Summary
بروتينات سطح الخلية مهمة من الناحية البيولوجية والغليكوزيلاتي على نطاق واسع. ونحن نقدم هنا نهج ببتيد سكري التقاط لذوبان، وإثراء، وdeglycosylate هذه البروتينات لتحليلات البروتين السهل LC-MS القائمة.
Abstract
بروتينات سطح الخلية، بما في ذلك البروتينات المصفوفة خارج الخلية، والمشاركة في جميع العمليات والوظائف الخلوية الرئيسية، مثل النمو، والتمايز، والانتشار. توصيف شامل لهذه البروتينات يوفر معلومات غنية لاكتشاف العلامات البيولوجية، خلية من نوع تحديد الهوية، واختيار المستهدفة المخدرات، وكذلك المساعدة على تطوير فهمنا لعلم الأحياء الخلوي وعلم وظائف الأعضاء. البروتينات السطحية، ومع ذلك، تشكل تحديات كبيرة التحليلية، وذلك بسبب وفرة منخفضة بطبيعتها، للا مائية عالية، والتعديلات بعد متعدية الثقيلة. الاستفادة من ارتباط بالغليكوزيل انتشارا على سطح البروتينات، ونحن نقدم هنا نهج ببتيد سكري التقاط الإنتاجية العالية التي تدمج مزايا عدة N-glycoproteomics الوسائل المتاحة. يمكن أسلوبنا إثراء glycopeptides المستمدة من البروتينات السطحية وإزالة glycans من أجل البروتينات السطحية باستخدام LC-MS. تضم حلها N-glycoproteome على الوقود النووي المشعormation من هوية البروتين وكمية وكذلك مواقعهم من ارتباط بالغليكوزيل. وقد تم تطبيق هذا الأسلوب لسلسلة من الدراسات في المناطق بما في ذلك السرطان، والخلايا الجذعية، وسمية الدواء. الحد من الأسلوب يكمن في وفرة منخفضة من البروتينات الغشاء السطح، بحيث كمية كبيرة نسبيا من العينات المطلوبة لهذا التحليل مقارنة مع الدراسات التي تركز على البروتينات عصاري خلوي.
Introduction
بروتينات سطح الخلية تتفاعل مع البيئة خارج الخلية والتي ستحول الاشارات من الخارج إلى داخل الخلية. وبالتالي، هذه البروتينات، بما في ذلك البروتينات المصفوفة خارج الخلية، وتلعب أدوارا حاسمة في جميع جوانب البيولوجيا الخلوية وعلم وظائف الأعضاء بدءا من الانتشار والنمو، والهجرة، والتمايز إلى الشيخوخة وهكذا دواليك. البروتينات السطحية تعمل من خلال التفاعل مع الخلايا الأخرى، والبروتينات والجزيئات الصغيرة 1-3. التوصيف الجزيئي للبروتينات سطح الخلية هي ذات أهمية كبيرة ليس فقط لعلماء الأحياء ولكن أيضا لشركات الأدوية، كما يتم استهداف أكثر من 60٪ من الأدوية لبروتينات سطح الخلية 4.
جنبا إلى جنب مطياف الكتلة (MS)، مع حساسيتها الفائقة والدقة والإنتاجية لتحديد البروتينات والببتيدات كانت، أداة قوية لدراسات البروتين 5،6 العالمية. حتى الآن، والبروتينات السطحية تشكل تحديات كبيرة لالبروتيوميات يستند إلى MS-، ووتوجد معظم البروتينات السطحية بكميات منخفضة ومع التعديلات الثقيلة. المناطق التي تمتد غشاء من البروتينات السطحية جعلها مسعور؛ هذا هو الحال بالنسبة للبروتينات عبر الغشاء المتعددة الدخول على وجه الخصوص. بالتالي فمن الصعب حل بروتينات الغشاء في المحاليل المائية دون مساعدة من المنظفات؛ ولكن استخدام المنظفات يقمع عموما أداء HPLC وMS 1،7،8 في تحديد البروتين. وبالتالي، بروتينات غشاء اتسمت ضعيفا في البروتينات المباشرة القائمة LC-MS.
