En analys för sidolinje Regeneration i vuxen Zebrafish

Summary

Eftersom många zebrafisk modeller av neurologiska och icke-neurologiska sjukdomar studeras i den vuxna fisken istället embryot / larver, utvecklade vi en kvantitativ sidolinje regenerativ analys som kan tillämpas på vuxna förebilder zebrafisk sjukdoms. Analysen involverade upplösning på 1) neuromast och 2) individuell hår cellsnivåer.

Abstract

På grund av den kliniska betydelsen av hörsel-och balansstörningar hos människan, har modellorganismer såsom zebrafishna använts för att studera lateral utvecklingslinjen och regenerering. Den zebrafisk är särskilt attraktiv för sådana studier på grund av dess snabba utvecklingstiden och dess höga förnyelseförmåga. Hittills har zebrafisk studier av sidolinje förnyelse främst utnyttjad fisk av embryonala och larvstadier på grund av det lägre antalet neuromasts på dessa stadier. Detta har gjort kvantitativ analys av sidolinje regeneration / och eller utveckling lättare i de tidigare utvecklingsstadier. Eftersom många zebrafisk modeller av neurologiska och icke-neurologiska sjukdomar studeras i den vuxna fisken och inte i embryot / larver, vi fokuserat på att utveckla en kvantitativ sidoanalyslinje regenerativ i vuxen zebrafisk så att en analys fanns tillgängliga som skulle kunna tillämpas på ström vuxna förebilder zebrafisk sjukdoms. Att bygga på tidigare studier av Van Trump et al. ¹⁷ som beskrivs förfaranden för ablation av hårceller i vuxen mexikanska blinda grottan fisk-och zebrafisk (Danio rerio), var vår analys som syftar till att möjliggöra kvantitativa jämförelser mellan kontroll-och experimentgrupper. Detta åstadkoms genom att utveckla en regenerativ neuromast standardkurva baserad på den procent av neuromast reappearance över en 24 h tidsperiod efter gentamicin-inducerad nekros av hårceller i ett definierat område av sidolinje. Analysen har också utformats för att medge förlängning av analysen till den individuella hår cellnivå när det krävs en högre grad av upplösning.

Introduction

Den sidolinje (LL) systemet är en mechanosensory orgel finns i både fiskar och groddjur som är ansvarig för hörsel, balans, rheotaxis och medier beteenden såsom skolgång och rovdjur undvikande ^1-5. Den består av ett kluster av hårceller omgivna av stödjande celler, vilka båda är positionerade i strukturer som kallas neuromasts ^6. Dessa neuromasts är oftast organiserade i vertikala linjer (kallas stygn) längs den längsgående axeln på kroppen och svansen med vissa övergripande stygn observerats i huvudet på fisken. I den vuxna, neuromasts är betydligt större i antal inom de stygn som i jämförelse med embryonala eller yngel ^6. Biomedicinska studier i zebrafisk har fokuserat på effekten av antibiotikabehandling, buller-inducerad trauma, kronisk infektion, osv. på hårcellerna ^7,8 i ett försök att bättre förstå deras effekter på människor.

Till skillnad från de flesta ryggradsdjur, teleosts såsom zebrafisk (Danio rerio), har förmågan att regenerera förlorade hårceller. Zebrafisk är särskilt användbara på grund av sin snabba tid och hög förnyelseförmåga. Men hittills; zebrafisk studier längs sido utveckling och / eller regenereringslinje har huvudsakligen utnyttjat den embryonala och larvstadiet fisk på grund av det minskade antalet sido neuromasts linje som gör det enklare att räkna och analys ^6,9,10.

Men så många zebrafisk modeller av neurologiska och icke-neurologiska sjukdomar ^11-16 studerade i den vuxna fisken och inte larverna har vi fokuserat på att utveckla en sidolinje regenerativ analys i vuxen zebrafisk med hjälp av gentamicin (en aminoglykosid som tidigare använts i zebrafisk larver och på senare tid används med vuxna fiskar ^17), så att en analys fanns tillgängliga som skulle kunna tillämpas på pågående vuxenmodeller zebrafisk sjukdoms. Medan tidigare publicerade förfaranden av Van Trump et al. ¹⁷ fastställt villkoren för hår cell ablation i vuxen fisk, har de inte skapa en standardkurva för neuromast förnyelse som krävs för kvantitativ jämförelse mellan kontroll och experimentella grupper som vid användning av transgena zebrafisk linjer eller farmakologiskt inducerade sjukdomstillstånd i zebrafisk ^18. Vi följde därför förfarandena i Van Trump et al. ¹⁷ för hår cell ablation, men byggt på sitt arbete för att skapa en standardkurva av neuromast förnyelse så att utredarna att använda vår information när man jämför kontroll och experimentella grupper som med vuxna förebilder zebrafisk sjukdoms . Analysen har också utformats för att medge förlängning av analysen till den individuella hår cell när det krävs en högre grad av upplösning.

