Yetişkin Zebra balığı Lateral Hat Rejenerasyon için bir Deneyi

Summary

Nörolojik ve non-nörolojik hastalıkların çok zebra balığı model yetişkin balık ziyade embriyo / larva incelenir için, erişkin zebrabalıkları hastalık modellerinde uygulanabilen bir nicel yan hat rejeneratif deneyi geliştirilmiştir. Deney 1) neuromast ve 2) tek tek saç hücre düzeyde çözünürlüğü dahil.

Abstract

Nedeniyle insanda işitme ve denge bozuklukları, klinik önemi, bu tür Zebra balığı gibi model organizmalar yanal hat geliştirme ve rejenerasyon çalışması için kullanılmıştır. Zebra balığı nedeniyle hızlı gelişimi zaman ve yüksek rejeneratif kapasitesinin bu tür çalışmalar için özellikle çekici. Bugüne kadar, yanal çizgi rejenerasyon Zebrafish çalışmalar esas olarak, çünkü bu aşamada neuromasts alt sayısının embriyonik ve larva evrelerinin balık kullanmıştır. Bu yanal çizgi rejenerasyon ve / veya daha önceki gelişim evrelerinde daha kolay gelişme kantitatif analizini yapmıştır. Nörolojik ve non-nörolojik hastalıkların çok zebra balığı model yetişkin balık olup embriyo / larva incelenir için bir deney kullanılabilir, böylece o akım tatbik edilebilir, yetişkin Zebrafish kantitatif bir yan hat rejeneratif tahlili geliştirilmesi üzerine odaklanmıştır yetişkin zebrabalıkları hastalık modelleri. Van TRUM tarafından daha önceki çalışmaları üzerine inşap vd. ^17. yetişkin Meksika kör mağara balık ve Zebra balığı (Br.rerio) saç hücrelerinin ablasyonu için prosedürleri tarif, bizim tahlil deney ve kontrol grupları arasında nicel bir karşılaştırmasını sağlamak üzere tasarlanmıştır. Bu yanal doğrultusunda belirli bir bölgede saç hücrelerinin gentamisin kaynaklı nekroz izlenerek ve 24 saatlik bir zaman periyodu boyunca neuromast yeniden ortaya çıkma yüzdesi göre bir rejeneratif neuromast standart eğri geliştirerek gerçekleştirildi. Tahlil, aynı zamanda çözünürlüğü daha yüksek bir düzeyde gerekli olan tek tek saç hücre seviyesine analiz uzantısı izin verecek şekilde tasarlanmıştır.

Introduction

Yanal çizgi (LL) sistemi işitme, denge, rheotaxis ve bu tür eğitim ve yırtıcı kaçınma ^1-5 olarak aracılık davranışları sorumludur hem de balık ve amfibiler bulunan bir mechanosensory organdır. Bu destek hücreleri ile çevrili saç hücre kümeleri oluşur, her ikisi de neuromasts ^6'ya yapılar konumlandırılmıştır. Bu neuromasts tipik olarak balık baş görülen yatay bir dikiş ile gövde ve kuyruk uzunlamasına ekseni boyunca (dikişler adlandırılır) dik çizgiler halinde düzenlenir. Yetişkinde, neuromasts embriyonik ya da larva balık ⁶ ile karşılaştırıldığında, dikiş içinde sayısında önemli ölçüde daha fazladır. Zebrafish Biyomedikal çalışmalar antibiyotik tedavisi, gürültü kaynaklı travma, kronik enfeksiyon, vb etkisi üzerinde odaklanmıştır. saç hücrelerinin çabasıyla ^7,8 daha iyi insanlarda etkilerini anlamak için.

Pek çok omurgalılarda aksine, teBöyle Zebra balığı (Br.rerio) gibi leosts, kayıp saç hücrelerinin yenilenmesine yeteneği var. Zebrafish nedeniyle hızlı bir gelişme süresi ve yüksek rejeneratif kapasitesinin özellikle yararlıdır. Ancak bugüne kadar; yanal hat geliştirme ve / veya rejenerasyon Zebrafish çalışmalar kaynaklanmaktadır kolay sayma ve analiz ^6,9,10 sağlayan yanal çizgi neuromasts azaltılmış sayısına embriyonik ve larva balık kullanmıştır.