ارتباط بالغليكوزيل هي واحدة من التعديلات بعد متعدية أهم وفيرة تجري في البروتينات على سطح الخلية 9. التعقيد الهائل وعدم التجانس من glycans تعوق الببتيدات 'MS إشارة 10. ومع ذلك، قد استخدمت عدة أساليب البروتين هذا التعديل فريدة من نوعها لإثراء البروتينات السطحية والأنصاف لإزالة السكر من البروتينات قبل تحليل LC-MS. هذه الطريقةو تشمل القائمة على كتين القبض على تقارب 11 ومقرها حمض البوريك أو التقاط الكيميائية المستندة إلى هيدرازيد 12 وكذلك فصل اللوني ماء 8،13. إزالة glycans يحول البروتينات الغشاء إلى البروتينات العادية ويبسط توصيف MS بشكل كبير. بسبب ارتباط بالغليكوزيل أيضا يحدث في البروتينات يفرز التي لديها القابلية للذوبان عالية على النقيض من غشاء بروتينات، يتم تحسين العديد من الطرق لglycoproteomic البروتينات القابلة للذوبان، وتميل إلى أن تكون أقل الانتقائية ببتيد سكري وحساسية عندما يتم نشرهم في غشاء بروتينات 8،14. توجد أساليب أخرى أيضا لإثراء، على وجه الخصوص، البروتينات على سطح الخلية، مثل تلك التي تستخدم تنبيذ فائق 15 واستراتيجيات التوسيم 16. وقد أجريت مقارنة تفصيلية بين طريقتنا والأساليب القائمة الأخرى لوصف البروتينات الغشاء مؤخرا 17، وأشارت النتائج إلى أن طريقة لدينا يمكن أن تؤدي بشكل جيد على قدم المساواة، إن لم يكنأفضل، من جميع الطرق البروتينات الغشاء مقارنة، ولكن مع ارتفاع البساطة.
للمساعدة في استخدام هذه الطريقة الباحثين، ونحن هنا بالتفصيل بروتوكول عام. هذا الأسلوب يدمج العديد من المزايا استراتيجيات glycoproteomics القائمة وضعت خصيصا للبروتينات سكرية الغشاء، إلا أن الأسلوب يعمل بشكل جيد على قدم المساواة للبروتينات يفرزها. خصائص هذا الأسلوب ما يلي: 1) الانحلالية كاملة من البروتينات الغشاء، 2) إثراء glycopeptides بدلا من بروتينات سكرية للقضاء على عائق الفراغية المحتملة عند استخدام اسر الركيزة الصلبة، 3) استخدام الكيمياء هيدرازيد لتكوين روابط تساهمية بين glycopeptides والركيزة اسر، مثل أن glycopeptides المستعبدين يمكن أن يتسامح يغسل صرامة لglycoselectivity عالية، و 4) القدرة على إجراء الإجراء التقاط بأكمله في أنبوب واحد لتخفيض فقدان العينة وتقصير مدة الإجراءات. بعد تنفيذ هذا الأسلوب لدراسة فاريإيتي من العينات البيولوجية بما في ذلك الخلايا والأنسجة، لاحظنا انتقائية عالية (> 90٪) لبروتينات سكرية 8،17،18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. حصاد الأغشية
- إضافة ناقص التوتر العازلة (10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، 10 ملي بوكل، 1.5 ملي MgCl 2، ودرجة الحموضة 8.0) مع مثبط البروتياز كوكتيل على بيليه الخلية (~ 10 8 خلايا) واحتضان لمدة 15-30 دقيقة على الجليد. ليز الخلايا عن طريق تمرير العينة عن طريق الإبر المحاقن (5-10 يمر) أو المجانسة على عينة من الخالط Dounce (15-30 السكتات الدماغية). استخدام عدادة الكريات وتلطيخ الأزرق التريبان للتحقق من كفاءة تحلل.
- الحصول على جزء الميكروسومي قبل الطرد المركزي المغاير للالمحللة في 3،000 GX 15 دقيقة ثم على 100،000 GX 2 ساعة. الطرد المركزي الأول يحصل على بيليه الذي هو جزء النووية، والطرد المركزي لاحقة من طاف يولد بيليه الثاني، الذي هو جزء الميكروسومي الذي يحتوي على غشاء البلازما وكذلك غشاء محدد العضيات 8. طاف الأخير هو جزء عصاري خلوي. تخزين الكسور الميكروسومي في الفريزر -80 درجة مئوية لمزيد من analysهو على النحو المبين أدناه.
