Summary
Proteine di superficie cellulare sono biologicamente importante e ampiamente glicosilata. Vi presentiamo qui un approccio glicopeptide-capture per solubilizzare, arricchire, e deglycosylate queste proteine per facili analisi proteomica basati LC-MS.
Abstract
Proteine di superficie delle cellule, tra cui proteine della matrice extracellulare, partecipano a tutti i principali processi e le funzioni cellulari, come la crescita, la differenziazione e la proliferazione. Una caratterizzazione completa di queste proteine fornisce informazioni ricche per la scoperta di biomarcatori, identificazione del tipo cellulare, e la selezione della droga-obiettivo, oltre a contribuire ad avanzare la nostra comprensione della biologia e fisiologia cellulare. Proteine di superficie, tuttavia, presentano notevoli difficoltà analitiche, a causa della loro intrinsecamente bassa abbondanza, elevata idrofobicità e pesanti modificazioni post-traduzionali. Approfittando della glicosilazione prevalente sulle proteine di superficie, vi presentiamo qui un approccio glicopeptide-capture high-throughput che integra i vantaggi di diversi esistenti mediante N-glycoproteomics. Il nostro metodo può arricchire i glicopeptidi derivati da proteine di superficie e rimuovere i loro glicani per proteomica facili con LC-MS. La N-glycoproteome risolto comprende le informazione di identità proteine e quantità nonché i loro siti di glicosilazione. Questo metodo è stato applicato a una serie di studi in settori quali cancro, cellule staminali, e tossicità da farmaci. La limitazione del metodo risiede nella scarsa abbondanza di proteine di membrana di superficie, tale da richiedere una relativamente grande quantità di campioni per questa analisi rispetto agli studi centrati sulle proteine citosoliche.
Introduction
Proteine di superficie cellulare interagiscono con l'ambiente extracellulare e trasmettere i segnali dall'esterno verso l'interno di una cella. Così, queste proteine, incluse le proteine della matrice extracellulare, giocano ruoli critici in tutti gli aspetti della biologia e fisiologia vanno dalla proliferazione, crescita, migrazione, differenziazione all'invecchiamento e così via cellulare. Proteine di superficie funzionano interagendo con altre cellule, proteine e piccole molecole 1-3. Caratterizzazione molecolare di proteine della superficie cellulare è di grande interesse non solo per i biologi ma anche per le aziende farmaceutiche, come più del 60% dei farmaci sono mirati alle proteine della superficie cellulare 4.
Spettrometria di massa tandem (MS), con la sua straordinaria sensibilità, precisione e velocità per l'identificazione di proteine e peptidi, è stato un potente strumento per studi di proteomica globali 5,6. Eppure, proteine di superficie pongono sfide significative proteomica basati su MS, comeesistono maggior parte delle proteine di superficie in piccole quantità e con modifiche pesanti. Le regioni membrane-spanning delle proteine di superficie li rende idrofobo; questo è particolarmente il caso per le proteine transmembrana multipass. Perciò è difficile da sciogliere proteine di membrana in soluzione acquosa senza l'aiuto di un detersivo; tuttavia l'uso di detergenti generalmente sopprime le prestazioni di HPLC e MS 1,7,8 nella identificazione delle proteine. Pertanto, proteine di membrana sono stati mal caratterizzato proteomica diretti basati LC-MS.
La glicosilazione è una delle più importanti e abbondanti modificazioni post-traduzionali che avvengono nelle proteine della superficie cellulare 9. L'enorme complessità e l'eterogeneità dei glicani ostacolano segnale peptidi 'MS 10. Tuttavia, diversi metodi di proteomica hanno utilizzato questa modifica unica per arricchire proteine di superficie e per rimuovere le frazioni di zucchero da proteine prima analisi LC-MS. Questi metodos comprendono basato lectina affinità cattura 11 e acido borico-based o basati hydrazide-capture chimica 12 così come separazioni cromatografiche idrofili 8,13. La rimozione di glicani trasforma proteine di membrana alle proteine regolari e semplifica drasticamente la caratterizzazione MS. Poiché glicosilazione avviene anche in proteine secrete che hanno elevata solubilità in contrasto con proteine di membrana, molti metodi glicoproteomica sono ottimizzati per le proteine solubili, e tendono ad avere minore selettività glicopeptidi e sensibilità quando viene distribuito proteine di membrana 8,14. Esistono anche altri metodi per arricchire, in particolare, le proteine di superficie cellulare, come quelli che usano ultracentrifugazione 15 e strategie di etichettatura 16. Un confronto dettagliato tra il nostro metodo e altri metodi esistenti per la caratterizzazione di proteine di membrana è stata condotta recentemente 17, ei risultati hanno indicato che il metodo può eseguire altrettanto bene, se nonmeglio, di tutti i metodi rispetto proteomica membrana, ma con una maggiore semplicità.