Ancak, nörolojik ve non-nörolojik hastalıklar ^11-16 gibi birçok zebrabalıkları modelleri yetişkin balık değil larva incelenir, biz gentamisini kullanılarak yetişkin zebrabalıkları bir yanal çizgi rejeneratif tahlili (önce Zebra balığı larvaları kullanılan bir aminoglikozid geliştirilmesi üzerinde duruldu ve bir deney kullanılabilir, böylece daha yakın) yetişkin balık ^17, kullanılan mevcut yetişkin zebrabalıkları hastalık modellerinde de uygulanabilir. Daha önce Van Trump e prosedürleri yayınlandığı süret al. ¹⁷ yetişkin balıklarda saç hücre ablasyonu için kurulmuş koşullar, bu kontrol ve bu transgenik çizgiler zebra balığı veya farmakolojik-kaynaklı hastalık durumlarını kullanırken olduğu gibi Deney grupları arasında Kantitatif karşılaştırma için gereklidir neuromast rejenerasyon için bir standart eğri oluşturmak yoktu Zebra balığı ^18. Bu nedenle kontrol ve deney grupları karşılaştırırken böyle yetişkin zebrabalıkları hastalık modellerinde olduğu gibi bizim verilerini kullanmak müfettişleri sağlamak için neuromast rejenerasyon standart bir eğri oluşturmak için saç hücre ablasyon için Van Trump ve ark. ¹⁷ prosedürleri takip etti, ama onların çalışmaları üzerine inşa . Tahlil, aynı zamanda çözünürlüğü daha yüksek bir düzeyde gerekli olduğunda tek tek saç hücreye analiz uzantısı izin verecek şekilde tasarlanmıştır.

Protocol

Tüm işlemler "Laboratuar Hayvan Bakım Prensipleri" anlatılan yönergeleri izleyerek gerçekleştirilir (Sağlık yayın National Institutes hayır. 85-23, 1985 revize) ve onaylı Rosalind Franklin Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu hayvan protokol 08-19.

1.. Saç Hücre Nekroz gentamisin-indüksiyon

1. % 0.004 lik bir nihai konsantrasyonda (4.32 mM) normal tuzlu su içinde gentamisin sülfat hazırlayın.
2. 0.004% (4.32 mM) gentamisin çözeltisi içeren bir kap içinde yetişkin balık (D. rerio, yaş 4-6 ay) yerleştirin. Herhangi bir kap kullanılabilir ancak geniş 7, yüksek 6, 7 ve uzun olan bir Pharmacal Su Sistemi Bir balık kap kullanır. 24 saat boyunca 28 ° C'de ayarlanmış bir kuluçka makinesi içinde balık kap yerleştirin. 24 saatlik bir süre için uygun bir halde balık korumak için yeterli düzeyde tanktaki sıvının toplam hacmi ayarlayın. Not: gentamisin sıvının havalandırma NECE değilssary yeterli bir miktar, tedavi edilen balık sayısı için kullanılırsa.

Saç Hücreleri 2. Vital Boyama

1. 15 mg / ml 'lik bir işlem stok çözeltisinden floresan vital boya [4-4-diethylaminostyryl)-N-metilpiridinyum iyodit (485 nm eksitasyon ve metanol içinde λ 603 nm emisyon λ) (normal tuzlu su içinde)% 0.08 bir konsantrasyonda hazırlanması etanol.
2. Gentamisin ile tedavinin, tedavi araştırmak vital boya ihtiva eden bir 6 yuvalı kültür plakasının kuyudaki balık yerleştirerek hemen boyanmış kontrol ve gentamisin bir alt kümesini etkili olup olmadığını belirlemek. Bu balık 75 üzerinden dakika boyunca lekeli değildir bu nedenle, istatistiksel anlamlılık elde edilmesi için gerekli olan yeterli bir balık sayısı (ve kültür plakaları kullanın. Neuromast sayma muayene eden hızına bağlı olarak, zaman içinde karşı karşıya gelmeyen bir şekilde plakalarda balık yer Adım 2.3 'de tarif edildiği gibi.
3. Floresan mikroskop ile bir tezgah çekmece adım 2.2 tabak yerleştirinlekeli neuromasts incelenmesi için de kullanılabilir. Oda sıcaklığında 1 saatlik bir süre boyunca boyama hayati boyanın söndürme önlemek için oda ışıkları kapatın.
4. Boya yıkama-out ve anestezik su depoları hem hazırlayın. Boya bir yıkama suyu normal bir balık su ve normal balık su içinde bir 1:1000 seyreltme elde edilir, böylece anestezi, su için yeterli bir 2-fenoksietanol ilave edin.
5. Aşırı hayati boya durulayın ve hayati boya lekeli balık gözlem için 3.1 adıma geçmek için fazla normal bir balık suda balık yerleştirin.
6. 28 ° C de 8-16 arasında saat için bir kuluçka makinesi normal balık su içinde yıkandı, gentamisin ile tedavi edilen balık transferi, neuromasts rejenerasyonunu incelemek
7. 8-16 saat arasında, çeşitli zamanlarda, balık, inkübatörden çıkarılmıştır yıkandı ve adımlar 2,1-2,4 belirtildiği gibi boyanır. Hayati boya lekeli balık gözlem için 3.1 adıma geçin.

