Summary
As proteínas de superfície são biologicamente importantes e amplamente glicosilada. Apresentamos aqui uma abordagem de captura de glycopeptide para solubilizar, enriquecer e deglycosylate estas proteínas para análise proteômica baseada LC-MS fáceis.
Abstract
Proteínas de superfície celular, incluindo as proteínas da matriz extracelular, participam em todos os principais processos e funções celulares, tais como o crescimento, a diferenciação e proliferação. A caracterização detalhada destas proteínas fornece informações ricas para a descoberta de biomarcadores, a identificação do tipo de célula, e seleção-alvo da droga, bem como ajudando a avançar a nossa compreensão da biologia celular e fisiologia. Proteínas de superfície, no entanto, colocam desafios analíticos significativos, devido à sua inerente baixa abundância, alta hidrofobicidade, e pesadas modificações pós-traducionais. Aproveitando a glicosilação em proteínas de superfície predominante, apresentamos aqui uma abordagem de captura de glicopéptido de alto rendimento, que integra as vantagens de vários meios N-glycoproteomics existentes. Nosso método pode enriquecer os glicopeptídeos derivados de proteínas de superfície e remover seus glicanos para proteômica fáceis utilizando LC-MS. A N-glycoproteome resolvido compreende a informação de identidade e quantidade de proteína, bem como os seus locais de glicosilação. Este método foi aplicado a uma série de estudos em diversas áreas, incluindo o cancro, as células estaminais, e a toxicidade da droga. A limitação do método reside na fraca abundância de proteínas de membrana de superfície, de tal modo que uma quantidade relativamente grande de amostras é necessária para esta análise em comparação com estudos centrados em proteínas citosólicas.
Introduction
Proteínas da superfície da célula interagir com o ambiente extracelular e transmitir sinais a partir do exterior para o interior de uma célula. Assim, estas proteínas, incluindo proteínas de matriz extracelular, desempenham papéis críticos em todos os aspectos da biologia celular e fisiologia variando de proliferação, o crescimento, a migração, a diferenciação de envelhecimento e assim por diante. Proteínas de superfície de funcionar interagindo com outras células, proteínas e pequenas moléculas 1-3. Caracterização molecular de proteínas da superfície celular, é de grande interesse, não só para os biólogos, mas também para as empresas farmacêuticas, mais do que 60% da droga são dirigidos a proteínas da superfície da célula 4.
Espectrometria de massa em tandem (MS), com a sua sensibilidade superior, precisão e rendimento para a identificação de proteínas e peptídeos, tem sido uma ferramenta poderosa para estudos de proteômica globais 5,6. No entanto, as proteínas de superfície representam desafios significativos para proteômica baseada em MS, comoa maioria das proteínas de superfície existe em baixas quantidades, e com modificações pesados. As regiões que atravessam a membrana das proteínas de superfície de torná-los hidrófobos; este é especialmente o caso de proteínas transmembrana multipass. É, portanto, difícil de dissolver as proteínas de membrana em soluções aquosas, sem a ajuda de um detergente; no entanto, o uso de detergentes geralmente suprime o desempenho de HPLC e MS 1,7,8 na identificação de proteínas. Portanto, as proteínas da membrana foram mal caracterizado em proteômica baseada LC-MS diretos.
A glicosilação é uma das modificações pós-tradução mais importantes e abundantes que ocorrem em proteínas da superfície das células 9. A enorme complexidade e heterogeneidade dos glicanos dificultar sinal de 10 MS 'peptídeos. No entanto, vários métodos proteomic usaram esta modificação única para enriquecer as proteínas de superfície e para remover as porções de açúcar a partir de proteínas antes da análise por LC-MS. Estes métodos incluem baseada em lectina de captura por afinidade e 11 à base de ácido de captura 12 ou químico bórico à base de hidrazida, bem como separações cromatográficas hidrofílicos 8,13. A remoção dos glicanos transforma as proteínas da membrana de proteínas e regulares drasticamente simplifica a caracterização MS. Porque glicosilação também ocorre em proteínas secretadas que têm alta solubilidade em contraste com a membrana proteínas, muitos métodos glycoproteomic são otimizados para proteínas solúveis, e tendem a ter menor seletividade glycopeptide e sensibilidade ao ser implantado para a membrana proteínas 8,14. Outros métodos também existe para o enriquecimento, em particular, as proteínas da superfície celular, tais como aqueles utilizando ultracentrifugação 15 e estratégias de rotulagem 16. Uma comparação detalhada entre o nosso método e outros métodos existentes para a caracterização de proteínas de membrana foi realizada recentemente 17, e os resultados indicaram que o método pode executar igualmente bem, se nãomelhor, do que todos os métodos de comparação proteómica membrana, mas com maior simplicidade.