2. حل، تفسد، ودايجست بروتينات الغشاء
- حل جزء الميكروسومي في المخزن المؤقت تمسخ (40 ملي تريس، EDTA 10 ملي و 10 ملي TCEP، 0.5٪ Rapigest، ودرجة الحموضة 8) ثم احتضان الحل عند 100 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
- تبريد حل تسخينها إلى درجة حرارة الغرفة، إضافة فائقة النقاء مسحوق اليوريا إلى حل ل8 M تركيز النهائي واحتضان العينة على 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- إضافة محلول المخزون iodoacetamide للعينة إلى 15 ملي تركيز النهائي، واحتضان الحل في الظلام لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ليؤلكل على ثيول حرة في العينة. إضافة DTT الحل الأسهم إلى العينة إلى 10 ملي تركيز النهائي واحتضان الحل لمدة 10 دقيقة أخرى في درجة حرارة الغرفة لإرواء iodoacetamide المفرطة.
- تمييع الحل تم الحصول عليها مع 10X 40 ملي تريس العازلة في درجة الحموضة 8، وبعد ذلك إضافة إلى التربسين العينة بنسبة 01:20 من trypsiن إلى البروتين الكلي. الحفاظ على رد فعل الهضم في ليلة وضحاها الفرن 37 درجة مئوية لضمان اكتمال التفاعل.
- إنهاء عملية الهضم عن طريق المحمضة الحل عينة لدرجة الحموضة 1 مع حمض الهيدروكلوريك، وهو الشرط الذي يكسر أيضا أسفل المنظفات، أي Rapigest. تدهور Rapigest عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة، وإزالة هطول ضعت بواسطة الطرد المركزي.
- تنظيف طاف يحتوي على الببتيدات عينة من قبل C-18 استخراج المرحلة الصلبة (SPE) خرطوشة وتجفيف العينة التي حصلت عليها speedvac.
- إجراء تحليل SDS-PAGE العينات قبل وبعد عملية الهضم التربسين لتأكيد كفاءة الهضم.
3. ببتيد سكري لقطة
- حل الببتيدات تنظيفها في المخزن المؤقت اقتران (100 ملي خلات الصوديوم، ودرجة الحموضة 5.5). إضافة بريودات الصوديوم في حل الببتيد في 10 ملي تركيز النهائي لمدة 30 دقيقة في الظلام، في درجة حرارة الغرفة. وهذا أكسدة المجموعات رابطة الدول المستقلة ديول في glycans إلى الألدهيدات، والتي تسمح للglycans لزوجين إلى الراتنج من خلال الكيمياء هيدرازيد. إخماد بريودات المفرطة من جانب سلفيت الصوديوم في 20 ملي تركيز النهائي ودرجة الحموضة 5 لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- أعرض الراتنج derivatized هيدرازيد في حل الببتيد في نسبة 1:4 (الراتنج إلى الحل) لglycopeptides الزوجين إلى الراتنج. احتضان رد الفعل عند 37 درجة مئوية لمدة 1-2 أيام مع نهاية إلى نهاية الدوران للاقتران كاملة.
- إزالة الببتيدات غير منضم عن طريق الغسيل الراتنج مرتين مع 1 مل من كل من العناصر التالية: الماء DI، 1.5 M كلوريد الصوديوم، و 80٪ الميثانول أسيتونتريل. أخيرا، وغسل 3X الراتنج مع 1 مل من 100 ملي NH 4 HCO 3 في الرقم الهيدروجيني 8 لتبادل المخزن المؤقت للنظام ل100 ملي NH 4 HCO 3.
- جمع طاف ويغسل لتحليل الببتيدات غير منضم (اختياري).
- الافراج عن N-glycopeptides من الراتنج التي كتبها PNGase F في الحضانة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية معن نهاية إلى نهاية الدوران. جمع الببتيدات سراح بواسطة الطرد المركزي وغسل أسيتونتريل 80٪. تجف الحل التي تم الحصول عليها في speedvac لتحليل LC-MS.