3.. Anestezi Balık ve Neuromasts Floresan Sayma

1. Orta gövde dikiş hayati boya lekeli neuromasts bir dijital görüntü elde etmek için bir floresan stereo mikroskop sahnede kapağı yerleştirin.
2. Kullanın floresan stereo mikroskop üzerine yerleştirilen bir dijital kamera sonraki kantitatif analiz için görüntüleri yakalamak için 2X büyütme ayarlayın. Stereo mikroskop büyütme ayarı kullanılan mikroskop markası bağlı olabilir, ancak ayar orta gövde dikişleri içinde kolay görüntüleme ve bireysel neuromasts sayma izin vermelidir: Not.
3. (Bkz. Şekil 1) sağ göğüs fin için sadece yakın balık en alt ventral tarafında dört belirlenen ilmek içinde görünür neuromasts sayısını sayarak rejenerasyon miktarını belirler. İstatistiksel analiz için böyle ANOVA o gibi uygun bir testi kullanmakr Student T-testi. Deneyler, her bir zaman noktasında 5 balık az kullanmak gerekir ve bütün deneyler 3x az tekrarlanmalıdır.
4. Neuromast rejenerasyon zaman eğrisinin dayanarak (bkz. Şekil 3), rejenerasyon eğrisinin doğrusal faz içinde olduğu 8-16 saat sonrası gentamisin yıkama-out arasında neuromasts saymak. Not: Doğrusal zaman aşamasında kullanılması deney ve kontrol grupları arasında uygun bir kantitatif analiz için izin verir.

Neuromast istatistiksel olarak anlamlı değildi ise Kantitatif Analiz Yüksek Çözünürlük alma için Bireysel Saç Hücreleri 4. Floresan Sayma

1. Neuromasts düzeyinde kantitatif analiz önemli değilse, tek tek saç hücre düzeyinde analiz de daha yüksek bir çözünürlük derecesi elde etmek için kullanılabilir. Belirli bir zaman noktası sonrası gentamisin wash-out (zaman noktasını önceki neuromast çalışmalara dayanarak), vital boya st balıkları seçinProtokol 2 de tarif edildiği gibi balık ain ve daha sonra 1-5 dakika boyunca, bir 1:500 seyreltmede 2-fenoksietanol kullanarak balık euthanize.
2. Aşağıdaki gibi, bir kare flep hazırlama yapılır, böylece söndürme önlemek için, uygun ışık olarak, dört kesiler yapmak. Bu anal yüzgeçleri ile aynı hizaya gelene kadar balık üst kaburgalar boyunca bir kesi yapmak, sonra göbek arasında bir kesi yapmak, ve nihayet, bu yüzden kare flep oluşturulan bu kesiler her iki tarafında iki dikey kesiler yapmak. Not: Bu cilt hazırlama neuromast deneylerde kullanılan orta gövde dikiş dahil edecektir.
3. Bir cam slayt deri örneği yerleştirin ve sonra çapa yardım ve sonraki dijital görüntüleme için doku düzleştirmek için kesilip deri örneğinin üzerine bir yuvarlak cam kapak kayma yerleştirin.
4. Aşama 4.3 gelen deri örnekleri kullanarak, orta gövde dikişlerin her biri neuromast içindeki saç hücrelerinin dijital görüntü elde etmek. En az 60X büyütme görüntüleri almak ve sonra saç ce saymakdeney ve kontrol gruplarının karşılaştırmalı kantitatif analiz için ayrı neuromasts içinde lls (bkz. Şekil 4).

Representative Results

Yetişkin zebrabalıkları yanal çizginin neuromast rejenerasyon miktarının belirlenmesi için prosedürlerin optimizasyonu.