Para ajudar os pesquisadores a utilizar este método, detalhamos aqui um protocolo geral. Este método integra várias vantagens de estratégias glycoproteomics existentes e é concebido especificamente para glicoproteínas de membrana, no entanto, o método funciona igualmente bem para as proteínas secretadas. As características deste método incluem: 1) uma solubilização completa de proteínas de membrana, 2) um enriquecimento de glicopéptidos em vez de glicoproteínas para eliminar o potencial impedimento espacial quando se utiliza um substrato de captura de sólidos, 3) a utilização da química de hidrazida para formar ligações covalentes entre glicopéptidos e o substrato de captura, de modo a que os glicopéptidos ligados tolera lavagens rigorosas para alta glycoselectivity, e 4) a capacidade de realizar o processo de captura de todo em um tubo para a perda de amostra reduzida ea duração do procedimento encurtado. Depois de implementar este método para estudar uma variáveledade de amostras biológicas, incluindo células e tecidos, observou-se uma selectividade elevada (> 90%) às glicoproteínas 8,17,18.
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Protocol
1. Colheita Membranas
- Adicionar tampão hipotónico (10 mM Tris-HCl, 10 mM de KCl, 1,5 mM MgCl 2, pH 8,0) com o cocktail inibidor de protease para um agregado de células (~ 10 8 células) e incuba-se durante 15-30 minutos em gelo. Lyse as células por fazer passar a amostra através de agulhas de seringas (5-10 passagens) ou homogeneizar a amostra por um homogeneizador Dounce (15-30 AVC). Use um hemocitômetro e coloração azul de tripan para verificar a eficiência da lise.
- Obter a fracção microssomal por uma centrifugação diferencial do ligado em 3000 gx 15 min e em seguida a 100.000 gx 2 hr. A primeira centrifugação obtém uma pelete que é a fracção nuclear, e a subsequente centrifugação do sobrenadante gera um segundo sedimento, que é a fracção microssomal que contém a membrana plasmática, bem como organelos ligados à membrana 8. O sobrenadante final é a fracção citosólica. Guarde as frações microssomais em freezer -80 ° C para mais analysé como se indica a seguir.
2. Dissolve, desnaturação e Digest Proteínas da Membrana
- Dissolve-se a fracção microssomal no tampão de desnaturação (Tris 40 mM, EDTA 10 mM, 10 mM de TCEP, 0,5% Rapigest, pH 8) e depois incubar a solução a 100 ° C durante 10 min.
- Arrefece-se a solução aquecida até à temperatura ambiente, adicionar ultra-alta pureza ureia em pó a uma solução de 8 M de concentração final e incubar a amostra a 37 ° C durante 30 min.
- Adicionar solução de estoque de iodoacetamida à amostra de 15 mM de concentração final, e incubar a solução no escuro durante 30 min à temperatura ambiente para alquilar os tióis livres na amostra. Adicionar solução de estoque de DTT para a amostra a uma concentração final de 10 mM e incuba-se a solução durante mais 10 min à temperatura ambiente para extinguir o excesso de iodoacetamida.
- Dilui-se a solução obtida com 10x tampão de Tris 40 mM a pH 8, e, subsequentemente, adicionar tripsina à amostra a uma razão de 01:20 trypsin para a proteína total. Manter a reacção de digestão durante a noite num forno de 37 ° C para assegurar o fim da reacção.
- Terminar a digestão por acidificação da solução de amostra para pH 1 com HCl, uma condição que também divide o detergente, ou seja Rapigest. Degradar o Rapigest a 37 ° C durante 1 hora, e remover a precipitação desenvolvido por centrifugação.
- Limpar o sobrenadante que contém péptidos de amostra por um cartucho C-18 de extracção em fase sólida (SPE) e secar a amostra obtida por speedvac.