Protocol

Alla procedurer utförs enligt de riktlinjer som beskrivs i "Principles of Laboratory Animal Care" (National Institutes of Health publikation inga. 85-23, reviderad 1985) och den godkända Rosalind Franklin University Institutional Animal Care och användning kommittén djurprotokoll 08-19.

1. Gentamicin induktion av hår cellnekros

1. Förbered gentamicinsulfat i normal saltlösning vid en slutlig koncentration av 0,004% (4,32 mM).
2. Placera vuxen fisk (D. rerio, 4-6 månader gamla) i en behållare som innehåller 0,004% (4,32 mM) gentamicin lösning. Varje behållare kan användas, men vi använder en fiskbehållare från en Pharmacal Aquatic System som är 7 i stort, 6 i hög och 7 i länge. Placera behållaren med fisk i en inkubator inställd på 28 ° C under 24 timmar. Ställ in den totala volymen av vätska i tanken vid en tillräcklig nivå för att hålla fisken i ett livskraftigt tillstånd under den 24 h period. Anm: Luftning av gentamicin fluiden är inte necessary om tillräcklig volym används för antalet fiskar som behandlas.

2. Vital Färgning av hårcellerna

1. Framställ en 0,08% koncentration (i normal saltlösning) av det fluorescerande vitala färgämnet [4-4-diethylaminostyryl)-N-metylpyridiniumjodid (485 nm excitation λ och 603 nm emissions λ i metanol) från en arbetsstamlösning av 15 mg / ml i etanol.
2. För att bestämma om gentamicin behandling var effektivt en delmängd av kontroll och gentamicin behandlade fisk färgas omedelbart genom att placera fisken i brunn i en 6-brunnars odlingsplatta innehållande det vitala färgämnet. Använd ett tillräckligt antal fiskar (och odlingsplattor som krävs för statistisk signifikans ska uppnås. Baserat på granskarens hastighet neuromast räkna, lägg fisken i plattorna i sicksack över tiden så att fisken inte färgas för över 75 min enligt beskrivningen i steg 2.3.
3. Placera plattorna från steg 2,2 i en bänk låda av det fluorescerande mikroskop för attanvändas för undersökning av färgade neuromasts. Stäng av rummet ljus för att förhindra släckning av det vitala färgämnet över 1 timme färgning period vid rumstemperatur.
4. Förbered både dye wash-out och anestesivattentankar. Dye wash-out vatten är normalt fisk vatten och för narkos vatten, tillsätt tillräckligt med 2-fenoxietanol, så att en 1:1000 utspädning i normal fisk vatten uppnås.
5. Placera fisken på över normal fisk vatten för att skölja överskott vitala färgämnet och gå vidare till steg 3,1 för observation av vitala färgämnet färgade fisk.
6. För undersökning regeneration av neuromasts, överför gentamicin-behandlade fiskar som tvättades i normal fisk vatten till en inkubator under mellan 8-16 timmar vid 28 ° C.
7. Vid olika tidpunkter mellan 8-16 timmar, är fisk ur inkubatorn, tvättas och färgas som anges i steg från 2,1 till 2,4. Gå vidare till steg 3,1 för observation av vitala färgämnet färgade fisk.