Larva zebrabalıkları neuromasts kolaylıkla ölçülebilir vardır; Bununla birlikte, yetişkin zebrafish yan hat ^6,17,19,20 kantitatif analiz daha zor hale dikiş başına neuromasts çok daha büyük bir sayı vardır. Şekil 1A'da görüldüğü gibi, baş orta bölümü ya da kuyruk ya kıyasla neuromasts bir belirgin şekilde daha vardır; Şekil 1D 'de gösterildiği gibi arka bölgede neuromasts en az sayıda sahip. Baş dikişlerin model karmaşık ve neuromasts sayısında önemli ölçüde daha fazla olduğu için, kantitatif analiz için bir bölge olarak elverişli değildi. Buna ek olarak, ne olursa olsun Test gentamisin konsantrasyonunun, kafa boyunca neuromasts tam ablasyon nadiren ulaşılabilir olduğunu; gözlenen neuromasts bırakarak noktalar Bunun tersine, daha önce Trump Van et al. ¹⁷ bildirilmiştir gentamisin tedaviden sonra kuyruk çok az neuromasts vardır ve bu gibi, kantitatif yetişkinde neuromast rejenerasyon analiz etmek için orta gövde bölgesi (Şekil 1B) seçilir. Bu bölgede, biz dört dikiş sadece tüm yetişkinler [61.45 (n = 95)] (Şekil 1B ve 1E) arasında neuromast sayıda tutarlı yanal göğüs yüzgeci posterior belirledi. Daha da önemlisi, (daha önce Trump Van et al. ¹⁷ de belirtildiği gibi) sürekli olarak ve tamamen (Şekil 1B ve 1E karşılaştırın neuromast rejenerasyonu için bir sonraki tam olarak belirlemek için izin veren bir 24 saat% 0.004, gentamisi ile bu bölgenin neuromasts kesip çıkartmak mümkün ve Şekil 2, 0 saat) ile vaziyettedir.

p_upload/51343/51343fig1highres.jpg "width =" 500 "/>
Şekil 1. Yetişkin zebrabalıkları ilmek içinde neuromast floresan model uzunlamasına ekseni boyunca gösterilir. Panel A baş bölge, Panel B bir kutu ile belirtilen kantitatif analiz için kullanılan dört dikiş ile Orta gövde bölgesidir. Panel C Posterior vücut bölgesidir. Panel D Kuyruk yüzgeci bölgedir. Kantitatif analiz için kullanılan Orta gövde bölgenin 4 dikişlerin daha yüksek bir büyütme 1X ve 2X Panel E. Büyütme güç gösterilmiştir.

Bu, bakır sülfat tedavi embriyolar ve larva ²¹ saç hücrelerinin hızlı nekrozunu başlatma için etkili bir kimyasal yöntem olduğu bildirilmiştir. İşte biz neuromast ablasyonu ikna etmek için süresini kısaltmak umuduyla ile bakır sülfat tedavi test. Arasında değişen Bakır sülfat konsantrasyonu5-50 mM, daha önce bakır sülfat yetişkin balık daha düşük konsantrasyonlarda etkili olmayan yüksek konsantrasyonlarda öldürücü olduğu ve olduğu bulunmuştur Liang ve ark. ²¹ tarafından rapor edildiği gibi en çok 48 saat kullanılmıştır çeşitli çekim kez (veriler gösterilmemiştir) . , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Yetişkin Zebrafish yanal çizgi yenilenme floresan analizi için kullanılan parametreler.

Dört orta gövde ilmek içindeki tüm neuromasts 24 saat gentamisin muameleye (Şekil 2, kontrol ile 0 saat karşılaştırın) ve pozitif yenilenmesi bir dikişin içinde üç neuromasts en az bir görünüşü ile tespit edildi, aşağıdaki ablasyon edildikten sonra rejenerasyon izlenmiştir. (Şekil 2, 0 saat). 8 HPG'nin, balık yaklaşık üçte biri toparlanma işareti (n = 3 oldu4); neuromasts yoğunluğu rejenerasyon dikiş (Şekil 2, 8 saat, kutuları tarafından özetlenen soluk ilmek) soluk olmasına rağmen. Rejenerasyon 16 HPG'nin bir plato (Şekil 2, 8 saat ile Şekil 2, 16 saat karşılaştırmak) ulaşıncaya kadar neuromasts sayısı ve şiddeti doğrusal bir şekilde artmaya devam etmiştir. Bu gentamisin ile tedavi edilmiş tüm balık tam kontrollere kıyasla yanal çizgi halindeki dikişler içindeki neuromasts eşit sayı ve yoğunlukları (Şekil 2, 24 saat) hem de geri kazanılmış olan, en az 24 HPG kadar değildi. Gentamisin geri çekilmesinin ardından neuromast ıslahı için bir zaman çizelgesi, kurtarma eğrinin doğrusal ve yayla fazlarını gösteren, Şekil 3 'de gösterilmiştir. Biz vakaların az% 5, yenileyici dikişler ayrı varlıklar olarak görünmedi ama yerine floresan bir leke olarak ortaya çıktığını unutmayın.

