Summary
细胞表面蛋白的生物学上重要的和广泛的糖基化。我们在这里介绍一个糖肽捕获的方法来溶解，丰富，并且这些去糖基化蛋白质浅显的LC-MS基础的蛋白质组学分析。
Abstract
细胞表面蛋白，包括胞外基质蛋白，参与所有主要的细胞过程和功能，例如生长，分化和增殖。这些蛋白质的综合表征为生物标志物的发现，细胞类型识别和药物靶点的选择，以及帮助推动我们的细胞生物学和生理学的了解丰富的信息。表面蛋白，然而，构成，因为它们固有的低丰度，高疏水性，并且重的翻译后修饰显著分析挑战。采取上表面蛋白的糖基化常见的优点，我们在这里介绍一种高通量糖肽捕获方法，集成的现有的几种N-glycoproteomics装置的优点。我们的方法可以丰富从表面的蛋白质所产生的糖肽，并删除其聚糖，使用LC-MS浅显的蛋白质组学研究。该解决N-glycoproteome包括INFormation蛋白质的身份和数量，以及糖基化他们的网站。此方法已被应用到了一系列的研究领域，包括癌症，神经干细胞，和药物毒性。该方法的局限性在于表面的膜蛋白，这样，需要相对大量的样品进行该分析相比，研究集中于胞质蛋白的丰度低。
Introduction
细胞表面蛋白与细胞外环境进行交互并从外部中继信号到细胞的内部。因此，这些蛋白，包括细胞外基质蛋白，在细胞生物学和生理学不等的增殖，生长，迁移，分化老化等各方面发挥关键作用。表面蛋白的功能通过与其他细胞，蛋白质和小分子1-3交互。细胞表面蛋白的分子特性是极大的兴趣不仅为生物学家也为制药公司，药品60％以上是针对细胞表面蛋白4。
串联质谱（MS），以其卓越的灵敏度，准确度和吞吐量鉴定蛋白质和多肽，一直是一个强大的工具，用于全球蛋白质组学研究5,6。然而，表面的蛋白质会对质谱为基础的蛋白质组学显著挑战，在低量的重金属修改存在最表面的蛋白质。表面蛋白的跨膜区呈现它们的疏水性;这是特别适用于多通道的跨膜蛋白的情况。因此，这是难以溶解在水溶液中的膜蛋白无洗涤剂的帮助;然而清洁剂的使用普遍抑制高效液相色谱法和质谱1,7,8的蛋白质鉴定的表现。因此，膜蛋白已被鉴定中直接LC-MS基于蛋白质组学很差。
糖基化是发生在细胞表面蛋白9的最重要和最丰富的翻译后修饰之一。聚糖的巨大复杂性和异质性阻碍肽'MS信号10。然而，一些蛋白质组的方法已经使用这个唯一的修改，以丰富的表面蛋白，并从之前的LC-MS分析的蛋白质除去糖部分。这些方法s包括凝集素亲和捕获11和酰肼基或硼酸基化学捕获12以及亲水性色谱分离8,13。聚糖的去除转化膜蛋白常规的蛋白质，并大幅简化了MS表征。因为糖基化还发生在分泌蛋白具有高的溶解度在对比膜蛋白，许多glycoproteomic方法对可溶性蛋白进行了优化，并趋向于具有较低的糖肽的选择性和时被部署到膜蛋白8,14灵敏度。其他的方法也存在丰富，尤其细胞表面蛋白，例如那些使用超速离心15和标记策略16。表征膜蛋白我们的方法和现有的其他方法之间的详细比较了最近进行的17，结果表明，我们的方法可以执行同样出色，如果不是更好，比所有被比较的膜蛋白质组的方法，但具有更高的简易性。
为了帮助研究人员使用这种方法，我们这里详细的一般协议。这种方法综合了现有的glycoproteomics战略几个优点，特别适用于膜糖蛋白构想，但该方法同样适用于分泌蛋白。该方法的特征包括：1）膜蛋白的完全溶解，2）糖肽的糖蛋白，而不是使用固体摄像基板时，以消除潜在的空间位阻的富集，3）使用酰肼化学组成之间的共价键糖肽和捕集基板上，使得键合的糖肽可以容忍严格洗涤的高glycoselectivity，和4）的能力，以对整个捕获过程中一个管用于减少样品损失和缩短操作时间。实施这一方法来研究一个变量后，生物样品包括细胞和组织的ETY，我们观察到的高选择性（> 90％），以糖蛋白8,17,18。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1，嘉实膜
- 添加低渗缓冲液（10mM的Tris-HCl，10mM的氯化钾，1.5毫摩尔MgCl 2，pH 8.0）中与蛋白酶抑制剂混合物到细胞沉淀（〜10 8个细胞），并培育在冰上15-30分钟。裂解细胞通过使样品通过注射器针头（5-10遍），或通过一个Dounce匀浆（15-30冲程）破碎样品。使用血细胞计数器和台盼蓝染色来检查裂解的效率。