4. مزيد من التقطير (اختياري)
لمزيد من تبسيط التعقيد العينة، يجزئ في الحصول على N-glycopeptides. على سبيل المثال، تنحل الببتيدات المجففة إلى 10 ملي فورمات الأمونيا، ودرجة الحموضة 3 مع 20٪ أسيتونتريل واستخدام تبادل الأيونات الموجبة قوية (SCX) اللوني ليجزئ الببتيدات. تجفيف شاطف الحصول عليها، ومن ثم تحليل الكسور الببتيد التي حصل عليها عكس المرحلة LC-MS 8،17،18.
5 تنظيف من الاصدار N-glycopeptides (اختياري)
إذا ارتفعت المخاوف بشأن التلوث المحتمل من الببتيدات، تنحل الببتيدات المجففة إلى حمض الفورميك بنسبة 0.1٪ واستخدام عمود MCX SPE لمزيد من تنظيف الببتيدات قبل العكسية مرحلة التحليل LC-MS.
خلال الانقسام الانتقائي للN-glycopeptides قبالة الراتنج، PNGase F تحويل أسباراجين-N غليكان مرتبطة حمض الأسبارتيك. وبالتالي، هناك 0.9840 دا التحول الشامل للالمحررة N-glycopeptides. لتحديد بدقة هذه الببتيدات، يحتاج هذا التعديل إلى أن تضاف إلى معلمات البحث جنبا إلى جنب مع تعديلات مشتركة مثل carbamidomethylation من السيستين والميثيونين أكسدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وتتلخص مخطط تدفق ممثل الإجراء التجريبي في الشكل 1. وسم ومزيد من الخطوات تجزئة اختيارية ويتم وصفها من التفاصيل في منشور صدر مؤخرا 18. خيار آخر هو تحليل الببتيدات غير معدلة، والتي لا تتفاعل مع الراتنج. وتشمل مزايا تحليل الببتيدات معدلة تحديد إمكانات الببتيدات والبروتينات غير الغليكوزيلاتي، مثل claudins في منعطفات ضيقة؛ ميزة إضافية هي الكميات أكثر دقة. استنادا إلى هذه المزايا، ونحن وصف هذا الأسلوب ز ز lobal ssisted ف uantitative roteomics ص (gagQP) على lycocapture، وتحليل مفصل في المنشورات الأخيرة 18.
ويرد الطيف ببتيد سكري النموذجية التي اتخذت بعد طريقة تخصيب اليورانيوم في الشكل 2. في ببتيد سكري الحصول عليها، تم إزالة N-غليكان وأسباراجين غليكان المرفقة (N) ثكما تحويلها إلى حمض الأسبارتيك (D) عن طريق PNGase F؛ وبالتالي، فإن الطيف يمكن البحث بسهولة باستخدام أي محرك بحث البروتيوميات ضد قواعد البيانات تسلسل البروتين المشتركة.
طريقة التقاط يمكن تقييمها من قبل بروتينات سكرية نموذج المتاحة تجاريا قبل تطبيقه مع العينات البيولوجية المعقدة وقيمة. وتشمل بعض البروتينات السكرية النموذج المستخدم في كثير من الأحيان أفيدين (الدجاج)، ألبومين البيض (الدجاج)، الانفرتيز (الخميرة)، α-1 انتيتريبسين (الإنسان)، كونالبومين (الدجاج)، وريبونوكلياز B (البقري) (جميع يمكن الحصول عليها من سيغما). وglycopeptides تحديدها مرارا من هذه البروتينات يمكن العثور عليها في منشور السابق 8. A مخصصة البروتين تسلسل قاعدة بيانات FASTA التي هي مناسبة لبحث التلقائي للنتائج LC-MS المتولدة من هذه البروتينات نموذج يمكن تحميلها من الرابط التالي (http://www.sfu.ca/chemistry/groups/bingyun_sun/tools.html )، والذي يتضمن البروتينات نموذج المذكورة أعلاه، فضلا عن مراجعة قاعدة بيانات الخميرة تسلسل ersed والملوثات الشائعة وPNGase F.
