérée dans la cuve de verre, détenu par le titulaire décrit dans la figure 2. L'nappe de lumière est horizontale et illuminates les embryons du côté. La lentille de l'objectif de détection est vertical, au-dessus de l'échantillon.
Figure 6: Enregistrement d'un C. elegans embryon exprimer une fusion histone :: GFP simples images planes d'un embryon transgénique exprimant une histone :: de fusion GFP (zuIs178; stIs10024) à différents moments Images extraites d'un enregistrement du temps de déchéance 3D:.. piles en 20 tranches ( distance entre les tranches 1 um); temps d'exposition par tranche: 30 ms; intervalle de temps entre des piles: 37 sec; temps d'acquisition total: 2 h. Catégorie: noyau interphasique, tête de flèche: condensé de la chromatine mitotique. A t = 0 min l'embryon est au stade 2-cellules et à t = 120 min l'embryon contient environ 70 cellules comme prévu en vertu du développement normalpipi (à noter que seules les cellules contenues dans un même plan sont visibles dans les images, et non toutes les cellules de l'embryon). La puissance d'éclairage est de 30 mW à 488 nm (mesurée à la sortie de l'objectif de l'éclairage). S'il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo.
Figure 7: Enregistrement d'un C. elegans embryon exprimant une tubuline :: fusion GFP et une histone :: mCherry fusion. Images extraites d'un enregistrement 3D time-lapse d'un C. elegans embryon exprimant une tubuline :: fusion GFP (ruIs57) et une histone :: mCherry fusion (itIs37; stIs10226). Conditions d'enregistrement: acquisition d'un empilement de 20 tranches (distance entre les tranches 1pm) chaque 105 sec; temps d'acquisition total: 16 min; temps d'exposition: 200 ms pour chaque canal. Groupe une montre 10 tranches de la même pile. Le panneau B montre la même tranche chaque 210 sec. La puissance d'éclairage est de 30 mW et 300 mW, pour 488 et 561 nm lasers, respectivement (mesuré à la sortie de l'objectif de l'éclairage). S'il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo.
Figure 8: Enregistrement d'un C. elegans embryon exprimant une VIT-2 :: fusion GFP et une membrane ciblée mCherry. Images extraites d'un enregistrement 3D time-lapse d'un C. elegans embryon exprimant une fusion VIT-2 :: GFP (PWIs23) et une mCherry à la membrane cible (ltIs44). Les conditions d'enregistrement: acquisition d'un empilement de 10 tranches (distance entre les tranches 1 pm) toutes les 30 secondes; temps d'acquisition total: 25 min; temps d'exposition par voie: 200 ms. Groupe montre une des 5 premières tranches de la même pile. Le panneau B montre la même tranche chaque 30sec. S'il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo.
Discussion
Ce protocole décrit une installation facile de la microscopie à feuille de lumière pour l'imagerie in vivo de C. elegans embryons. Les éléments optiques nécessaires pour créer et aligner la nappe de lumière, y compris les lasers, élargisseur de faisceau, collimation et lentilles de focalisation, peuvent être facilement montés sur un banc optique. En combinaison avec un microscope droit de la voie de détection et la caméra, cela fournit une solution simple à mettre en place une feuille de microscope optique.
Cette géométrie rend l'environnement de l'échantillon simple. Le spécimen vivant est placé dans une cuve en verre, qui est maintenu, placé et déplacé par un petit ensemble de pièces mécaniques. En microscopie feuille d'éclairage est une technique de champ large avec sectionnement, un seul axe motorisé mouvement est nécessaire pour l'imagerie 3D. Ceci limite la nécessité d'une synchronisation à un élément de balayage unique, et facilite le développement de logiciels. Par rapport à notre ISPIM 6 geomet deboutry permet l'utilisation d'une grande lentille d'objectif NA pour la détection. Par rapport aux configurations avec des lentilles d'objectif SPIM dans le plan horizontal le montage de l'échantillon et la formation d'image d'une série d'embryons sont plus faciles. Au total, la mise en œuvre de cette technique est simple et peut être réalisé avec peu d'expertise en optique. Il s'agit d'une alternative moins chère à la microscopie confocale avec les avantages d'une vitesse plus élevée et la phototoxicité réduite mais inconvénient d'une résolution axiale inférieure.