Per aiutare i ricercatori utilizzano questo metodo, i dettagli qui un protocollo generale. Questo metodo integra diversi vantaggi di strategie glycoproteomics esistenti ed è stato ideato specificamente per glicoproteine di membrana, ma il metodo funziona ugualmente bene per proteine secrete. Le caratteristiche di questo metodo includono: 1) una completa solubilizzazione delle proteine di membrana, 2) un arricchimento di glicopeptidi invece di glicoproteine per eliminare il potenziale sterico quando si usa un substrato solido cattura, 3) l'uso della chimica idrazide per formare legami covalenti tra glicopeptidi e il substrato di cattura, in modo che i glicopeptidi legati possono tollerare lavaggi stringenti per alta glycoselectivity, e 4) la capacità di condurre l'intera procedura di cattura in una provetta per la perdita di campione ridotto e durata procedura abbreviata. Dopo aver implementato questo metodo per studiare una variabileety di campioni biologici comprese le cellule e tessuti, abbiamo osservato una selettività elevata (> 90%) di glicoproteine 8,17,18.
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Protocol
1. Harvest Membrane
- Aggiungere tampone ipotonico (10 mM Tris-HCl, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl 2, pH 8,0) con cocktail inibitore di proteasi su un pellet di cellule (~ 10 8 cellule) e incubare per 15-30 min in ghiaccio. Lisare le cellule di passare il campione attraverso aghi da siringa (5-10 passaggi) o omogeneizzare il campione da un omogeneizzatore Dounce (15-30 colpi). Utilizzare un emocitometro e trypan colorazione blu per controllare l'efficienza della lisi.
- Ottenere la frazione microsomiale da una centrifugazione differenziale del lisato a 3.000 gx 15 min e poi a 100.000 gx 2 hr. La prima centrifugazione ottiene un pellet che è la frazione nucleare, e la successiva centrifugazione del supernatante genera una seconda pellet, che è la frazione microsomiale che contiene la membrana plasmatica e membrana organelli 8. Il supernatante finale è la frazione citosolica. Conservare le frazioni microsomiali a -80 ° C freezer per ulteriori analysè come di seguito indicato.
2. Sciogliere, Denaturare, e digerire proteine di membrana
- Sciogliere la frazione microsomiale nel buffer di denaturazione (Tris 40 mM, EDTA 10 mM, TCEP 10 mM, 0,5% Rapigest, pH 8) e poi incubare la soluzione a 100 ° C per 10 min.
- Raffreddare la soluzione riscaldata a temperatura ambiente, aggiungere ultra-elevata purezza urea polvere nella soluzione 8 M concentrazione finale e incubare il campione a 37 ° C per 30 min.
- Aggiungere iodoacetamide soluzione madre al campione di 15 mM concentrazione finale, e incubare la soluzione al buio per 30 minuti a temperatura ambiente per alchilare i tioli liberi nel campione. Aggiungere soluzione madre DTT al campione a una concentrazione finale 10 mM e incubare la soluzione per altri 10 min a temperatura ambiente per estinguere l'eccessiva iodoacetamide.
- Diluire la soluzione 10x ottenuto con tampone Tris 40 mM a pH 8, e successivamente aggiungere tripsina al campione con un rapporto 1:20 trypsin di proteine totali. Mantenere la reazione di digestione a 37 ° C per una notte forno per garantire la reazione è completa.
- Terminare la digestione acidificando la soluzione del campione a pH 1 con HCl, una condizione che rompe anche il detersivo, cioè Rapigest. Degradare la Rapigest a 37 ° C per 1 ora, e rimuovere la precipitazione sviluppato da centrifugazione.
- Pulire il surnatante contenente peptidi campione da una cartuccia di estrazione C-18 in fase solida (SPE) e asciugare il campione ottenuto da speedvac.
- Effettuare una analisi SDS-PAGE di campioni prima e dopo digestione con tripsina per confermare l'efficienza digestione.