- Realizar uma análise de SDS-PAGE de amostras antes e depois de digestão com tripsina para confirmar a eficiência da digestão.
3. Captura glicopéptido
- Dissolve-se os péptidos limpas no tampão (acetato de sódio 100 mM, pH 5,5) de acoplamento. Adicionar periodato de sódio na solução de péptido com uma concentração final de 10 mM durante 30 min no escuro, à temperatura ambiente. Isto irá oxidar os grupos cis-diol em glicanos de aldeídos, Que permitem que os glicanos a par com a resina através de química hidrazida. Extingue-se o excesso de periodato de sulfito de sódio a uma concentração final de 20 mM e pH 5 durante 10 minutos à temperatura ambiente.
- Introduzir resina derivatizada com hidrazida para a solução de péptido com uma razão de 1:4 (resina de solução) para acoplar glicopéptidos à resina. Incubar a reacção a 37 ° C durante 1-2 dias com a rotação de ponta a ponta para o acoplamento completo.
- Remover os péptidos não ligados por lavagem da resina duas vezes com 1 ml de cada um dos seguintes: água DI, 1,5 M de NaCl, 80% de metanol e acetonitrilo. Finalmente, lava-se a resina 3x com 1 ml de NH 4 HCO 3 a 100 mM, pH 8 para trocar o tampão do sistema de NH 4 HCO 3 a 100 mM.
- Recolhe-se o sobrenadante e as lavagens para a análise de péptidos não ligados (opcional).
- Soltar os N-glicopéptidos a partir da resina por PNGase F numa incubação durante a noite a 37 ° C com umn fim-de-final da rotação. Recolha os peptídeos liberados por centrifugação e lavagem acetonitrila 80%. Seca-se a solução obtida no Speedvac para análise por LC-MS.
4. Fraccionamento adicional (opcional)
Para simplificar ainda mais a complexidade da amostra, fracionar as N-glicopeptídeos obtidos. Por exemplo, dissolver-se os péptidos secos em 10 mM de formato de amónia, pH = 3 com 20% de acetonitrilo e utilizar de permuta catiónica forte (SCX) de cromatografia para fraccionar os péptidos. Seca-se o eluente obtido, e, em seguida, analisar as fracções de péptido obtidas por inversão de fases LC-MS 8,17,18.
5. Limpeza de N-glicopeptídeos Lançado (Opcional)
Se levantar preocupações para o potencial de contaminação dos péptidos, redissolver os péptidos secos em ácido fórmico a 0,1% e usar uma coluna SPE MCX para limpar ainda mais os péptidos antes de fase reversa A análise por LC-MS.
Durante a clivagem selectiva de N-glicopéptidos fora da resina, PNGase F converte a asparagina ligada de N-glicanos de um ácido aspártico. Portanto, existe um deslocamento de massa de 0,9840 Da dos libertadas N-glicopéptidos. Para identificar com precisão estes péptidos, esta modificação pode ser adicionada para os parâmetros de pesquisa juntamente com modificações comuns, tais como o carbamidomethylation de cisteína e à oxidação do que a metionina.
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Representative Results
Uma carta do procedimento experimental fluxo representativo é resumido na Figura 1. A rotulagem e as novas medidas de fracionamento são opcionais e os detalhes estão descritos em uma publicação recente 18. Uma outra opção é para analisar os péptidos não modificados, que não reagem com a resina. As vantagens da análise dos péptidos não modificados incluem a identificação potencial de peptídeos e proteínas não glicosiladas, tais como claudinas nas junções apertadas; uma vantagem adicional é a quantificação mais precisa. Com base nessas vantagens, denominado este método g ssisted-g lobal q roteomics p quantitativas (gagQP) a lycocapture-, e detalhou a análise em uma recente publicação 18.
Um espectro de glicopéptido típico feita após o método de enriquecimento é mostrado na Figura 2. No glicopeptídeo obtido, o N-glicano foi removido e a asparagina-glicano ligado (N) wcomo convertido para um ácido aspártico (D) por PNGase F; portanto, o espectro pode ser facilmente pesquisado usando qualquer motor de busca em bancos de dados de proteômica seqüência de proteína comum.