Nous avons également développé un moyen simple et reproductible pour monter C. elegans embryons pour l'imagerie in vivo en utilisant ce système. La procédure de montage est rapide (15 min) et est adapté pour les expériences de tous les jours. Pour C. imagerie elegans, les avantages de cette configuration simple sont au moins deux plis: (i) dans l'imagerie de Toto est possible sans rotation et donc la reconstruction 3D est simple; (Ii) le montage de l'échantillon est facile et plusieurs embryons peut être imagée séquentiellesur la même lame. Nous avons montré des exemples de films de time-lapse avec une résolution temporelle suffisante pour observer des divisions cellulaires et les changements de forme de la cellule. La puissance de la microscopie à feuille de lumière pour étudier C. développement elegans a également été illustrée récemment par d'autres 6, 7, 8. Par conséquent, cette technique sera très utile pour étudier la morphogenèse et la structuration de la C. embryon elegans.
Peut ce système également être utilisé pour analyser le développement d'autres organismes modèles? Il est important de reconnaître que la mise en œuvre de la feuille éclairage microscopie pour les petites et transparent organisme comme C. elegans est moins stricte que pour les plus grands organismes tels que des embryons de drosophile. L'imagerie toto de la drosophile nécessite normalement rotation et multi-vues reconstructions 9, 10. excitation des deux côtés avec colinéaires lentilles d'objectif d'excitation peut également réduit les effets d'ombre provoqués par la attenuation de la lumière 11. Pourtant, la configuration présentée ici est encore adapté à l'image d'un côté des embryons de drosophile, avec une faible blanchiment et bas photoxicity. Cette configuration pourrait également être utile pour des images de petites et transparentes embryons tels que les ascidies ou le poisson-zèbre.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Nous remercions tous les membres de la Lenne et les laboratoires de Bertrand, en particulier Olivier Blanc pour le développement de logiciels et Jérémie Capoulade de discussion. Nous remercions également le centre d'imagerie PICsL-IBDM, en particulier Claude Moretti et Brice DETAILLEUR pour le support technique.
Ce travail a été financé par des subventions de l'AIPRP du CNRS (à P.-FL et VB), le Labex INFORM subvention (P.-FL et VB) et une subvention de Sanofi-Aventis (à VB). Nous reconnaissons l'infrastructure France-BioImaging soutenu par l'Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-INSB-04-01, appelons «Investissements d'Avenir»).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SPIM | |||
| Detection | |||
| upright microscope | ZEISS | Axiophot 1 | |
| 100x W objective (NA 1.1, W.D. 2.5mm) | NIKON | ||
| EMCCD back illuminated | ANDOR | DU-885K-CS0-#VP | |
| Illumination | |||
| LASER 488 nm / 60 mW | TOPTICA | iBeam smart | |
| LASER 405 nm / 120 mW | TOPTICA | iBeam smart | |
| LASER 561 nm / 500 mW | COBOLT | JIVE 500 | for time lapse imaging, 50 or 100mW is enough |
| filter Quad line laser rejectionband ZET 405/488/561/638 | AHF | F57-405 | |
| Dichroic 405 | AHF | F38-405 | |
| Dichroic 488 | SEMROCK | Di01-R488 | |
| AOTF | AA | AOTFnC-400.650-TN | |
| mirror | |||
| lens 50 mm | THORLABS | telescope 5X | |
| lens 200 mm | THORLABS | telescope 5X | |
| periscope | THORLABS | RS99/M | |
| cylindrical lens f=100mm | THORLABS | ACY254-100-A | |
| 10X NA 0,3 | NIKON | ||
| xyz stage | NEWPORT | ||
| Sample | |||
| Bacto Agar | Bectkton Dickinson | 214010 | 5% in water |
| Poly-L-Lysine solution | Sigma | P8920 | |
| Capillaries GC100F-10, 1.0mm oD, 0,58mm ID, 100 mm L | Havard Appartus | 30-0019 | |
| Aspiration tube (mouth pipette) | Dutsher | 55005 | |
| M9 medium: | |||
| KH2PO4 (3g/L) | Any supplier | ||
| Na2HPO4 (6g/L) | Any supplier | ||
| NaCL (5g/L) | Any supplier | ||
| MgSO4 (1 mM final) | Any supplier | ||
| cuvette holder | HOME MADE | made by Brice Detailleur | |
| sample holder | HOME MADE | made by Claude Moretti | |
| x stage | NEWPORT | ||
| coverslip 50x20x1 mm | MARIENFELD | cut then in 10x20x1mm | |
| piezo electric stage with amplifier/controller | PI | P-622.ZCD / E-625.CR | |
| cuvette 40mmx40mmx10mm | HELLMA | 704.002-OG.40 mm- 10mm high | |
| Diamond Point Glass Marking Pencil | VWR | ||
| Software | |||
| C++ (Qt) home made software | developed by Olivier Blanc and Claire Chardès, available on request. Alternative solutions: micromanager or labview | ||
References
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