3. Glycopeptide Capture
- Sciogliere i peptidi puliti nel buffer di accoppiamento (acetato di sodio 100 mM, pH 5,5). Aggiungere periodato di sodio nella soluzione peptide ad una concentrazione finale di 10 mM per 30 minuti al buio, a temperatura ambiente. Questo si ossida i gruppi cis-diolo nei glicani ad aldeidi, Che permettono ai glicani ad accoppiarsi con la resina attraverso la chimica idrazide. Quench l'eccessiva periodato da solfito di sodio ad una concentrazione finale di 20 mM e pH 5 per 10 min a temperatura ambiente.
- Introdurre resina idrazide derivatizzato nella soluzione peptide ad un rapporto di 1:4 (resina di soluzione) per accoppiare glicopeptidi alla resina. Incubare la reazione a 37 ° C per 1-2 giorni con rotazione end-to-end per l'accoppiamento completo.
- Rimuovere i peptidi non legati mediante lavaggio della resina due volte con 1 ml di ciascuno dei seguenti: acqua deionizzata, 1,5 M NaCl, metanolo e 80% acetonitrile. Infine, lavare la resina con 3x 1 ml di 100 mM NH 4 HCO 3 a pH 8 per scambiare il buffer del sistema a 100 mM NH 4 HCO 3.
- Raccogliere il surnatante e lavaggi per l'analisi dei peptidi non legati (opzionale).
- Rilasciare N-glicopeptidi dalla resina mediante PNGase F in una notte di incubazione a 37 ° C con unn end-to-end di rotazione. Raccogliere i peptidi rilasciati da centrifugazione e lavaggio acetonitrile 80%. Essiccare la soluzione ottenuta nello speedvac per l'analisi LC-MS.
4. Ulteriore frazionamento (facoltativo)
Per semplificare ulteriormente la complessità dei campioni, frazionare N-glicopeptidi ottenuti. Ad esempio, i peptidi ridisciogliere secchi in 10 mM ammonio formiato, pH 3 con 20% acetonitrile e utilizzare forte scambio cationico (SCX) cromatografia di frazionare i peptidi. Essiccare il eluente ottenuto, e quindi analizzare le frazioni peptidiche ottenute dalla fase inversa LC-MS 8,17,18.
5. Pulizia di N-glicopeptidi Rilasciato (facoltativo)
Se preoccupazioni aumentano per il potenziale contaminazione dei peptidi, scioglierla peptidi secchi in 0,1% di acido formico e utilizzare una colonna MCX SPE per pulire ulteriormente i peptidi prima fase inversa analisi LC-MS.
Durante la scissione selettiva di N-glicopeptidi largo della resina, PNGase F converte l'asparagina collegato N-glicani di un acido aspartico. Pertanto, vi è una massa 0,9840 Da spostamento dei liberate N-glicopeptidi. Per identificare accuratamente questi peptidi, questa modifica deve essere aggiunto ai parametri di ricerca insieme con modifiche comuni come il carbamidometilazione della cisteina e ossidazione della metionina.
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Representative Results
Un diagramma di flusso rappresentante della procedura sperimentale è riassunto nella Figura 1. L'etichettatura e ulteriori fasi di frazionamento sono opzionali e dettagli sono descritti in una recente pubblicazione 18. Un'altra opzione è quella di analizzare i peptidi modificati, che non reagiscono con la resina. I vantaggi di analisi dei peptidi modificati includono una possibile identificazione di peptidi e proteine non glicosilati, come claudine in giunzioni strette; Un ulteriore vantaggio è la quantificazione più precisa. Sulla base di questi vantaggi, abbiamo chiamato questo metodo g ssisted-g lobal q roteomics p uantitative (gagQP) a lycocapture-e dettagliata l'analisi in recenti pubblicazioni 18.
Un tipico spettro glicopeptidi taken dopo il metodo di arricchimento è mostrato in Figura 2. Nel glicopeptidi ottenuto, la N-glicani è stato rimosso e l'asparagina-glicani divisoria (N) wcome convertito in un acido aspartico (D) da PNGase F; quindi, lo spettro può essere facilmente cercati utilizzando qualsiasi motore di ricerca proteomica contro database di sequenze proteiche comune.