O método de captura pode ser avaliada por glicoproteínas modelo comercialmente disponíveis, antes da sua aplicação com amostras biológicas complexas e valiosos. Algumas glicoproteínas modelo frequentemente utilizados incluem avidina (galinha), ovalbumina (galinha), a invertase (levedura), α-1 antitripsina (humano), conalbumina (galinha), e ribonuclease B (bovina) (tudo pode ser obtido a partir de Sigma). Os glicopeptídeos freqüentemente identificados dessas proteínas podem ser encontrados em uma publicação anterior 8. Um banco de dados de seqüência FASTA proteína personalizado que é adequado para a busca automática de resultados de LC-MS gerados a partir dessas proteínas modelo pode ser baixado a partir do seguinte link (http://www.sfu.ca/chemistry/groups/bingyun_sun/tools.html ), que inclui as proteínas modelo acima listados, bem como uma rev banco de dados de seqüência de fermento ersed, contaminantes comuns e PNGase F.
Um resultado típico de LC-MS de N-glicopéptidos capturados é mostrado na Figura 3, em que mais do que 100 glicoproteínas podem ser identificados a partir de uma única LC-MS de execução de uma fracção microssómica de células. A selectividade de enriquecimento para ambas as glicoproteínas e glicopéptidos é geralmente superior a 90%. Uma análise bem sucedida pode ter uma selectividade de enriquecimento de 95%. Usando uma coluna de SCX e gradiente em degrau para fraccionar ainda as amostras antes da análise LC-MS geralmente o dobro do número de identificação da glicoproteína 17. Algumas vezes, quando a quantidade de glicopéptidos obtidos é baixo, a impureza acumulada dos frascos pode ser observado que a amostra final. Estes contaminantes podem ser removidos pelo método fornecido no passo 5.
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Passos e diamantes Figura 1. Gráfico do procedimento experimental de fluxo. Retângulos são necessários alguns passos opcionais.
Figura 2. Colisão dissociação induzida (CID) espectro de AEPIL N ISNAGPWSR a partir de levedura de padeiro após o método de captura de glicopéptido. A asparagina sublinhada (N) é convertido para o ácido aspártico (D), tal como destacado em vermelho na sequência do péptido na figura .
Figura 3. Trama 2D do resultado LC-MS de N-glycopeptides obtidos a partir de células estaminais embrionárias de ratinho (E14.Tg2a). Os pontos são detectados os péptidos, e a cor do ponto representa a confiança de identificação obtido estatisticamente (isto é, a probabilidade de péptido).
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Discussion
Aqui apresentamos uma estratégia de captura de glycopeptide para perfilar as proteínas da superfície celular. O método pode ser aplicado para estudar as proteínas segregadas, tal como aqueles em sangue, assim como em outros fluidos corporais, ou em meios de cultura de células.
O sucesso do método que se baseia na digestão completa de amostras; por conseguinte, uma caracterização de SDS-PAGE da eficiência da digestão é necessário, especialmente para a análise pela primeira vez de uma amostra. A digestão completa pode ser um desafio para as proteínas da membrana, e só pode ser possível, após a solubilização completa da fracção da membrana. O processo de solubilização começa quando o detergente é introduzido e termina após a incubação de ureia. Portanto, se apresenta nebulosidade na amostra antes da adição de ureia, mas desaparece após ureia incubação, a solubilização é suficiente. Se a fracção de membrana é difícil de dissolver, aumentar a quantidade de detergente utilizada. Para as amostras de tecido ricos em membranatais como tecidos de cérebro e tecido adiposo, 5% Rapigest pode ser utilizado. Às vezes, a precipitação pode aparecer durante a diluição de amostras antes da digestão com tripsina, que é mais freqüentemente observada em amostras de soro humano. A causa desta precipitação é principalmente as concentrações diminuídas de uréia e detergente. Esta precipitação irá geralmente ser removido por tripsina durante a digestão e não é uma preocupação. No entanto, quando as formas de precipitação, é importante rodar o frasco da amostra, durante a etapa de digestão para assegurar uma boa mistura. O pH da etapa glycocapture é importante, porque as aminas primárias em péptidos, tais como aqueles a partir de terminais N e lisinas, irá reagir com os aldeídos recém-formados após a oxidação com periodato. Assim, é importante para protonar estas aminas, ajustando o pH da solução de captura para abaixo de 6,0, utilizando tampão de acetato, para evitar que interfiram com a captura.