Şekil 2. Neuromasts Floresan görüntüler. Kontrol balık, (hemen% 0.004 gentamisin tedavisi 24 saat sonra) 0 Hr balık, kantitatif analiz için kullanılan 4 dikiş içindeki neuromasts bazı soluk boyanması ile 8 Hr balık (8 HPG) (tüm balık sadece% 30 bu desen arasında gösterdi 8 HPG ile lekeleme, 70%, bu zaman noktasında hiç neuromast boyanma gösterdi, beyaz kutular 8 HPG de rejenerasyon bir derecede bağlanma göstermiştir balık% 30 görüldü soluk lekeli neuromasts taslak), 16 Hr balık ve 24 Hr balık. Neuromasts sayısı ve neuromasts boyanması 2) yoğunluğu 24 HPG tarafından gözlenmiştir 1'e açısından 4 dikiş) içinde neuromasts tam rejenerasyon. için tıklayınızBu rakamın büyük bir versiyonunu görmek.

Şekil 3.. Grafik 0.004% gentamisin ile erişkin zebrabalıkları 24 saat tedavi çekilmesinin ardından neuromasts yenilenme zamanı seyrini gösteren. Gösterildiği gibi, kurtarma 8 hpg zaman noktada başlar ve 16 HPG zaman noktasında bir düzlüğe ulaşmıştır. Bu, doğrusal faz içinde 8-16 saat ve zaman noktaları arasındaki neuromast yenilenme astar faz nicel deney ve kontrol grupları karşılaştırmak için kullanılmalıdır tanımlanır.

Neuromast toksisite floresan boyalar boyama için uzun süreli maruz kalma ile başlatılır.

Bizim tahminimize göre, bu deneyler için ideal bir yoldur 0 saatte tekrar önceki tedavi, leke floresan boya ile balık leke olacaktır sonra tekrar leke birt rejenerasyon süresi puan. Ancak, örneğin 4-Di-2-Asp gibi saç hücresi floresan boyama boyalar, ayrıca ²² toksik bir saç hücrelerinin ²³ etkiye sahip diğer mitokondriyal lekeleri ile durum olabilir gibi olmasıdır, bu çalışmalara bir komplikasyon karşılaştı. Bu gerçek aynı balık istihdam edilemezler tekrarlanan boyama beri balık ayrı grup kullanmak için bize gerekli. Tüm durumlarda, kontrol de dahil olmak üzere, deney balık deneysel değişkenliği ortadan kaldırmak için paralel olarak tedavi edildi.

Tek tek saç hücrelerinin seviyesinde Eşodaklı analizi.

Neuromast analizinden elde edilen sonuçlar istatistiksel olarak deney ve kontrol grupları arasında anlamlı değilse, bir nicel karşılaştırmalar için çözünürlüğü daha yüksek bir derece elde etmek bireysel dolu hücrelerin seviyesine bu çalışmaları uzatabilir. Şekil 4'te gösterildiği gibi, bir kontrol grubundan neuromasts (birrejenerasyon 12 saat sonra Euromast) bu şekilde gösterilmiştir orta vücut bölgesinde cilt preparasyonlar konfokal mikroskobu ile izlenebilir. 8 saat, 10 saat ve yenilenme süresi 12 saat, biz kontrol grupları (7 hayvan / grup) 0-4 saç hücreleri / neuromast bir dizi vardı bulundu. Kontrol grubu için beklendiği gibi, kantitatif analiz edildiğinde, neuromasts arasında anlamlı bir fark (P değerleri, 0,230-0,472 arasında değişmektedir) yukarıda belirtilen zaman noktalarında neuromast başına saç hücrelerinin sayısı açısından saptandı. Neuromast çalışmaların ilk aşamasında elde edilen verileri genişletmek veya onaylamak için gerektiğinde Böyle bir yaklaşım, herhangi bir kontrol ve deney grubu arasında alınabilir.