- 由裂解物的差速离心获得的微粒体部分在3000 GX 15分钟，然后在100,000 GX 2小时。第一离心分离得到的颗粒，它是细胞核部分，以及上清液的离心分离后产生一个第二沉淀，它是一个包含质膜以及膜结合细胞器8的微粒体部分。最后的上层清液是胞质部分。存储的微粒体部分在-80℃冷冻进一步analys是如下所示。
2，溶解，变性和精华膜蛋白
- 溶解的微粒体部分中的变性缓冲液（40毫摩尔Tris，10mM的EDTA，10mM的TCEP，0.5％品RapiGest，pH8）中，然后孵育溶液，在100℃持续10分钟。
- 冷却该溶液加热至室温，加入超高纯度尿素粉末在溶液中，以800万的最终浓度和孵育的样品在37℃下30分钟。
- 添加碘乙酰胺储备溶液至样品以15mM的终浓度，并孵育在黑暗中的溶液30分钟，在室温下烷基化的游离硫醇的样品中。添加的DTT储液的样品，以10 mM的终浓度，并孵育另外10分钟，将溶液在室温下以淬灭过量的碘乙酰胺。
- 稀释所得到的溶液用10倍的40mM Tris缓冲液在pH为8，并随后添加胰蛋白酶到样品以1:20的比例trypsi的n到总蛋白。保持在37℃的烘箱中过夜消化反应，以确保反应完成。
- 通过酸化样品溶液至pH为1，用HCl，这种情况也发生故障的洗涤剂， 即品RapiGest终止消化。降解品RapiGest在37℃下反应1小时，并通过离心分离除去沉淀开发。
- 清洗包含样品的肽通过C-18固相萃取（SPE）柱并通过SpeedVac中干燥所得到的样品上清液。
- 之前和胰蛋白酶消化，以确认消化效率后执行样本的SDS-PAGE分析。
3，糖肽捕获
- 溶解于偶联缓冲液（100mM乙酸钠，pH 5.5）清洗过的肽。添加高碘酸钠成在10mM的最终浓度为在黑暗中30分钟，在室温下将肽溶液。这会氧化的糖链的顺式二醇基团为醛，这让聚糖对夫妇通过酰肼化学树脂。由亚硫酸钠淬灭过量的高碘酸盐在20mM的最终浓度和pH为5，在室温下10分钟。
- 引入肼衍生的树脂成以1:4（树脂溶液），以一对糖肽与树脂的比率的肽溶液。在37℃下与终端到终端的旋转完全偶合反应1-2天。
- 通过用1ml以下各项的洗涤树脂两次去除未结合的肽：去离子水，1.5 M氯化钠，甲醇和80％乙腈。最后，用1ml 100mM的NH 4 HCO 3洗涤树脂3次，在pH 8至系统的缓冲液交换，以100mM的NH 4 HCO 3。
- 收集上清液和洗涤的未结合的肽（可选）的分析。
- 从PNG酶F IN孵育过夜树脂释放的N-糖肽在37℃与N END到终端的旋转。通过离心和80％乙腈洗收集释放肽。干燥所得到的在SpeedVac中用于LC-MS分析溶液。
4，进一步分馏（可选）
为了进一步简化样品的复杂性，分馏所得到的N-糖肽。例如，重新溶解干燥的肽为10毫米氨甲酸，pH值3用20％乙腈和使用强阳离子交换（SCX）色谱分级分离肽。干燥所得到的洗脱液，然后用反相LC-MS 8,17,18分析所得到的肽组分。
5，清洁释放的N-糖肽（可选）
如果关注上升为肽的潜在污染，再溶解干燥的肽为含0.1％甲酸，并使用一个MCX SPE柱，以进一步清洁肽前反相LC-MS分析。
中的N-糖肽脱树脂的选择性裂解，PNG酶F中的N-聚糖连接的天冬酰胺转换为天冬氨酸。因此，解放区的N-糖肽的0.9840大质量转变。准确地识别这些肽，这种修改需要被添加到搜索参数一起共同修饰如蛋氨酸，半胱氨酸和氧化carbamidomethylation。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
在实验过程中的代表性流程图总结在图1的标签，并进一步分馏步骤是可选的，细节将在近期公布18描述。另一种方法是分析未修饰的肽，其不与树脂反应。分析所述未修饰的肽的优点包括：非糖基化的肽类和蛋白质，例如在紧密连接claudins的电位标识;一个附加的优点是更准确的定量。基于这些优势，我们称之为这种方法 g lycocapture - 一个ssisted-G的叶形q uantitative p roteomics（gagQP），并在最近的出版物18的详细分析。
