Summary
Celleoverflateproteiner er biologisk viktig og allment glykosylert. Vi introduserer her en glycopeptide-fangst tilnærming til å oppløse, berike, og deglycosylate disse proteinene for lettvinte LC-MS basert proteomikk analyser.
Abstract
Celleoverflateproteiner, inkludert ekstracellulære matrix proteiner, delta i alle de store cellulære prosesser og funksjoner, slik som vekst, differensiering og spredning. En omfattende karakterisering av disse proteinene gir fyldig informasjon for biomarkører, celle-type identifikasjon, og narkotika-target utvalg, samt bidra til å fremme vår forståelse av cellebiologi og fysiologi. Overflateproteiner er imidlertid utgjøre betydelige analytiske utfordringer på grunn av deres iboende lave mengde av høy hydrofobisitet, og tunge post-translasjonelle modifikasjoner. Å dra nytte av den rådende glykosylering på overflateproteiner, innfører vi her en høy gjennomstrømming glycopeptide-fangst tilnærming som integrerer fordelene av flere eksisterende N-glycoproteomics midler. Vår metode kan berike glykopeptider utvunnet av overflateproteiner og fjerne sine glykaner for lettvinte proteomikk ved hjelp av LC-MS. Den løst N-glycoproteome omfatter informasjon av protein identitet og kvantitet så vel som sine områder av glykosylering. Denne metoden har vært brukt til en rekke studier i områder, inkludert kreft, stamceller, og narkotika toksisitet. Begrensningen av fremgangsmåten ligger i den lave mengde av overflatemembranproteiner, slik at et relativt stort antall av prøver er nødvendig for denne analyse sammenlignet med studier sentrert på cytosoliske proteiner.
Introduction
Celleoverflateproteiner kommuniserer med det ekstracellulære miljø og videresende signaler fra utsiden til innsiden av en celle. Således er disse proteinene, inkludert ekstracellulære matriksproteiner, spiller avgjørende roller i alle aspekter av cellulær biologi og fysiologi som strekker seg fra proliferasjon, vekst, migrering, differensiering til aldring og så videre. Overflateproteiner fungere ved å samhandle med andre celler, proteiner og små molekyler 1-3. Molekylær karakterisering av celle-overflateproteiner er av stor interesse ikke bare for biologer, men også for farmasøytiske selskaper, som mer enn 60% av narkotika er målrettet mot celle-overflateproteiner fire.
Tandem massespektrometri (MS), med sin overlegne følsomhet, nøyaktighet og gjennomløp for identifisering av proteiner og peptider, har vært et kraftig verktøy for globale proteomic studier 5,6. Likevel, overflateproteiner utgjøre betydelige utfordringer til MS-baserte proteomikk, somde fleste overflateproteiner finnes i lave mengder og med tunge modifikasjoner. Membran-spenner regioner av overflaten proteiner gjør dem hydrofobe; Dette er særlig tilfelle for multipass transmembrane proteiner. Det er således vanskelig å løse opp membranproteiner i vandige oppløsninger uten hjelp av en detergent; men bruken av vaskemidler generelt undertrykker utførelsen av HPLC og MS 1,7,8 i protein identifikasjon. Derfor har membran proteiner er dårlig karakterisert i direkte LC-MS basert proteomikk.
Glykosylering er en av de viktigste og mest rikelig post-translasjonelle modifikasjoner som finner sted i celle-overflateproteiner 9. Den enorme kompleksitet og heterogenitet av glykaner hemme peptider 'MS signal 10. Likevel har flere proteomikk metoder brukt denne unike modifisering å berike overflateproteiner og å fjerne sukkerdelene fra proteiner før LC-MS analyse. Disse metodes omfatter lektin-basert affinitet capture 11 og hydrazid-baserte eller borsyre-basert kjemisk capture 12 så vel som hydrofile kromatografiske separasjoner 8,13. Fjerning av glykaner forvandles membran proteiner til vanlige proteiner og drastisk forenkler MS karakterisering. Fordi glykosylering forekommer også i utskilte proteiner som har høy oppløselighet i motsetning til membran proteiner, er mange glycoproteomic metoder optimalisert for løselige proteiner, og har en tendens til å ha lavere glykopeptid selektivitet og følsomhet når det blir utplassert til membran proteiner 8,14. Andre metoder finnes også for å berike, særlig celle-overflateproteiner, slik som de ved hjelp av ultrasentrifugering 15 og merking strategier 16. En detaljert sammenligning mellom vår fremgangsmåte og andre eksisterende metoder for å karakterisere membranproteiner ble utført nylig 17, og resultatene indikerte at vår metode kan utføre like godt, om ikkebedre enn alle de sammenlignede membran proteomikk metoder, men med større enkelhet.