ويرد نموذجي LC-MS نتيجة القبض N-glycopeptides في الشكل 3، والتي يمكن تحديدها أكثر من 100 بروتينات سكرية من نفس واحدة LC-MS الهاربين من جزء الميكروسومي الخلية. الانتقائية التخصيب الى كل من بروتينات سكرية وglycopeptides عموما أكثر من 90٪. تحليل ناجحة يمكن أن يكون لها الانتقائية تخصيب 95٪. باستخدام عمود SCX وخطوة إلى مزيد من الانحدار يجزئ العينات قبل LC-MS يحلل سيتضاعف عادة عدد من التعرف بروتين سكري 17. في بعض الأحيان، عندما كمية من glycopeptides الحصول عليها منخفضة، والنجاسة المتراكم من قارورة يمكن ملاحظتها في العينة النهائية. ويمكن إزالة هذه الملوثات من خلال طريقة المنصوص عليها في الخطوة 5.
. JPG "سرك =" / files/ftp_upload/51349/51349fig1.jpg "العرض =" 350 "/>
الخطوات والماس الشكل 1. تدفق الرسم البياني لإجراء التجارب. مطلوبة مستطيلات خطوات اختيارية.
الشكل 2. التصادم الناجم عن التفكك (CID) الطيف من AEPIL N ISNAGPWSR من الخميرة بيكر بعد أسلوب ببتيد سكري التقاط. يتم تحويل أسباراجين أكد (N) إلى حمض الأسبارتيك (D) كما هو مبين باللون الأحمر في تسلسل الببتيد في الشكل .
الشكل 3. مؤامرة 2D من LC-MS نتيجة N-GLycopeptides تم الحصول عليها من الخلايا الجذعية الجنينية (E14.Tg2a). النقاط هي الكشف عن الببتيدات، وهذا اللون من نقطة تمثل الثقة الهوية التي تم الحصول عليها إحصائيا (أي الببتيد احتمال).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ونحن هنا نقدم استراتيجية ببتيد سكري التقاط لالتنميط بروتينات سطح الخلية. طريقة يمكن تطبيقها على دراسة بروتينات يفرزها، مثل تلك الموجودة في الدم، وكذلك في سوائل الجسم الأخرى أو في الخلية سائل الإعلام والثقافة.
نجاح الأسلوب يعتمد على الهضم كاملة من العينات؛ وبالتالي، وتوصيف SDS-PAGE كفاءة الهضم هو ضروري، خصوصا لتحليل لأول مرة لعينة. A الهضم الكامل يمكن أن يكون تحديا للبروتينات الغشاء، ويمكن أن يكون ممكنا إلا بعد ذوبان شامل للجزء الغشاء. تبدأ عملية الإذابة عندما يتم إدخال المنظفات وينتهي بعد الحضانة من اليوريا. لذلك، إذا تقدم ملبد في العينة قبل إضافة اليوريا اليوريا ولكن يختفي بعد الحضانة، والانحلالية كافية. إذا كان جزء الغشاء يصعب حل، زيادة كمية من المنظفات المستخدمة. لعينات الأنسجة غشاء الغنيةمثل أنسجة المخ والدهنية، ويمكن استخدام 5٪ Rapigest. في بعض الأحيان، يمكن أن تظهر هطول الأمطار خلال التخفيف من العينات قبل عملية الهضم التربسين، والتي هي أكثر كثيرا ما لوحظ لعينات مصل الإنسان. سبب هذا التساقط هو أساسا تركيزات انخفضت من اليوريا والمنظفات. عموما سوف يتم إزالة هذه هطول بواسطة التربسين أثناء الهضم وليس مصدر قلق. ومع ذلك، عندما الأشكال هطول، فمن المهم لتدوير عينة قارورة خلال خطوة عملية الهضم لضمان خلط جيدة. الرقم الهيدروجيني للخطوة glycocapture مهم لأن الأمينات الأولية في الببتيدات، مثل تلك التي من N-تيرميني وlysines، وسوف تتفاعل مع الألدهيدات تشكلت حديثا بعد أكسدة بريودات. وبالتالي، فمن المهم أن protonate هذه الأمينات عن طريق ضبط الرقم الهيدروجيني من الحل لالتقاط أدناه 6.0 باستخدام العازلة خلات، لمنعهم من التدخل في الالتقاط.