富集方法之后所采取的典型的糖肽谱示于图2，在所获得的糖肽中，N- 聚糖除去和聚糖连接的天冬酰胺（N）瓦特如通过PNG酶F转换为天冬氨酸（D）;因此，频谱可以很容易地使用任何蛋白质组学搜索引擎对常见的蛋白质序列数据库搜索。
捕获方法可以通过商业化模型糖蛋白之前，其复杂和宝贵的生物样品的应用进行评估。一些常用的模型糖蛋白包括抗生物素蛋白（鸡），卵清蛋白（鸡），转化酶（酵母），α-1抗胰蛋白酶（人），伴清蛋白（鸡），和核糖核酸酶B（牛的）（全部可购自Sigma获得）。从这些蛋白质经常查明糖肽可以在以前的出版物8被发现。自定义的蛋白质序列的FASTA数据库，适合从这些模型中的蛋白质产生的LC-MS结果的自动搜索可以从以下链接（http://www.sfu.ca/chemistry/groups/bingyun_sun/tools.html下载的），包括以上列出的模型蛋白质，以及一个转 ersed酵母序列数据库，常见污染物和PNG酶F。
所捕获的N-糖肽的典型LC-MS结果显示在图3中，其中100多糖蛋白可从细胞微粒体组分的单个LC-MS运行来识别。富集的选择性二者的糖蛋白和糖肽，一般在90％以上。一个成功的分析可以有95％的富集选择性。使用SCX柱和梯度步骤，以进一步分级分离样品之前的LC-MS分析通常会翻一番糖蛋白标识17的数量。有时，当所获得的糖肽的量是低的，从小瓶中积累的杂质，可以在最终的样品中观察到的。这些污染物可以通过在步骤5中提供的方法来去除。
jpg“格式的src =”/ files/ftp_upload/51349/51349fig1.jpg“宽度=”350“/>
图1。流程图实验程序。需要矩形的步骤和钻石是可选步骤。
AEPILÑISNAGPWSR从糖肽捕获方法后，面包酵母的图2。碰撞诱导解离（CID）谱中带下划线的天冬酰胺（N）转换为天冬氨酸（D），如在图中的肽序列以红色突出显示。
的N-GL的LC-MS结果如图3所示。2D情节从小鼠胚胎干细胞（E14.Tg2a）中得到ycopeptides的点是所检测到的肽，以及该点的颜色代表统计学上获得的识别置信度（ 即肽概率）。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
在这里，我们介绍一种糖肽捕获策略分析细胞表面蛋白。可以应用该方法来研究分泌蛋白，如血液中，以及在其他体液或细胞培养基中。
该方法的成功依赖于样本的完全消化;因此，消化效率的SDS-PAGE鉴定是必要的，尤其是对于样品的第一次分析。一个完整的消化可具有挑战性的膜蛋白，并可以仅在膜级分的彻底的溶解是可能的。当洗涤剂引入增溶过程开始和尿素的孵育后结束。因此，如果混浊提出了添加尿素之前在样品中但尿素温育后消失时，增溶是足够的。如果该膜部分难以溶解，增加洗涤剂用量。对于膜丰富的组织样本如脑和脂肪组织中，5％品RapiGest可以利用。有时，可以沉淀样品的稀释过程之前，胰蛋白酶消化，这是更频繁地观察到的人的血清样本出现。此沉淀的原因，主要是尿素和洗涤剂的浓度降低。此沉淀一般将通过胰蛋白酶消化过程中去除，并且不是一个问题。然而，当沉淀的形式，它在消化步骤中旋转样品小瓶，以保证良好的混合是重要的。该glycocapture步骤的pH值是很重要的，因为在肽类，例如那些从N-末端和赖氨酸的伯胺将在高碘酸盐氧化后与新形成的醛反应。因此，通过使用乙酸盐缓冲液调节所述捕获溶液的pH值至6.0以下，以质子化这些胺，以防止它们与捕获的干扰是很重要的。
用树脂的比例来捕获溶液中的轮1:3至1时04分，确保在捕获步骤充分混合。最少50微升树脂是必要根据我们的经验;更低的数量将呈现随后的一系列洗涤难以进行的，并会提出严格的样品损失，由于树脂的损失。我们已经使用100-300微升树脂为0.5-2毫克总蛋白得到良好的结果。然而，蛋白质和树脂的量之间的比率可以取决于样品，我们建议您优化这种情况下为您的特定样品和应用。
酰肼化学捕获在基板上两个O-和N-连接的糖肽;由于缺乏有效的酶释放所有的O-连接糖肽，我们只用PNG酶F表示的N-糖肽的研究8,12。研究O型糖肽的可能性可能需要适当的水解酶的发现或生物工程。