3. Anesthetizing Fisk och fluorescerande Räkning av Neuromasts

1. Placera locket på scenen av en fluorescerande stereomikroskop för att få en digital bild av det vitala färgämnet färgade neuromasts i mitten av kroppen stygn.
2. Använd en digital kamera placerad på den fluorescerande stereomikroskop sätta en förstoring på 2X för att ta bilder för efterföljande kvantitativ analys. OBS: Förstoringen inställning av stereomikroskop kan bero på vilket märke av mikroskop som används, men inställningen bör tillåta enkel visning och räkning av enskilda neuromasts i mitten av stygn kroppen.
3. Bestäm mängden regenerering genom att räkna antalet synliga neuromasts inom de fyra utsedda maskor på den nedersta ventrala sidan av fisk alldeles proximalt till höger bröstfenan (se figur 1). För statistisk analys använder ett lämpligt test såsom ANOVA or Students T-test. Experiment bör använda minst 5 fiskar per tidpunkt och alla experiment bör upprepas minst 3 gånger.
4. Baserat på den neuromast regenere tid-kurvan (se figur 3), räkna neuromasts mellan 8 till 16 h efter gentamicin wash-out för att vara inom den linjära fasen av regenereringskurva. Anm: Användning av den linjära tidsfasen möjliggör korrekt kvantitativ analys mellan kontroll-och experimentgrupper.

4. Fluorescerande räkning av vissa hårcellerna för att få högre upplösning av Kvantitativ Analys om Neuromast Analys är inte statistiskt signifikant

1. Vid kvantitativ analys på nivån för neuromasts inte är betydande, kan analys på nivån för den individuella hårcell också utnyttjas för att erhålla en högre grad av upplösning. Välj fisk vid en viss tidpunkt efter gentamicin wash-out (tidspunkt baserat på de tidigare neuromast studier), vitala färgämnet stain fisken som beskrivs i protokoll 2, och sedan avliva fisken med hjälp av 2-fenoxietanol vid en 1:500 utspädning för 1-5 minuter.
2. I dämpat ljus för att förhindra härdning, göra fyra snitt, så att en kvadrat hud flik förberedelser görs på följande sätt. Gör ett snitt längs de övre revbenen i fisken tills den är i linje med analfenor, sedan göra ett snitt över magen, och slutligen, gör två vertikala snitt på varje sida av dessa snitt så torget huden flik skapas. Anm: Det här skalet förberedelser kommer att införliva mitten stygn kroppen används i neuromast experiment.
3. Placera objektet hud på ett objektglas och sedan placera ett cirkulärt täckglas över utskuren hud provet för att hjälpa ankare och platta till den vävnad för efterföljande digital bildbehandling.
4. Med hjälp av prover hud från steg 4.3, få digitala bilder av hårcellerna i varje neuromast i mitten av kroppen stygn. Ta bilder med en förstoring av åtminstone 60X och sedan räkna håret cells inom enskilda neuromasts för jämförande kvantitativ analys av kontroll-och experimentgrupper (se figur 4).

Representative Results

Optimering av förfarandena för att kvantifiera neuromast förnyelse av sidolinje i vuxen zebrafisk.

De neuromasts av larver zebrafisk är lätt kvantifierbara; emellertid den sidolinje av den vuxna zebrafisk har ett mycket större antal neuromasts per stygn gör kvantitativa analyser svårare ^6,17,19,20. Som framgår av Figur 1 A, har huvudet ett betydligt högre antal neuromasts jämfört med antingen den mellersta delen eller svans; med svansregionen som har minst antal neuromasts såsom visas i figur 1D. Eftersom mönstret av stygn i huvudet är komplicerad och signifikant större i antalet neuromasts, det inte lämpar sig som en region för kvantitativ analys. Dessutom, oberoende av gentamicin koncentration vi testade var fullständig ablation av neuromasts hela huvudet sällan uppnåbara; lämnar fläckar av neuromasts observerade efter gentamicin behandling som tidigare rapporterats av Van Trump et al. ¹⁷ Däremot har svansen för få neuromasts, och som sådan, valde vi mellankroppsregionen (Figur 1B) att kvantitativt analysera neuromast förnyelse i den vuxna. I denna region, identifierade vi fyra stygn bara posteriort om laterala bröstfenan som var konsekvent i neuromast nummer bland alla vuxna [61.45 (n = 95)] (figur 1B och 1E). Huvudsakligen kunde vi konsekvent och helt avlägsna de neuromasts i denna region av en 24 tim 0,004% gentamicin behandling (som tidigare rapporterats i Van Trump et al. ¹⁷⁾ som gör det möjligt för en efterföljande noggrann bestämning av neuromast regenerering (jämför figur 1B och 1E och infällda med figur 2, 0 h).

p_upload/51343/51343fig1highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 1. Det fluorescerande mönster av neuromast inom stygn av den vuxna zebrafisk visas längs den longitudinella axeln. Panel A är huvudet regionen, Panel B Mid-kroppsområdet med fyra stygn som används för kvantitativ analys som skisseras med en ruta. Panel C är Posterior-kroppsregionen. Panel D är stjärtfenan regionen. En högre förstoring av de 4 stygn i mitten av kroppen område som används för kvantitativ analys visas i panelen E. Förstoring Power of 1X och 2X.