Tanımlanan yanal çizgi bölgenin cilt hazırlıklarını kullanılarak saç hücresi / neuromast yenilenme Şekil 4. Analizi i tarifn protokol adım 3.3. bir Zebra balığı cilt hazırlığı elde edilen bir neuromast içinde saç hücrelerinin Floresan konfokal görüntü. Iki hayati boya lekeli saç hücreleri kontrol balık neuromast (Şekil 4) içinde gösterilmiştir. Bu görüntü gentamisin 12 saat sonrası kaldırma (lineer rejenerasyon dönemi) elde edildi. Beyaz ok saç hücrelerini çevreleyen bir destek hücreyi işaret ederken, beyaz braket sembolü () bireysel neuromast gösterir. Destekleyici hücrelerin bu koşullar altında leke ve siyah alanları gibi görünmüyor. Büyütme, 60X.

1	Bir kuluçka kullanılarak 28 ° C'de 24 saat için kontrol ve deney balık 1.. Gentamisin tedavisi [% 0.004 (4.32 mM)].
2	2.. Saç hücrelerinin yenilenmesini başlatmak için gentamisin'in yıkayın. 8-16 saat arasında araştırmacı seçilen süreler için 28 ° C inkübatör balık dönün.
2	Daha sonra 3. Kişisel boya leke [0,08% 4-4-diethylaminostyryl-N-metilpiridinyum iyodit (4-Di-2-Asp)] kontrol edildi ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca deney balık ve flüoresan görüntüleme için balık su ile lekeyi yıkayın.
1 ya da 2'dir	4. Gerekirse nedeniyle neuromasts analizinden anlamsız sonuçlar, kontrol ve deney balık ayrı bir grup ile Protokoller 1-3 tekrarlayın, ancak daha sonra tek tek saç hücrelerinin konfokal analizi için bir cilt hazırlığı edinin.

Tablo 1.. Protokol bir özeti yukarıda özetlenen.

Discussion

Embriyonik ve larva zebrabalıkları ^8,24,25 lateral hat (LL) rejenerasyon analizi için kurulmuştur edebiyat geniş gövdesine dayanarak, çalışmamızın amacı zebrabalıkları yanal hat rejenerasyon için niceliksel bir test geliştirmek olduğunu olabilir en iyi yetişkin balık incelenir hastalık modelleri uygulanabilir. Biz yetişkin balık embriyonik / larva balık için geliştirilen yöntemler uygulanarak zaman belli kritik noktalarda önemli olduğunu bulundu. Bu noktaların en önemli kabul edilmiştir: 1) yan hat sayısı 2) neuromast saç hücrelerinin boyanması süresi, 3) konsantrasyonu ve süresi aminoglikosit tedavi ve 4), balık uzunlamasına ekseni boyunca neuromasts aminoglikozid tedavisi sonrasında yanal çizgi yenilenme zamanlaması. Bu noktalar aşağıdaki tartışma ele alınacaktır.

Zebrabalıkları yanal hattı boyunca neuromasts sayısı ile ilgili olarak, Embriyonik ve larva zebra balığı, çünkü yetişkin balık kıyasla belirli bir dikişin içinde kendi alt sayısının neuromasts basit bir desen var ayrı bir avantajı var. Bu düşük sayı müfettişler açıkça her neuromast belirlemek ve ⁶ bir isim atamak için izin verdi. Bu şekilde, yenilenme çalışmaları bir aminoglikozid ajan çekilmesinin ardından herhangi bir zamanda adıyla belirli bir neuromast yeniden ortaya çıkma ölçmek olabilir. Yetişkin dikiş başına neuromasts ait daha fazla sayıda embriyolar veya larvaların bu karşılaştırıldığında neuromasts rejenere olan yeniden ortaya çıkma sırasında doğru sayım ve miktarının önemli bir güçlük getirmektedir. Gösterildiği gibi, yetişkin ilmek olan yan çizgi neuromasts örüntüsünü değerlendirildi ve orta gövdenin (Figures. 1 ve 2) analizi için ilmek en uygun bölge temin olduğu tespit edilmiştir.