这种方法可以在有数个p暂停鞋带，包括：1）获得的细胞膜级分后，2）胰蛋白酶消化和清洁肽，3）的N-糖肽释放后经过。其他程序可以在这些间隔被引入。例如，将消化的肽可通过差分N-isotags标记为在图1中所示，进行定量分析。使用称为gagQP方法，其中所述未修饰的肽与糖肽平行分析，定量分析的准确度，可以显著如我们在最近的出版物18展示了改善。
糖肽捕获本身能有效地降低样品的复杂性，并且它通常是没有必要的，以进一步分馏富集的N-糖肽。例外适用于情况下样品丰富，但有大量的浓度动态，感兴趣的蛋白在低丰度，如在血液中的蛋白质生物标志物的发现或对细胞表面蛋白的完整调查。在这种情况下进一步分馏可以为拍摄的N-糖肽提供glycoproteome更好的渗透来实现。作为glycoproteome的底部正在通过分馏接触，通过非特异性结合引入非糖肽的鉴定将增加。从而减少糖和糖蛋白的选择性（以〜85％）通常会之后的N-糖肽17进一步分馏观察。因此，研究人员需要设计最适合的程序时，要权衡的利弊。
对于研究人员谁从来没有使用过的N-糖肽捕获方法，最好是有一些纯N-糖蛋白（次）练习方法有称为糖基化位点如前8列。该方法是鲁棒的选择性的N-糖肽是高的。这种方法的缺点在于河畔的固有的低丰度面对N-糖蛋白;对样品进行了全面描述，更大数量，通常需要比胞质蛋白质组学。然而，如果培养细胞可以在体外扩充或所关注的组织中是丰富的，该缺陷是微不足道的。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争的财务权益。
Acknowledgments
这项研究已经由西蒙·弗雷泽大学的启动资金支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DTT | Sigma | 646563 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Iodoacetamide | Sigma | A3221 | |
| Rapigest SF | Waters | 186001860 | |
| Sodium periodate | Sigma | 311448 | |
| PNGase F | New England Biolabs | P0704S | |
| Affi-Gel Hz hydrazide gel | Bio-Rad | 153-6047 | |
| Trypsin | Worthington Biomedical | LS02115 | |
| Sep-Pak C-18 cartridge | Waters | WAT054955 | |
| Oasis MCX cartridge | Waters | 186000252 | |
| Protease inhibitor coctail | Sigma | P8340 | |
| Urea | Amersco | 568 | |
| Sodium sulphite | Caledon | 8360-1 | |
| Invertase | Sigma | I0408 | |
| α-1 trypsin | Sigma | F2006 | |
| Ribonulease B | Sigma | R7884 | |
| Avidin | Sigma | A9275 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503 | |
| Conalbumin | Sigma | C0755 |
References
- Cho, W., Stahelin, R. V. Membrane-protein interactions in cell signaling and membrane trafficking. Annual review of biophysics and biomolecular structure. 34, 119-151 (2005).