باستخدام نسبة من الراتنج لالتقاط حل لجولة 1:03 حتي 1:04 يضمن خلط كافية خلال الخطوة الالتقاط. ما لا يقل عن 50 ميكرولتر من الراتنج من الضروري بناء على خبرتنا؛ سوف كميات أقل تقديم سلسلة لاحقة من يغسل الصعب لأداء وسوف أعرض خسارة فادحة العينة بسبب فقدان الراتنج. لقد حصلنا على نتائج جيدة باستخدام 100-300 ميكرولتر من الراتنج ل0.5-2 ملغ من البروتين الكلي. ومع ذلك، فإن النسبة بين كمية البروتين والراتنج يمكن أن تكون العينة تعتمد، ونحن ننصح تحسين هذا الشرط للحصول على عينات محددة والتطبيقات.
الكيمياء هيدرازيد يلتقط كلا O-N-glycopeptides وربط على الركيزة؛ نظرا لعدم وجود إنزيم فعالة للإفراج عن جميع glycopeptides المرتبطة O، كنا فقط PNGase F للدراسات N-ببتيد سكري 8،12. إمكانية دراسة من نوع O من glycopeptides قد تتطلب اكتشاف أو الهندسة الحيوية من hydrolases المناسبة.
هذا الأسلوب يمكن أن يكون مؤقتا في عدة عالأربطة منها: 1) بعد الحصول على جزء الغشاء، 2) بعد الهضم التربسين وتنظيف الببتيدات، و 3) بعد الافراج عن N-glycopeptides. ويمكن إدخال إجراءات إضافية خلال هذه الفترات. على سبيل المثال، الببتيدات هضمها يمكن أن توصف بشكل مختلف من قبل N-isotags كما هو مبين في الشكل 1، للتحليل الكمي. باستخدام طريقة تسمى gagQP، التي يتم تحليلها في الببتيدات معدلة بالتوازي مع glycopeptides، ودقة الكميات يمكن أن تحسن بشكل كبير كما أثبتنا في منشور صدر مؤخرا 18.
القبض على ببتيد سكري نفسه يمكن أن تقلل بشكل فعال تعقيد العينة، وذلك هو عموما ليس من الضروري مزيد يجزئ المخصب N-glycopeptides. تطبيق استثناءات للحالات التي يكون فيها عينات وفيرة ولكن مع ديناميات تركيز كبير، والبروتينات من الفائدة هي في وفرة منخفضة، كما هو الحال في اكتشاف المؤشرات الحيوية البروتين في الدم أولمسح كامل للبروتينات سطح الخلية. في ظل هذه الظروف مزيد من التجزئة يمكن تنفيذها لالتقاطها N-glycopeptides لتوفير اختراق أفضل للglycoproteome. كما يجري التطرق في الجزء السفلي من glycoproteome من خلال تجزئة، وتحديد غير glycopeptides-عرضته ملزمة غير محددة زيادة. وعادة ما يتعين مراعاتها بالتالي انخفاض ببتيد سكري وبروتين سكري الانتقائية (ل~ 85٪) بعد تجزئة مزيد من N-glycopeptides 17. لذلك، يحتاج الباحثون إلى الموازنة بين الايجابيات والسلبيات عند تصميم إجراءات أكثر ملائمة.