Il metodo di cattura può essere valutato in commercio modello glicoproteine prima della sua applicazione con campioni biologici complessi e di valore. Alcune glicoproteine modello di uso frequente includono avidina (pollo), ovalbumina (pollo), invertasi (lievito), α-1 antitripsina (umana), conalbumina (pollo), e ribonucleasi B (bovina) (tutti possono essere ottenute da Sigma). I glicopeptidi frequentemente identificati da queste proteine possono essere trovati in una pubblicazione precedente 8. Un database FASTA proteina-sequenza personalizzata che è adatto per la ricerca automatica dei risultati LC-MS generati da queste proteine modello può essere scaricato dal seguente link (http://www.sfu.ca/chemistry/groups/bingyun_sun/tools.html ), che comprende le suddette proteine modello quotate nonché un riv ersed database di lievito-sequenza, contaminanti comuni e PNGase F.
Un risultato tipico LC-MS di N-glicopeptidi catturati è mostrato in Figura 3, in cui più di 100 glicoproteine possono essere identificati da una singola analisi LC-MS di una frazione microsomiale cella. La selettività arricchimento per entrambe le glicoproteine e glicopeptidi è generalmente superiore al 90%. Un'analisi efficace può avere una selettività arricchimento del 95%. Utilizzando una colonna SCX e passo gradiente di frazionare ulteriormente i campioni prima LC-MS analizza solito raddoppiare il numero di identificazioni glicoproteina 17. A volte, quando la quantità dei glicopeptidi ottenuti è basso, l'impurità accumulata dai flaconcini può essere osservato nel campione finale. Questi contaminanti possono essere rimossi mediante il metodo fornito nella fase 5.
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Passi e diamanti Figura 1. Diagramma di flusso della procedura sperimentale. Rettangoli sono tenuti sono passaggi facoltativi.
Figura 2. Collision indotta dissociazione (CID) spettro di AEPIL N ISNAGPWSR dal lievito del panettiere dopo il metodo glicopeptidi cattura. L'asparagina sottolineata (N) viene convertito in acido aspartico (D), come evidenziato in rosso nella sequenza peptidica in figura .
Figura 3. Trama 2D del risultato LC-MS della N-glycopeptides ottenuti da cellule staminali embrionali di topo (E14.Tg2a). I punti sono i peptidi identificati, e il colore del punto rappresenta la fiducia identificazione ottenuti statisticamente (cioè probabilità peptide).
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Discussion
Qui vi presentiamo una strategia glicopeptide-capture per il profiling di proteine della superficie cellulare. Il metodo può essere applicato per studiare le proteine secrete, come quelle presenti nel sangue, così come in altri fluidi corporei o in cellule di coltura.
Il successo del metodo si basa sulla digestione completa di campioni; Pertanto, una caratterizzazione SDS-PAGE dell'efficienza digestione è necessario, in particolare per l'analisi prima volta di un campione. Un digestione completa può essere difficile per proteine di membrana, e può essere possibile solo dopo solubilizzazione completa della frazione di membrana. Il processo di solubilizzazione inizia quando viene introdotto il detersivo e termina dopo l'incubazione di urea. Pertanto, se nuvolosità presenta nel campione prima dell'aggiunta di urea ma scompare dopo urea incubazione, la solubilizzazione è sufficiente. Se la frazione di membrana è difficile da sciogliere, aumentare la quantità di detersivo utilizzato. Per i campioni di tessuto ricco di membranaquali i tessuti cerebrali e adiposi, 5% Rapigest può essere utilizzato. A volte, precipitazione può apparire durante la diluizione dei campioni prima della digestione tripsina, che è più frequentemente osservate in campioni di siero umano. La causa di questa precipitazione è principalmente le riduzione delle concentrazioni di urea e detergente. Questa precipitazione sarà generalmente rimosso dalla tripsina durante la digestione e non è una preoccupazione. Tuttavia, quando le forme di precipitazione, è importante ruotare la fiala del campione durante la fase di digestione per assicurare una buona miscelazione. Il pH della fase glycocapture è importante perché le ammine primarie peptidi, come quelli da N-terminali e lisine, reagiscono con le aldeidi neoformati dopo l'ossidazione periodato. Pertanto, è importante protonare queste ammine regolando il pH della soluzione cattura di sotto di 6,0 utilizzando tampone acetato, per evitare che interferisca con la cattura.