Utilizando uma razão de resina para capturar uma soluçãorodada 1:03-01:04 garante mistura suficiente durante a fase de captura. Um mínimo de 50 mL de resina é necessária com base em nossa experiência; quantidades inferiores irá processar a subsequente série de lavagens difíceis de executar e introduzirá perdas amostra grave, devido à perda de resina. Temos obtido bons resultados usando 100-300 mL de resina para 0,5-2 mg de proteína total. No entanto, a relação entre a quantidade de proteína e resina pode ser amostra dependentes, recomendamos que você otimizar essa condição para as suas amostras e aplicações específicas.
A química hidrazida captura ambos O e-N-glicopéptidos ligados sobre o substrato; devido à falta de uma enzima eficaz para liberar todos os glicopeptídeos ligados a O, nós só usamos PNGase F para estudos N-glicopeptídicos 8,12. A possibilidade de estudar o tipo O de glicopeptídeos pode exigir a descoberta ou bioengenharia de hidrolases apropriadas.
Este método pode ser interrompido em vários patacadores, incluindo: 1) após a obtenção da fracção de membrana, 2) após digestão com tripsina e os peptídeos de limpeza, e 3) após libertação de N-glicopéptidos. Procedimentos adicionais podem ser introduzidos durante esses intervalos. Por exemplo, os péptidos podem ser digeridos diferencialmente marcado por N-isotags como indicado na Figura 1, para a análise quantitativa. Usando um método chamado gagQP, em que os péptidos não modificados são analisados em paralelo com os glicopeptídeos, a precisão da quantificação pode ser significativamente melhorada, como foi demonstrado em uma publicação recente 18.
Si captura glicopéptido pode efectivamente reduzir a complexidade da amostra, e não é geralmente necessário para fraccionar ainda mais os enriquecidos N-glicopéptidos. As exceções se aplicam a situações em que as amostras são abundantes, mas com a dinâmica de concentração substanciais, e as proteínas de interesse estão em baixa abundância, como na descoberta de biomarcadores de proteína no sangue oupara um levantamento completo das proteínas da superfície celular. Nessas circunstâncias ainda fracionamento pode ser implementado para os capturados N-glicopeptídeos para proporcionar uma melhor penetração do glycoproteome. Como a parte inferior do glycoproteome está a ser abordado por meio de fraccionamento, a identificação de não-glicopeptídeos introduzidas pela ligação não específica irá aumentar. Assim, um decréscimo de glicopéptido e selectividade glicoproteína (de ~ 85%) será tipicamente observado após um fraccionamento adicional de N-glicopéptidos 17. Por isso, os pesquisadores precisam pesar os prós e contras ao projetar o procedimento mais adequado.
Para os pesquisadores que nunca utilizaram um método de captura-N-glicopeptídeos, o melhor é praticar o método com alguns N-glicoproteína (s) puro ter conhecido sítios de glicosilação, conforme listado anteriormente 8. Este método é robusta e a selectividade em relação ao N-glicopéptidos é alta. Uma desvantagem deste método reside na inerente baixa abundância de surcara N-glicoproteínas; para uma caracterização completa da amostra, uma quantidade mais elevada é geralmente necessário que a de proteómica citosólicas. No entanto, se as células cultivadas podem ser expandidos in vitro, ou os tecidos de interesse são abundantes, este inconveniente é negligenciável.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi financiada pelo fundo de arranque de Simon Fraser University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DTT | Sigma | 646563 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Iodoacetamide | Sigma | A3221 | |
| Rapigest SF | Waters | 186001860 | |
| Sodium periodate | Sigma | 311448 | |
| PNGase F | New England Biolabs | P0704S | |
| Affi-Gel Hz hydrazide gel | Bio-Rad | 153-6047 | |
| Trypsin | Worthington Biomedical | LS02115 | |
| Sep-Pak C-18 cartridge | Waters | WAT054955 | |
| Oasis MCX cartridge | Waters | 186000252 | |
| Protease inhibitor coctail | Sigma | P8340 | |
| Urea | Amersco | 568 | |
| Sodium sulphite | Caledon | 8360-1 | |
| Invertase | Sigma | I0408 | |
| α-1 trypsin | Sigma | F2006 | |
| Ribonulease B | Sigma | R7884 | |
| Avidin | Sigma | A9275 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503 | |
| Conalbumin | Sigma | C0755 |
References
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