Det har rapporterats att kopparsulfat behandling är en effektiv kemisk metod för att framkalla en snabb nekros av hårceller i embryon och larver ^21. Här vi testade kopparsulfat behandling med hopp om att det skulle kunna förkorta tiden för att framkalla neuromast ablation. Kopparsulfat koncentrationer som sträcker sig från5-50 mM för olika exponeringstider upp till 48 h utnyttjades såsom tidigare rapporterats av Liang et al. ²¹ Det visade sig att kopparsulfat var dödlig vid de högre koncentrationerna och inte effektiv vid lägre koncentrationer i en vuxen fisk (data visas ej) . Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Parametrar som används för fluorescerande analys av sidolinje förnyelse i vuxen zebrafisk.

Regenere övervakades efter alla neuromasts inom de fyra halva kropps maskor var ablateras följande 24 tim gentamicin-behandling (figur 2, jämför 0 tim med kontroll) och positiv regenere bestämdes genom uppkomsten av ett minimum av tre neuromasts inom en söm. (Figur 2, 0 h). Av 8 HPG, hade ungefär en tredjedel av fisken några tecken på återhämtning (n = 34); även om intensiteten i neuromasts var svag i det regenererande sömmarna (Figur 2, 8 tim, svaga sömmar beskrivs av rutorna). Antalet neuromasts och deras intensitet fortsatte att öka linjärt tills regenere nådde en platå vid 16 hpg (jämför figur 2, 16 h med fig. 2, 8 h). Det var inte förrän minst 24 hpg att all fisk som behandlats med gentamicin hade återhämtat sig helt med både lika många och intensiteten hos neuromasts inom sido stygn linje jämfört med kontroller (Figur 2, 24 tim). En time-line för neuromast regeneration efter gentamicin indragning visas i fig 3, som visar de linjära och platåfaserna återhämtningskurvan. Vi noterar att i mindre än 5% av fallen hade de regenererande stygn visas inte som enskilda enheter, men i stället framträdde som ett utstryk av fluorescens.

Figur 2. Fluorescerande bilder av neuromasts. Styr fisk, 0 Hr fisk (direkt efter 24 h av 0,004% gentamicin behandling), 8 Hr fisk (8 HPG) med någon svag färgning av neuromasts inom de 4 stygn som används för kvantitativ analys (endast 30% av all fisk som uppvisade detta mönster av färgning på 8 HPG, 70% visade ingen neuromast färgning vid denna tidpunkt, de vita rutorna beskriva de svagt färgade neuromasts som sågs i 30% av fisk som uppvisade någon grad av regenerering vid 8 HPG), 16 Hr fisk, och 24 Hr fisk. Fullständig regenerering av neuromasts inom de 4 stygn i fråga om 1) det antal neuromasts och 2) intensitet färgning av neuromasts observerades med 24 hpg. klicka gärna härse en större version av denna siffra.

Figur 3. Diagram som visar tidsförloppet för neuromasts regeneration efter tillbakadragande från 24 tim behandling av vuxna zebrafisk med 0,004% gentamicin. Som visas, börjar återhämtningen vid 8 hpg tidpunkt och nådde en platå vid 16 hpg tidpunkt. Detta definieras linjefasen av neuromast regeneration mellan 8-16 tim och tidpunkter inom denna linjär fas bör användas för att kvantitativt jämföra kontroll-och experimentgrupper.

Neuromast toxicitet induceras av långvarig exponering för fluorescerande färgnings färgämnen.