For å hjelpe forskere bruker denne metoden, vi detalj her en generell protokoll. Denne fremgangsmåten integrerer flere fordeler på eksisterende glycoproteomics strategier, og er utviklet spesielt for membran-glykoproteiner, men metoden fungerer like godt for utskilte proteiner. Det som kjennetegner denne fremgangsmåten innbefatter: 1) en fullstendig oppløsning av membranproteiner, 2) en berikelse av glykopeptider istedenfor glykoproteiner for å eliminere den potensielle steriske hindring ved bruk av en faststoff fange substrat, 3) ved bruk av kjemi-hydrazid for å danne kovalente bindinger mellom glykopeptider og fange substrat, slik at de bundne glykopeptider tåler høye vaskinger for høy glycoselectivity, og 4) evnen til å utføre hele fangst prosedyren i ett rør for redusert prøvetap og forkortet prosedyre varighet. Etter gjennomføring av denne metoden for å studere en variety av biologiske prøver, inkludert celler og vev, ble det observert en høy selektivitet (> 90%) for å glykoproteiner 8,17,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Slakte Membraner
- Legg hypotonisk buffer (10 mM Tris-HCl, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, pH 8,0) med protease inhibitor cocktail på en cellepellet (~ 10 8 celler) og inkuberes i 15-30 minutter på is. Lyse av celler ved å føre prøven gjennom sprøytenåler (5-10 Pass) eller homogenisere prøven ved en Douce-homogenisator (15-30 slag). Bruk et hemocytometer og trypan blå farging for å undersøke effektiviteten av lysis.
- Tak i den mikrosomale fraksjon av en differensialsentrifugering av lysatet ved 3000 gx 15 min og så ved 100.000 gx 2 hr. Den første sentrifugering får en pellet som er atomfraksjonen, og den etterfølgende sentrifugering av supernatanten genererer en andre pellet, som er den mikrosomale fraksjonen som inneholder plasmamembranen og membranbundne organeller 8. Den endelige supernatant er den cytosoliske fraksjon. Oppbevar mikrosomale fraksjoner i -80 ° C fryser for ytterligere analyser som angitt nedenfor.
2. Toning, Denature, og Digest membran proteiner
- Oppløs-mikrosomal fraksjon i denaturering buffer (40 mM Tris, 10 mM EDTA, 10 mM TCEP, 0,5% Rapigest, pH 8) og deretter inkubere oppløsningen ved 100 ° C i 10 min.
- Avkjøl løsningen oppvarmet til romtemperatur, tilsett ultrahøy renhet ureapulver inn i løsningen til 8 M sluttkonsentrasjon og inkuber prøven ved 37 ° C i 30 min.
- Legg jodacetamid stamoppløsning til prøven til 15 mM sluttkonsentrasjon og inkuber oppløsningen i mørke i 30 min ved romtemperatur for å alkylere den frie tioler i prøven. Legg DTT stamoppløsning til prøven til 10 mM sluttkonsentrasjon og inkuber løsningen i ytterligere 10 min ved romtemperatur for å dempe overdreven jodacetamid.
- Fortynn den oppnådde løsningen 10 ganger med 40 mM Tris-buffer ved pH 8, og deretter legge trypsin i prøven ved et 01:20-forhold av trypsin til total protein. Oppretthold fordøyelsen reaksjonen i en 37 ° C ovn over natten for å sikre at reaksjonen fullføres.
- Avslutt fordøyelsen ved surgjøring av prøveløsningen til pH 1 med HCl, en tilstand som også bryter ned vaskemiddel, dvs. Rapigest. Degradere Rapigest ved 37 ° C i 1 time, og fjern utviklet nedbør ved sentrifugering.