2 gibi saç hücreleri boyalarla neuromasts lekelenmesi - [4 - (dimetilamino) stiril]-N-ethylpyridinyum iyodür (DASPEI) veya 4-Di-2-Asp bir larva ve yavru balık floresan stereomikroskobi ^26,27 kullanarak yanal çizginin neuromasts görüntülemenizi sağlar. Bu lekeler, aynı zamanda yetişkin balık etkilidir ve kantitatif analiz, orta-gövde bölgesi içinde neuromasts sayısında anlamlı bir fark (normal kontrol yetişkin balıklarda neuromasts 61.45 ortalama ile) kontrol zebrabalıkları arasında gözlenmediğini gösterdi.

- [4 - (dimetilamino) stiril]-N-etilpiridiniyum iyodür (DASPEI) ya da 4-di-2-Asp kendileri hücreleri ²⁴ neuromast için toksik olabilir, ve balık tekrar tekrar olamaz, örneğin 2 saç hücre boyaları bildirilmiştir bir aminoglikosit kaynaklı rejenerasyon izlemek için ise, bu flüoresan maddeler ile boyandı. Aynı balık tekrarlanan boyama ²³ deney un-yorumlanabilir yapar (leke ve aminoglikozit ikisi tarafından) birden zehirlenme olayları tanıtır. Buna göre, tüm deneylerneuromasts Nontreated gentamisin kontrol koşulu mevcut 1) olduğunu göstermek için bizim çalışmamızda amacıyla balık birden fazla setleri gerekli paralel 4-Di-2-Asp boyama in, 2) tam gentamisin maruziyet sonrası hemen ablasyon, ve 3) bazı yenileyici Bu aminoglikositin dışına çekilmesi ve yıkama sonrası saat sonrası gentamisin tedavisi. Bu şekilde, tüm balıklar neuromast boya ile sadece bir kez boyandı.

Van Trump ve ark. ¹⁷ prosedürleri yetişkin balık saç hücre ablasyon için koşullarını oluşturmak iken, bunlar deney ve kontrol grupları arasında nicel karşılaştırma için gerekli neuromast yenilenme için bir standart eğri kurmak olmadığını belirtmek gerekir. Bu nedenle 24 de saç hücre ablasyon (24 saat pozlama süresini kullanarak% 0.004 gentamisin konsantrasyonunun, saç hücre ablasyon sonuçları için bakınız Şekil 2 Van Trump ve ark. ¹⁷ prosedürleri takiphr), ancak neuromast rejenerasyonu için bir standart eğri oluşturmak için kendi genişletmiştir. Bu, bizim deney koşulları için kurulmuş olan orta vücut bölgesi dört dikiş kullanılarak yetişkin Zebrafish LL yenilenme karşılaştırmalı analizi sağlar (Şekiller 1 ve 2). Saç hücre ablasyonu için daha kısa bir süre elde edilebilir olmadığını belirlemek için, aynı zamanda etkin bir şekilde 2 saat gibi kısa bir süre için balık larva kullanılmıştır bakır sülfat etkisi test edilmiştir. (Daha önce larva için Liang ve ark. ²¹ tarafından bildirildiği gibi, 48 saat kadar farklı pozlama süreleri için 5-50 mM) Bizim çalışmalar bakır sülfat belirtti saç hücre ablasyon için bir ajan olarak yetişkin balıklarda etkili bulunmamıştır. Bu embriyoların saç hücrelerinin ablasyonu ve larvaları için kullanılan koşullar her zaman doğrudan yetişkin balık ile kullanmak için transfer edilemez gerçeğini vurgulamaktadır.

Yanal hattı ile ilgili olarak,yetişkin rejenerasyon, biz embriyo / larva ve yetişkin balık arasındaki neuromasts rejenerasyonu için benzer zaman dilimlerini bulundu. 12-24 saat sonrası aminoglikozidle başkaları, zebra balığı embriyolarının ve larva gösteri neuromast rejenerasyon tarafından daha önce bildirdiği gibi yıkama-arasından ^8. Bu 16 HPG ulaştığı bir plato ile (Şekil 2'de gösterildiği gibi, 8 saat bir zaman noktası için tam ilmek olarak görülmez) 8-12 zaman dilimi içinde görünen neuromast yenilenme doğrusal faz görülmektedir. Embriyoları ve larvaları için rapor ilmek içinde neuromasts tam kontrolü gibi bir görünüm 24 HPG kadar gözlenmemiştir. Tam kontrol gibi bir görünüm yetişkin zebrabalıkları orta vücut bölgesinde dört dikiş içindeki numarasını ve neuromasts yoğunluğunu hem de gösterir. Neuromasts düzeyinde elde edilen nicel sonuçlar istatistiksel olarak anlamlı değilse Ayrıca, araştırmacı neuromasts içindeki tek tek saç hücrelerinin düzeyine çalışmalarını uzatabilirsinizBizim prosedürler tarafından tarif edildiği gibi konfokal mikroskopi kullanılarak.