Utilizzando un rapporto di resina per catturare una soluzionetondo 1:03-01:04 assicura miscelazione sufficiente durante la fase di acquisizione. È necessario sulla base della nostra esperienza un minimo di 50 ml di resina; quantitativi inferiori renderanno la successiva serie di lavaggi difficili da eseguire e introdurranno perdita campione grave a causa della perdita di resina. Abbiamo ottenuto buoni risultati con 100-300 ml di resina di 0,5-2 mg di proteine totali. Tuttavia, il rapporto tra la quantità di proteine e resina può essere di esempio dipendente, ti consigliamo di ottimizzare questa condizione per i vostri campioni e applicazioni specifiche.
La chimica hydrazide cattura entrambi gli O-e glicopeptidi N-linked sul substrato; a causa della mancanza di un enzima efficace per rilasciare tutti i glicopeptidi O-linked, abbiamo usato solo PNGase F per studi N-glicopeptidi 8,12. La possibilità di studiare il O-tipo di glicopeptidi può richiedere la scoperta o bioingegneria di idrolasi appropriati.
Questo metodo può essere messo in pausa in vari placci compresi: 1) dopo aver ottenuto la frazione di membrana, 2) dopo digestione con tripsina e pulizia dei peptidi, e 3) dopo liberazione di N-glicopeptidi. Ulteriori procedure potranno essere introdotte in questi intervalli. Ad esempio, i peptidi digeriti possono essere differenzialmente etichettati da N-isotags come indicato nella figura 1, per l'analisi quantitativa. Utilizzando un metodo chiamato gagQP, in cui i peptidi non modificati vengono analizzati in parallelo con i glicopeptidi, la precisione di quantificazione può essere significativamente migliorata come abbiamo dimostrato in una recente pubblicazione 18.
Glicopeptide cattura si può efficacemente diminuire la complessità dei campioni, e non è generalmente necessario frazionare ulteriormente le arricchita N-glicopeptidi. Le eccezioni si applicano a situazioni in cui i campioni sono abbondanti, ma con dinamiche di concentrazione consistenti, e le proteine di interesse sono in condizioni di scarsa abbondanza, come nella scoperta dei biomarcatori proteici sangue oper l'elenco completo di proteine di superficie cellulare. In queste circostanze ulteriore frazionamento può essere implementata per N-glicopeptidi catturati per fornire una migliore penetrazione del glycoproteome. Poiché il fondo del glycoproteome viene affrontato attraverso frazionamento, l'identificazione dei non glicopeptidi introdotte dal legame non specifico aumenterà. Un decremento di glicopeptidi e selettività glicoproteina (a ~ 85%) saranno tipicamente osservati dopo un ulteriore frazionamento di N-glicopeptidi 17. Pertanto, i ricercatori devono soppesare i pro ei contro quando si progetta la procedura più adatta.
Per i ricercatori che non hanno mai usato un metodo di N-glicopeptidi-capture, è meglio praticare il metodo con un paio di puro N-glicoproteina (s) aver conosciuto siti di glicosilazione come indicato in precedenza 8. Questo metodo è robusto e la selettività a N-glicopeptidi è alto. Un inconveniente di questo metodo risiede nella scarsa abbondanza inerente surfaccia N-glicoproteine; per una caratterizzazione completa del campione, di grandi quantitativi è generalmente richiesto di quello di proteomica citosolici. Tuttavia, se le cellule coltivate possono essere espanse in vitro o tessuti di interesse sono abbondanti, questo inconveniente è trascurabile.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata finanziata dal fondo di avvio della Simon Fraser University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DTT | Sigma | 646563 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Iodoacetamide | Sigma | A3221 | |
| Rapigest SF | Waters | 186001860 | |
| Sodium periodate | Sigma | 311448 | |
| PNGase F | New England Biolabs | P0704S | |
| Affi-Gel Hz hydrazide gel | Bio-Rad | 153-6047 | |
| Trypsin | Worthington Biomedical | LS02115 | |
| Sep-Pak C-18 cartridge | Waters | WAT054955 | |
| Oasis MCX cartridge | Waters | 186000252 | |
| Protease inhibitor coctail | Sigma | P8340 | |
| Urea | Amersco | 568 | |
| Sodium sulphite | Caledon | 8360-1 | |
| Invertase | Sigma | I0408 | |
| α-1 trypsin | Sigma | F2006 | |
| Ribonulease B | Sigma | R7884 | |
| Avidin | Sigma | A9275 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503 | |
| Conalbumin | Sigma | C0755 |
References
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