- Tadevosyan, A., Vaniotis, G., Allen, B. G., Hebert, T. E., Nattel, S. G. protein-coupled receptor signalling in the cardiac nuclear membrane: evidence and possible roles in physiological and pathophysiological function. The Journal of physiology. 590, 1313-1330 (2012).
- White, S. H. Biophysical dissection of membrane proteins. Nature. 459, 344-346 (2009).
- Heijne, G. Membrane-protein topology. Nature reviews Molecular cell biology. 7, 909-918 (2006).
- Cox, J., Mann, M. Quantitative high-resolution proteomics for data-driven systems biology. Annual review of biochemistry. 80, 273-299 (2011).
- Lamond, A. I., et al. Advancing cell biology through proteomics in space and time (PROSPECTS). Mol Cell Proteomics. 11, (2012).
- Savas, J. N., Stein, B. D., Wu, C. C., Yates 3rd, J. R. Mass spectrometry accelerates membrane protein analysis. Trends in biochemical sciences. 36, 388-396 (2011).
- Sun, B., et al. Shotgun glycopeptide capture approach coupled with mass spectrometry for comprehensive glycoproteomics. Mol Cell Proteomics. 6, 141-149 (2007).
- Lowe, J. B. Glycosylation, immunity, and autoimmunity. Cell. 104, 809-812 (2001).
- Dodds, E. D. Gas-phase dissociation of glycosylated peptide ions. Mass spectrometry reviews. 31, 666-682 (2012).
- Kaji, H., et al. Lectin affinity capture, isotope-coded tagging and mass spectrometry to identify N-linked glycoproteins. Nat Biotechnol. 21, 667-672 (2003).
- Zhang, H., Li, X. J., Martin, D. B., Aebersold, R. Identification and quantification of N-linked glycoproteins using hydrazide chemistry, stable isotope labeling and mass spectrometry. Nat Biotechnol. 21, 660-666 (2003).
- Hagglund, P., Bunkenborg, J., Elortza, F., Jensen, O. N., Roepstorff, P. A new strategy for identification of N-glycosylated proteins and unambiguous assignment of their glycosylation sites using HILIC enrichment and partial deglycosylation. J Proteome Res. 3, 556-566 (2004).
- Bond, M. R., Kohler, J. J. Chemical methods for glycoprotein discovery. Current opinion in chemical biology. 11, 52-58 (2007).
- Pasini, E. M., et al. In-depth analysis of the membrane and cytosolic proteome of red blood cells. Blood. 108, 791-801 (2006).
- Wollscheid, B., et al. Mass-spectrometric identification and relative quantification of N-linked cell surface glycoproteins. Nat Biotechnol. 27, 378-386 (2009).
- Sun, B., et al. N-Glycoproteome of E14.Tg2a mouse embryonic stem cells. PLoS ONE. 8, (2013).
- Sun, B., et al. Glycocapture-assisted global quantitative proteomics (gagQP) reveals multiorgan responses in serum toxicoproteome. J Proteome Res. 12, 2034-2044 (2013).