Vi bedömer ett idealiskt sätt att utföra dessa experiment skulle vara att färga fisken med fluorescerande färg före behandling, bets igen på 0 tim sedan färga igen ent regenere tidpunkter. Men vi stött på en komplikation till dessa studier som är det faktum att håret cell fluorescerande färgnings färgämnen såsom 4-di-2-Asp, som kan vara fallet med andra mitokondriella fläckar ²² kan ha en toxisk effekt på hårceller ^23. Detta faktum krävs för oss att använda separata grupper av fisk eftersom upprepad färgning av samma fisk kunde inte användas. I alla fall den experimentella fisk inklusive kontroller behandlades parallellt för att eliminera experimentell variabilitet.

Confocal analys på nivån för enskilda hårceller.

Om de resultat som erhålls från neuromast analysen är inte statistiskt signifikant mellan kontroll-och experimentgrupper, kan man utvidga dessa studier till nivån för de enskilda hagel cellerna för att få en högre grad av upplösning för kvantitativa jämförelser. Såsom indikeras i Figur 4, neuromasts från en kontrollgrupp (enMast vid 12 h av regenerering är visad i denna figur) kan ses av konfokalmikroskopi av preparat huden från mitten av kroppsområdet. Vid 8 timmar, 10 timmar och 12 timmar av förnyelse tid, fann vi att kontrollgrupperna (7 djur / grupp) hade en räckvidd på 0-4 hår celler / neuromast. Som förväntat för kontrollgrupper, då analyseras kvantitativt, ingen statistisk skillnad mellan neuromasts detekterades i termer av antalet hårceller per neuromast vid tidpunkterna som anges ovan (P-värden varierade från 0,230 till 0,472). En sådan strategi kan tas mellan varje kontroll-och experimentgruppen när det behövs för att utvidga eller bekräfta uppgifterna från den första fasen av neuromast studier.

Figur 4. Analys av hårceller / neuromast förnyelse använda hud preparat av den definierade sido regionen linje som beskrivs in protokollsteg 3.3. Fluorescerande konfokala bild av hårceller i en neuromast erhållits från en zebrafisk hud förberedelse. Två vitala färgämnet färgade hårceller visas inom en neuromast av en kontroll fisk (fig. 4). Denna bild erhölls 12 timmar efter borttagning av gentamicin (linjär regenereringsfasen). Den vita fästet symbolen () visar en individuell neuromast medan den vita pilen indikerar en stödjande celler som omger hårcellerna. Supporting celler inte färgas under dessa betingelser och visas som svarta ytor. Förstoring, 60X.

1	1. Gentamicin behandling [0,004% (4,32 mM)] i kontroll-och experiment fisk till 24 h vid 28 ° C med användning av en inkubator.
2	2. Skölj av gentamicin för att initiera regenerering av hårceller. Gå tillbaka fisken till 28 ° C inkubator för utredaren utvalda tidsperioder mellan 8-16 timmar.
2	3. Vitala färgämnet fläck [0,08% 4-4-diethylaminostyryl-N-metylpyridiniumjodid (4-Di-2-Asp)]-kontroll och försöksfisk i 1 h vid rumstemperatur och sedan tvätta ut fläcken med fisk vatten för fluorescerande avbildning.
1 eller 2	4. Om det är nödvändigt på grund av icke-signifikanta resultaten från analysen av neuromasts, upprepa Protocols 1-3 med en separat grupp av kontroll-och experiment fisk, men då få en hud förberedelse för konfokal analys av enskilda hårceller.

Tabell 1. En sammanfattning av det protokoll som beskrivs ovan.

Discussion

Baserat på den omfattande litteratur som har fastställts för analys av sidolinje (LL) förnyelse i embryonal och larver zebrafisk ^8,24,25, var målet för vår studie för att utveckla en kvantitativ analys för sidolinje förnyelse i zebrafisk som kunde tillämpas på sjukdomsmodeller som är bäst studeras i den vuxna fisken. Vi fann att vissa kritiska punkter är viktiga när de ansöker förfaranden som utvecklats för embryonal / yngel till vuxen fisk. Den viktigaste av dessa punkter betraktas: 1) Antalet sidolinje neuromasts längs den längsgående axeln på fisken, 2) hur länge färgning av neuromast hårceller, 3) den koncentration och behandlingens varaktighet av aminoglykosid, och 4) tidpunkten för sidolinje regeneration efter aminoglykosid behandling. Dessa punkter kommer att behandlas i den följande diskussionen.