- Rens supernatanten som inneholder eksempel peptider med et C-18 fastfase-ekstraksjon (SPE) patronen og tørke den oppnådde prøven ved speedvac.
- Utfør en SDS-PAGE-analyse av prøver før og etter trypsin fordøyelse for å bekrefte fordøyelse effektivitet.
Tre. Glycopeptide Capture
- Oppløs de rensede peptider i koblingsbuffer (100 mM natriumacetat, pH 5,5). Legg natriumperjodat i peptidet oppløsning ved en 10 mM sluttkonsentrasjon i 30 minutter i mørke ved romtemperatur. Dette vil oksidere cis-diol-gruppene i de glykaner til aldehyder, Noe som tillater glykaner i par til harpiksen gjennom hydrazid kjemi. Slukke overdreven perjodat ved natriumsulfitt med 20 mM sluttkonsentrasjon og pH 5 i 10 minutter ved romtemperatur.
- Innfør-hydrazid derivatisert harpiks inn i peptid-løsning i forholdet 1:04 (harpiks-oppløsning) for å kople glykopeptider til harpiksen. Inkuber reaksjonen ved 37 ° C i 1-2 dager med ende-til-ende-rotasjon for fullstendig kobling.
- Fjern ubundne peptider ved vasking av harpiksen to ganger med 1 ml av hver av de følgende: DI-vann, 1,5 M NaCl, metanol og 80% acetonitril. Til slutt vaskes harpiksen med 3 x 1 ml 100 mM NH 4 HCO 3 ved pH 8 for å utveksle bufferen av systemet til 100 mM NH 4 HCO 3.
- Samle supernatanten og vasker for analyse av ubundne peptider (valgfritt).
- Løs opp N-glykopeptider fra harpiksen med PNGase F i en inkubering over natten ved 37 ° C med enn ende-til-ende-rotasjon. Samle de frigitte peptider ved sentrifugering og en 80% acetonitril vask. Tørk den oppnådde oppløsningen i speedvac for LC-MS-analyse.
4. Videre Fraksjone (valgfritt)
For ytterligere å forenkle prøven kompleksitet, fraksjonerer de oppnådde N-glykopeptider. For eksempel gjenoppløse de tørkede peptider i 10 mM ammoniakk formiat, pH 3 med 20% acetonitril, og bruk av sterk kationbytter (SCX) kromatografi for å fraksjonere de peptider. Tørk det erholdt elueringsmiddel, og deretter analysere de oppnådde peptid-fraksjoner ved revers-fase LC-MS 8,17,18.
5. Rengjøring av de frigitte N-glykopeptider (valgfritt)
Hvis bekymringer stige for den potensielle forurensning av peptidene, gjenoppløse de tørkede peptider i 0,1% maursyre og bruke en MCX SPE kolonne for å rense peptidene videre før revers-fase LC-MS-analyse.
I løpet av den selektive spaltning av N-glykopeptider utenfor harpiksen, omdanner PNGase F N-glykan koblet asparagin til en asparaginsyre. Derfor er det en 0,9840 Da masseforskyvning av de frigjorte N-glykopeptider. Å nøyaktig identifisere disse peptidene, må denne endringen for å bli lagt til søkeparametre sammen med vanlige modifikasjoner som carbamidomethylation av cystein og oksidasjon av metionin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et representativt flytskjema over den eksperimentelle fremgangsmåten er sammenfattet i figur 1.. Merkingen og ytterligere fraksjone trinn er valgfritt, og detaljer er beskrevet i en nylig publikasjon 18.. Et annet alternativ er å analysere de umodifiserte peptider, som ikke reagerer med harpiksen. Fordelene med å analysere de umodifiserte peptider omfatter den potensielle identifisering av ikke-glykosylerte peptider og proteiner, slik som Claudins i trange veikryss; en ekstra fordel er mer nøyaktig kvantifisering. Basert på disse fordelene, vi kalt denne metoden g lycocapture-en ssisted-g Lobal q uantitative p roteomics (gagQP), og detaljert analyse i en nyere publikasjoner 18.