للباحثين الذين لم يسبق لهم استخدام وسيلة N-ببتيد سكري التقاط، فمن الأفضل لممارسة الأسلوب مع عدد قليل نقية N-بروتين سكري (ق) بعد أن مواقع ارتباط بالغليكوزيل المعروفة باسم المذكورة سابقا 8. هذا الأسلوب هو قوية والانتقائية إلى N-glycopeptides عالية. ومن عيوب هذه الطريقة تكمن في وفرة المتأصلة المنخفض للسورالوجه N-بروتينات سكرية؛ لتوصيف شامل لعينة، وارتفاع كمية هو مطلوب عموما من ذلك من البروتينات عصاري خلوي. ومع ذلك، إذا الخلايا المستزرعة يمكن توسيعها في المختبر أو أنسجة الفائدة وفيرة، وهذا العيب لا يكاد يذكر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا البحث من قبل صندوق بدء التشغيل من جامعة سايمون فريزر.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DTT | Sigma | 646563 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Iodoacetamide | Sigma | A3221 | |
| Rapigest SF | Waters | 186001860 | |
| Sodium periodate | Sigma | 311448 | |
| PNGase F | New England Biolabs | P0704S | |
| Affi-Gel Hz hydrazide gel | Bio-Rad | 153-6047 | |
| Trypsin | Worthington Biomedical | LS02115 | |
| Sep-Pak C-18 cartridge | Waters | WAT054955 | |
| Oasis MCX cartridge | Waters | 186000252 | |
| Protease inhibitor coctail | Sigma | P8340 | |
| Urea | Amersco | 568 | |
| Sodium sulphite | Caledon | 8360-1 | |
| Invertase | Sigma | I0408 | |
| α-1 trypsin | Sigma | F2006 | |
| Ribonulease B | Sigma | R7884 | |
| Avidin | Sigma | A9275 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503 | |
| Conalbumin | Sigma | C0755 |
References
- Cho, W., Stahelin, R. V. Membrane-protein interactions in cell signaling and membrane trafficking. Annual review of biophysics and biomolecular structure. 34, 119-151 (2005).
- Tadevosyan, A., Vaniotis, G., Allen, B. G., Hebert, T. E., Nattel, S. G. protein-coupled receptor signalling in the cardiac nuclear membrane: evidence and possible roles in physiological and pathophysiological function. The Journal of physiology. 590, 1313-1330 (2012).
- White, S. H. Biophysical dissection of membrane proteins. Nature. 459, 344-346 (2009).
- Heijne, G. Membrane-protein topology. Nature reviews Molecular cell biology. 7, 909-918 (2006).
- Cox, J., Mann, M. Quantitative high-resolution proteomics for data-driven systems biology. Annual review of biochemistry. 80, 273-299 (2011).
- Lamond, A. I., et al. Advancing cell biology through proteomics in space and time (PROSPECTS). Mol Cell Proteomics. 11, (2012).
- Savas, J. N., Stein, B. D., Wu, C. C., Yates 3rd, J. R. Mass spectrometry accelerates membrane protein analysis. Trends in biochemical sciences. 36, 388-396 (2011).
- Sun, B., et al. Shotgun glycopeptide capture approach coupled with mass spectrometry for comprehensive glycoproteomics. Mol Cell Proteomics. 6, 141-149 (2007).
- Lowe, J. B. Glycosylation, immunity, and autoimmunity. Cell. 104, 809-812 (2001).
- Dodds, E. D. Gas-phase dissociation of glycosylated peptide ions. Mass spectrometry reviews. 31, 666-682 (2012).
- Kaji, H., et al. Lectin affinity capture, isotope-coded tagging and mass spectrometry to identify N-linked glycoproteins. Nat Biotechnol. 21, 667-672 (2003).
- Zhang, H., Li, X. J., Martin, D. B., Aebersold, R. Identification and quantification of N-linked glycoproteins using hydrazide chemistry, stable isotope labeling and mass spectrometry. Nat Biotechnol. 21, 660-666 (2003).
- Hagglund, P., Bunkenborg, J., Elortza, F., Jensen, O. N., Roepstorff, P. A new strategy for identification of N-glycosylated proteins and unambiguous assignment of their glycosylation sites using HILIC enrichment and partial deglycosylation. J Proteome Res. 3, 556-566 (2004).
- Bond, M. R., Kohler, J. J. Chemical methods for glycoprotein discovery. Current opinion in chemical biology. 11, 52-58 (2007).
- Pasini, E. M., et al. In-depth analysis of the membrane and cytosolic proteome of red blood cells. Blood. 108, 791-801 (2006).
- Wollscheid, B., et al. Mass-spectrometric identification and relative quantification of N-linked cell surface glycoproteins. Nat Biotechnol. 27, 378-386 (2009).
- Sun, B., et al. N-Glycoproteome of E14.Tg2a mouse embryonic stem cells. PLoS ONE. 8, (2013).
- Sun, B., et al. Glycocapture-assisted global quantitative proteomics (gagQP) reveals multiorgan responses in serum toxicoproteome. J Proteome Res. 12, 2034-2044 (2013).