Bu makalede açıklanan neuromasts / saç hücre yenilenmesi deney en çok erken dönemde embriyo / larva aşamalarında daha erişkin Zebrafish kendini gösteren hastalık durumları için uygulanabilir. Tahlil bir sınırlama durumu 1), belirli bir hastalık durumu ya da yetişkin zebrabalıkları yanal hattı sistemi içinde kök hücreleri üzerinde 2), farmakolojik-kaynaklı bir hastalık durumu] taklit eden bir transjenik soy olsun deney durumun etkiler ile ilgilidir. Bu bağlamda, yetişkin zebrafish belirli bir hastalık durumu ya da saç hücre soyunun kök hücrelerini etkiler olmayabilir, ve bu neuromast yenilenmesi ^8,24,25 işler, bu kök hücre proliferasyon / farklılaşması üzerine tamamen bağlıdır dikkat etmek önemlidir .

Bu sınırlama nedeniyle, bir örnek olarak, Tip I diyabet bir yetişkin zebrabalıkları model üzerinde yapılan deneyler anlatacağız. Bu özellikle çekiciar hastalık modeli hiperglisemi ²⁸ tarafından uyarılan uzun vadeli ikincil komplikasyon incelemek amacıyla yetişkin zebrabalıkları geliştirilmiştir. Daha önce tarif edilen ^28,29 nedenlerle bir dizi için, bu çalışmalar sadece yetişkin zebrafish kullanılarak yapılabilir. Onlar sinirlerini özel hücresel yapılar ile birlikte periferik sinirler olumsuz diyabetli hastalarda etkilenir, çünkü biz neuromasts / saç hücrelerinin yanal çizgi yenilenmesi de diyabetik zebrabalıkları bozulmuş olup olmadığını belirlemek istedik. Yan hat yenilenmesi testi kullanılarak istatistiksel olarak önemli bir gecikme neuromast rejenerasyonunda tespit edildi. Bu negatif sonucu doğrulamak için deneyler tek tek saç hücrenin daha yüksek seviyede tekrarlandı. Yine, istatistiksel olarak anlamlı bir fark, kontrol ve diyabetik gruplar arasında saç hücre rejenerasyonu gözlenmiştir. Bu nedenle, veri hiperglisemi neuromast / saç hücre yenilenmesini engelleyen bu varsayımı tutarsız olan; possibly hiperglisemik koşullara saç hücre soyunun kök hücrelerin direnci nedeniyle. Bu düşünceyle sınırlama ile bu makalede açıklanan neuromasts / saç hücre yenilenme tahlil yanal çizgi sistemi kullanılarak takip gibi herhangi bir yetişkin zebrabalıkları hastalık modeli saç hücresi rejeneratif sürecinde disfonksiyon içerir olmadığını sınamak için bir araç sağlamaz. Pozitif sonuçlar kök hücre katılımını ima eder ve daha ileri çalışmalar bu nedenle garanti olacaktır.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gentamicin sulfate solution (50 mg/ml)	Sigma Aldrich	G1397
2 Phenoxyethanol	Sigma Aldrich	P1126
4-4-Diethylaminostryryl-N-methylpyridinium iodide (4-Di-2-Asp) in methanol	Aldrich	D-3418	485 nm excitation λ and 603 nm emission λ
6-well Plates	Mid Sci	TP92006
Petri Dishes	Fisher Scientific	08-757-13
Glass Bottom Microwell Dishes	Matek Corporation	P35G-1.5-14-C
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S3014
Dissecting  Microscope	Nikon	TMZ-1500	Any dissecting microscope is fine.
Camera for Imaging	Nikon	Q imaging	Any camera is suitable.
ImageJ software	National Institutes of Health	NIH Image
NIS Elements	Nikon		Any imaging software is suitable.
Confocal microscope	Olympus	FV10i	Any high resolution fluorescent microscope is suitable
Aquatic System	KG Aquatics ZFS Rack System		Any aquatic system can be used