En typisk glykopeptid spektrum tatt etter anrikning metoden er vist i figur 2.. På den oppnådde glykopeptid, N-glykan ble fjernet, og glykan-festet asparagin (N) wsom omdannes til en asparaginsyre (D) ved PNGase F; derfor kan spekteret lett søkte ved hjelp av noen proteomikk søkemotor mot vanlig proteinsekvensdatabaser.
Erobringen metoden kan bli evaluert av kommersielt tilgjengelige modell glykoproteiner før sin søknad med komplekse og verdifulle biologiske prøver. Noen hyppig brukt modell glykoproteiner inkluderer avidin (kylling), ovalbumin (kylling), invertase (gjær), α-1 antitrypsin (human), conalbumin (kylling), og ribonuklease B (storfe) (alt kan fås fra Sigma). De ofte identifisert glykopeptider fra disse proteinene kan bli funnet i en tidligere publikasjon åtte. En tilpasset protein-sekvens FASTA database som er egnet for automatisk søking av LC-MS resultater generert fra disse modell proteiner kan lastes ned fra følgende link (http://www.sfu.ca/chemistry/groups/bingyun_sun/tools.html ), som omfatter de ovennevnte børsnoterte modell proteiner samt en rev ersed gjær-sekvens database, vanlige forurensninger og PNGase F.
En typisk LC-MS resultat av den fangede N-glykopeptider er vist i figur 3, i hvilken mer enn 100 glykoproteiner kan identifiseres fra en enkelt LC-MS kjøring av en celle mikrosomale fraksjon. Denne anrikning selektivitet til begge glykoproteiner og glykopeptider er generelt mer enn 90%. En vellykket analyse kan ha en berikelse selektivitet på 95%. Ved hjelp av en SCX kolonne og trinn gradient til videre fraksjonerer prøvene før LC-MS analyser vil vanligvis doble antall glykoprotein identifikasjoner 17. Noen ganger, når mengden av de oppnådde glykopeptider er lav, den akkumulerte urenheter fra ampullene kan observeres i den endelige prøven. Disse forurensninger kan fjernes ved fremgangsmåten gitt i trinn 5.
. Jpg "src =" / files/ftp_upload/51349/51349fig1.jpg "width =" 350 "/>
Figur 1. Flytskjema over den eksperimentelle prosedyre rektangler er nødvendige. Trinnene og diamanter er valgfrie trinn.
Figur 2. Collision indusert dissosiasjon (CID) spektrum av AEPIL N ISNAGPWSR fra Bakegjær etter at glykopeptid-fangstmetode. Den understrekede asparagin (N) blir omdannet til asparaginsyre (D) som fremhevet i rødt i peptidsekvensen i figuren .
Fig. 3. 2D plott av LC-MS resultat av N-glycopeptides oppnådd fra mus embryonale stamceller (E14.Tg2a). Prikkene er de detekterte peptider, og fargen på den prikk representerer identifikasjonen tillit erholdt statistisk (dvs. peptid sannsynlighet).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her introduserer vi en glycopeptide-fangst strategi for profilering celle-overflateproteiner. Fremgangsmåten kan brukes til å studere utskilte proteiner, slik som de i blodet samt i andre kroppsvæsker eller i cellekulturmediet.
Suksessen til den metoden er avhengig av den komplette fordøyelsen av prøver; Derfor, er en SDS-PAGE karakterisering av fordøyelseseffektivitet nødvendig, spesielt for det første tids analyse av en prøve. En komplett fordøyelse kan være utfordrende for membranproteiner, og kan bare være mulig etter grundig solubilisering av membranen fraksjon. Den oppløseliggjøring Prosessen starter når vaskemiddelet innføres, og ender etter inkubering av urea. Derfor, hvis uklarhet presenterer i prøven før tilsetning av urea, men forsvinner etter urea inkubering er oppløseliggjøring tilstrekkelig. Hvis membranfraksjonen er vanskelig å oppløse, øke mengden av vaskemiddel som brukes. For membran-rik vevsprøverslik som hjerne og fettvev, kan 5% Rapigest utnyttes. Noen ganger kan ventet ut i løpet av fortynningen av prøvene før trypsin fordøyelse, som er mer hyppig observert for humane serumprøver. Årsaken til denne nedbør er hovedsakelig redusert konsentrasjoner av urea og vaskemiddel. Dette nedbør vil vanligvis bli fjernet av trypsin under fordøyelsen og er ikke en bekymring. Imidlertid, når nedbøren former, er det viktig å rotere prøvehetteglass under fordøyelsen trinn for å sikre en god blanding. PH på glycocapture trinn er viktig fordi de primære aminer i peptider, slik som de fra N-termini og lysines, vil reagere med den nylig dannede aldehyder etter periodat oksydasjon. Således er det viktig å protonate disse aminer ved å justere pH-verdien i løsningen for å fange under 6,0 ved bruk av acetat-buffer, for å hindre dem fra å blande seg med fangst.