I beaktande av det antal neuromasts längs sidolinjen av zebrafisk, Embryonal och larver zebrafisk har den klara fördelen att neuromasts har ett enkelt mönster på grund av deras lägre antal inom en viss söm jämfört med vuxna fiskar. Det låga antalet har gjort utredare för att tydligt identifiera varje neuromast och tilldela ett namn till den ^6. På detta sätt, kan regenereringsstudier kvantifiera återkomsten av en särskild neuromast med namn när som helst efter tillbakadragande från en aminoglykosid agent. Den större antal neuromasts per stygn i vuxen introducerar betydande svårigheter att exakt räkna och kvantifiering under återkomsten av regenere neuromasts jämfört med den hos embryon eller yngel. Såsom visas, bedömde vi mönstret av lateral neuromasts line inom stygn av den vuxna och bestämt att mittkroppen (Figures. 1 och 2) anordnade den optimala området av stygn för analys.

Färgning av neuromasts med hårceller färgämnen, såsom 2 - [4 - (dimetylamino) styryl]-N-ethylpyridinium jodid (DASPEI) eller 4-di-2-Asp gör att man kan visualisera neuromasts av sidolinjen med hjälp av fluorescerande stereomikroskopi ^26,27 i larver och ungfisk. Samma fläckar är också effektiva i den vuxna fisken och vår kvantitativa analysen visade att ingen signifikant skillnad i antalet neuromasts i mitten av kroppen regionen observerades hos normala kontrollzebrafisk (med ett genomsnitt på 61,45 neuromasts i normala kontroll vuxen fisk).

Det har rapporterats att håret cell färgämnen, såsom 2 - [4 - (dimetylamino) styryl]-N-etylpyridiniumjodid (DASPEI) eller 4-di-2-Asp själva kan vara toxiskt för neuromast celler ^24, och fisk kan inte vara flera gånger färgas med dessa fluorescerande medel om man ska följa aminoglykosid-inducerad regeneration. Upprepad färgning av samma fisk introducerar flera toxicitets händelser (både av fläcken och aminoglykosid), som gör experimentet avin tolkningsbar ^23. Följaktligen, alla experimenti vår studie krävs parallell 4-di-2-Asp färgning av flera uppsättningar av fisk i syfte att visa att neuromasts var 1) förekommer i den icke behandlad gentamicin kontrolltillstånd, 2) helt borttagen omedelbart efter gentamicin exponering, och 3) regenere på några timme efter gentamicin-behandling efter tillbakadragande och tvätta ur denna aminoglykosid. På detta sätt var alla fisk färgades endast en gång med neuromast färgämne.

Det bör påpekas att medan förfarandena i Van Trump et al. ¹⁷ fastställa villkoren för hår cell ablation i vuxen fisk de inte skapa en standardkurva för neuromast förnyelse som krävs för kvantitativ jämförelse mellan kontroll-och experimentgrupper. Vi följde därför förfarandena i Van Trump et al. ¹⁷ för hår cell ablation (gentamicin koncentration av 0,004% genom att använda en 24 hr exponeringstid, se Figur 2 för hårceller ablation resultat på 24hr) men förlängde sitt arbete för att upprätta en standardkurva för neuromast förnyelse. Detta gör det möjligt för en jämförande analys av LL förnyelse i den vuxna zebrafisk med hjälp av de fyra stygn i mitten av kroppen region som vi etablerat för våra analysförhållanden (se figur 1 och 2). I syfte att bestämma om kunde erhållas en kortare period för hårceller ablation, testade vi också effekten av kopparsulfat som effektivt används i yngel för perioder så korta som 2 timmar. Våra studier indikerade att kopparsulfat (5 till 50 mM för olika exponeringstider upp till 48 h såsom tidigare rapporterats av Liang et al. ²¹ för larver) befanns inte vara effektiva för vuxen fisk som ett medel för hår cell ablation. Detta belyser det faktum att villkoren som används för ablation av hårceller i embryon och yngel kan inte alltid överföras direkt för att användas med de vuxna fiskarna.