Ved å bruke et forhold mellom harpiks for å fange opp løsning enrunde 1:03-01:04 sikrer tilstrekkelig blanding under fangst trinnet. Et minimum av 50 mL av harpiks er nødvendig basert på vår erfaring; lavere mengder vil gjøre den etterfølgende serie av vaskinger vanskelig å utføre og vil innføre alvorlig prøven tap på grunn av tap av harpiks. Vi har oppnådd gode resultater ved å bruke 100 til 300 pl av harpiks på 0,5 til 2 mg totalt protein. Men, kan forholdet mellom mengden protein og harpiks være prøve avhengige, vi anbefaler at du optimaliserer denne tilstanden for dine spesifikke prøver og applikasjoner.
Den hydrazid kjemi fanger begge O-og N-bundne glykopeptider på substratet; på grunn av mangelen på en effektiv enzym for å frigjøre all O-koblede glykopeptider, vi bare brukt PNGase F er N-kappeglykopeptid studier 8,12. Muligheten for å studere O-typen av glykopeptider kan kreve oppdagelsen eller bioengineering av passende hydrolaser.
Denne metoden kan bli stanset på flere plisser, inkludert: 1) etter å ha fått membranfraksjonen, 2) etter at fordøyelsen trypsin og rensing av peptidene, og 3) etter frigjøring av de N-glykopeptider. Andre fremgangsmåter kan bli introdusert i løpet av disse intervallene. For eksempel kan de fordøyde peptider bli differensielt merket med N-isotags som vist i figur 1, for kvantitativ analyse. Ved hjelp av en metode som kalles gagQP, hvori de umodifiserte peptider blir analysert i parallell med glykopeptider, kan nøyaktigheten av kvantifisering bli vesentlig forbedret som vi demonstrert i en nylig publikasjon 18..
Glykopeptid fangst i seg selv kan effektivt redusere prøve kompleksitet, og det er vanligvis ikke nødvendig å ytterligere fraksjonere det anrikede N-glykopeptider. Unntak gjelder for situasjoner der prøvene er rikelig, men med betydelige konsentrasjons dynamikk, og proteiner av interesse er i lav overflod, for eksempel i oppdagelsen av blod protein biomarkører ellerfor en komplett undersøkelse av celleoverflateproteiner. Under disse omstendighetene ytterligere fraksjonering kan gjennomføres for den fangede N-glykopeptider å gi en bedre gjennomtrengning av glycoproteome. Ettersom bunnen av glycoproteome blir kontaktet gjennom fraksjonering, blir identifiseringen av ikke-glykopeptider introdusert av ikke-spesifikk binding øke. Således en reduksjon av glykopeptid og glykoprotein selektivitet (til ~ 85%) vil typisk bli observert etter en ytterligere fraksjonering av N-glykopeptider 17. Derfor forskerne trenger for å veie fordeler og ulemper ved utformingen den mest egnede prosedyren.
For forskere som aldri har brukt en N-glycopeptide-fangst metoden, er det best å øve på metoden med noen ren N-glykoprotein (e) å ha kjent glykosyleringssteder som er oppført tidligere åtte. Denne fremgangsmåte er robust og selektivitet til N-glykopeptider er høy. En ulempe ved denne fremgangsmåte ligger i den iboende lave overflod av suransikt N-glykoproteiner; for en omfattende karakterisering av prøven, blir en større mengde vanligvis nødvendig enn for cytosoliske proteomforskning. Imidlertid, hvis dyrkede celler kan utvides in vitro eller vev av interesse er rikelig, er denne ulempen ubetydelig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Denne forskningen har vært støttet av oppstartsfond av Simon Fraser University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DTT | Sigma | 646563 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Iodoacetamide | Sigma | A3221 | |
| Rapigest SF | Waters | 186001860 | |
| Sodium periodate | Sigma | 311448 | |
| PNGase F | New England Biolabs | P0704S | |
| Affi-Gel Hz hydrazide gel | Bio-Rad | 153-6047 | |
| Trypsin | Worthington Biomedical | LS02115 | |
| Sep-Pak C-18 cartridge | Waters | WAT054955 | |
| Oasis MCX cartridge | Waters | 186000252 | |
| Protease inhibitor coctail | Sigma | P8340 | |
| Urea | Amersco | 568 | |
| Sodium sulphite | Caledon | 8360-1 | |
| Invertase | Sigma | I0408 | |
| α-1 trypsin | Sigma | F2006 | |
| Ribonulease B | Sigma | R7884 | |
| Avidin | Sigma | A9275 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503 | |
| Conalbumin | Sigma | C0755 |
References
- Cho, W., Stahelin, R. V. Membrane-protein interactions in cell signaling and membrane trafficking. Annual review of biophysics and biomolecular structure. 34, 119-151 (2005).
- Tadevosyan, A., Vaniotis, G., Allen, B. G., Hebert, T. E., Nattel, S. G. protein-coupled receptor signalling in the cardiac nuclear membrane: evidence and possible roles in physiological and pathophysiological function. The Journal of physiology. 590, 1313-1330 (2012).
- White, S. H. Biophysical dissection of membrane proteins. Nature. 459, 344-346 (2009).
- Heijne, G. Membrane-protein topology. Nature reviews Molecular cell biology. 7, 909-918 (2006).
- Cox, J., Mann, M. Quantitative high-resolution proteomics for data-driven systems biology. Annual review of biochemistry. 80, 273-299 (2011).
- Lamond, A. I., et al. Advancing cell biology through proteomics in space and time (PROSPECTS). Mol Cell Proteomics. 11, (2012).
- Savas, J. N., Stein, B. D., Wu, C. C., Yates 3rd, J. R. Mass spectrometry accelerates membrane protein analysis. Trends in biochemical sciences. 36, 388-396 (2011).
- Sun, B., et al. Shotgun glycopeptide capture approach coupled with mass spectrometry for comprehensive glycoproteomics. Mol Cell Proteomics. 6, 141-149 (2007).
- Lowe, J. B. Glycosylation, immunity, and autoimmunity. Cell. 104, 809-812 (2001).
- Dodds, E. D. Gas-phase dissociation of glycosylated peptide ions. Mass spectrometry reviews. 31, 666-682 (2012).
- Kaji, H., et al. Lectin affinity capture, isotope-coded tagging and mass spectrometry to identify N-linked glycoproteins. Nat Biotechnol. 21, 667-672 (2003).
- Zhang, H., Li, X. J., Martin, D. B., Aebersold, R. Identification and quantification of N-linked glycoproteins using hydrazide chemistry, stable isotope labeling and mass spectrometry. Nat Biotechnol. 21, 660-666 (2003).
- Hagglund, P., Bunkenborg, J., Elortza, F., Jensen, O. N., Roepstorff, P. A new strategy for identification of N-glycosylated proteins and unambiguous assignment of their glycosylation sites using HILIC enrichment and partial deglycosylation. J Proteome Res. 3, 556-566 (2004).
- Bond, M. R., Kohler, J. J. Chemical methods for glycoprotein discovery. Current opinion in chemical biology. 11, 52-58 (2007).
- Pasini, E. M., et al. In-depth analysis of the membrane and cytosolic proteome of red blood cells. Blood. 108, 791-801 (2006).
- Wollscheid, B., et al. Mass-spectrometric identification and relative quantification of N-linked cell surface glycoproteins. Nat Biotechnol. 27, 378-386 (2009).
- Sun, B., et al. N-Glycoproteome of E14.Tg2a mouse embryonic stem cells. PLoS ONE. 8, (2013).
- Sun, B., et al. Glycocapture-assisted global quantitative proteomics (gagQP) reveals multiorgan responses in serum toxicoproteome. J Proteome Res. 12, 2034-2044 (2013).