Som hänför sig till sidolinjeförnyelse i den vuxna, fann vi liknande tidsramar för regenerering av neuromasts mellan det av embryo / larv och vuxen fisk. Som tidigare rapporterats av andra, zebrafisk embryon och larver show neuromast regenerering vid 12-24 timmar efter aminoglykosid wash-out ^8. Vi observerade den linjära fasen av neuromast förnyelse som förekommer i 8-12 tidsram (inte som fullvärdiga stygn för 8 tim tidspunkt som visas i figur 2) med en platå nås på 16 hpg. Fullständig kontroll-liknande utseende neuromasts inom stygn observerades inte förrän 24 hpg som rapporterats för embryon och larver. Fullständig kontroll-liknande utseende betecknar både antal och intensitet neuromasts inom alla fyra stygn i mellankroppsregionen i vuxen zebrafisk. Dessutom, om de kvantitativa resultaten erhållna vid nivån för de neuromasts är inte statistiskt signifikant, kan undersökaren förlänga sina studier till nivån för de individuella hårceller inom neuromastsmed hjälp av konfokalmikroskopi som beskrivs av våra rutiner.

Den neuromasts / hår cellförnyelsen analys som beskrivs i denna artikel kan tillämpas på sjukdomstillstånd som är bäst manifesteras i den vuxna zebrafisk i stället i början av larv / embryonala stadier. En begränsning av analysen avser effekten av det experimentella tillstånd vare sig det är en) den transgena stammen som efterliknar ett särskilt sjukdomstillstånd eller 2) en farmakologiskt inducerad sjukdomstillståndet] på stamceller inom den laterala systemet linje av vuxna zebrafisk. I detta avseende ett särskilt sjukdomstillstånd hos vuxna zebrafisk kan eller inte kan påverka stamceller av håret cellhärstamning, och det är viktigt att notera att neuromast regenerering är helt beroende av dessa stamcellsproliferering / differentieringsprocesser ^8,24,25 .

Som ett exempel på denna begränsning, kommer vi att beskriva experiment som utförs på en vuxen zebrafisk modell av typ I-diabetes. Denna particular sjukdomsmodell utvecklades i vuxen zebrafisk för att studera den långsiktiga sekundär komplikation som induceras av hyperglykemi ^28. Av ett antal skäl som beskrivits tidigare ^28,29, kan dessa studier endast utföras med användning av vuxna zebrafisk. Eftersom perifera nerver tillsammans med de specialiserade cellstrukturer som de innerverar påverkas negativt hos patienter med diabetes, ville vi att bestämma, om sidolinje förnyelse av neuromasts / hårceller var också nedsatt hos diabetiker zebrafisk. Med hjälp av sidoanalyslinje regeneration ingen statistiskt signifikant fördröjning upptäcktes i neuromast förnyelse. För att bekräfta detta negativa resultat ledde till att experiment upprepas vid den mer raffinerade för det enskilda håret cellen. Återigen var ingen statistiskt signifikant skillnad observerades i hår cellförnyelsen mellan kontroll och diabetes grupper. Därför datan var oförenligt med antagandet att hyperglykemi hindrar neuromast / hår cellförnyelsen, possibly beror på motståndet av stamceller av håret cell lineage till hyperglykemiska betingelser. Med denna begränsning i åtanke, det neuromasts / hår cellförnyelsen analys som beskrivs i den här artikeln inte är ett sätt att testa om en viss vuxen zebrafisk sjukdomsmodell innebär dysfunktion i håret cellen regenerativ process som övervakas med hjälp av sidosystemet linje. Positiva resultat skulle innebära stamcells engagemang och fortsatta studier skulle därför vara motiverad.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gentamicin sulfate solution (50 mg/ml)	Sigma Aldrich	G1397
2 Phenoxyethanol	Sigma Aldrich	P1126
4-4-Diethylaminostryryl-N-methylpyridinium iodide (4-Di-2-Asp) in methanol	Aldrich	D-3418	485 nm excitation λ and 603 nm emission λ
6-well Plates	Mid Sci	TP92006
Petri Dishes	Fisher Scientific	08-757-13
Glass Bottom Microwell Dishes	Matek Corporation	P35G-1.5-14-C
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S3014
Dissecting  Microscope	Nikon	TMZ-1500	Any dissecting microscope is fine.
Camera for Imaging	Nikon	Q imaging	Any camera is suitable.
ImageJ software	National Institutes of Health	NIH Image
NIS Elements	Nikon		Any imaging software is suitable.
Confocal microscope	Olympus	FV10i	Any high resolution fluorescent microscope is suitable
Aquatic System	KG Aquatics ZFS Rack System		Any aquatic system can be used