Summary
Celleoverfladeproteiner er biologisk vigtige og almindeligt glycosyleret. Vi introducerer her en glycopeptid-capture metode til at opløse, berige og deglycosylate disse proteiner for letkøbte LC-MS baserede proteomikanalyser.
Abstract
Celleoverfladeproteiner, herunder ekstracellulære matrix proteiner, deltage i alle større cellulære processer og funktioner, såsom vækst, differentiering og proliferation. En omfattende karakterisering af disse proteiner giver rig information til biomarkør opdagelse, identifikation celle-typen, og valg af medicin-target, samt hjælpe til at fremme vores forståelse af cellebiologi og fysiologi. Overfladeproteiner dog anledning betydelige analytiske udfordringer på grund af deres iboende lav tæthed, høj hydrofobicitet, og tunge post-translationelle modifikationer. Drage fordel af den fremherskende glykosylering på overfladeproteiner, vi indfører her en high-throughput glycopeptidet-capture tilgang, der integrerer fordelene ved flere eksisterende N-glycoproteomics midler. Vores metode kan berige glycopeptiderne afledt af overfladeproteiner og fjerne deres glycans for letkøbte proteomics ved hjælp af LC-MS. Den løst N-glycoproteome omfatter information protein identitet og mængde samt deres lokaliteter af glycosylering. Denne metode er blevet anvendt på en række undersøgelser i områder, herunder cancer, stamceller og lægemiddeltoksicitet. Begrænsningen af fremgangsmåden ligger i lav overflod af overflademembranproteiner, således at en relativt stor mængde af prøver, der er nødvendige til denne analyse i forhold til undersøgelser centreret om cytosoliske proteiner.
Introduction
Celleoverfladeproteiner interagere med det ekstracellulære miljø og relæ signaler fra ydersiden til indersiden af en celle. Således er disse proteiner, herunder ekstracellulære matrix proteiner, spiller afgørende roller i alle aspekter af cellebiologi og fysiologi spænder fra spredning, vækst, migration, differentiering til aldring og så videre. Overfladeproteiner fungere ved interaktion med andre celler, proteiner og små molekyler 1-3. Molekylær karakterisering af celleoverfladeproteiner er af stor interesse ikke kun for biologer, men også til farmaceutiske virksomheder, hvor mere end 60% af lægemidler er målrettet til celleoverfladeproteiner 4.
Tandem massespektrometri (MS), med sin overlegne følsomhed, nøjagtighed og gennemløb til identifikation af proteiner og peptider, har været et effektivt redskab til globale proteom studier 5,6. Alligevel overfladeproteiner udgøre en betydelig udfordring for MS-baserede proteomics, somfindes de fleste overfladeproteiner i små mængder og med tunge modifikationer. De membranspændende regioner af overfladeproteiner gøre dem hydrofobe; dette er især tilfældet for MultiPass transmembrane proteiner. Det er derfor vanskeligt at opløse membranproteiner i vandige opløsninger uden hjælp fra et rengøringsmiddel; men anvendelsen af detergenter er generelt undertrykker udførelsen af HPLC og MS 1,7,8 protein identifikation. Derfor har membranproteiner er blevet dårligt karakteriseret i direkte LC-MS baserede proteomics.
Glycosylering er en af de vigtigste og mest udbredte post-translationelle modifikationer, der finder sted i celleoverfladeproteiner 9. Den enorme kompleksitet og heterogenitet glykaner hæmme peptider 'MS signal 10. Ikke desto mindre har flere proteom metoder denne unikke modifikation at berige overfladeproteiner og fjerne sukkergrupperne fra proteiner før LC-MS-analyse. Disse metodes omfatter lectin-baserede affinitetsindfangning 11 og hydrazid-baserede eller borsyre-baserede kemiske capture 12 samt hydrofile kromatografiske separationer 8,13. Fjernelsen af glykaner forvandler membranproteiner til almindelige proteiner og drastisk forenkler MS karakterisering. Fordi glykosylering finder også sted i udskilte proteiner, der har høj opløselighed i modsætning til membranproteiner, er mange glycoproteomic metoder optimeret til opløselige proteiner, og har tendens til at have lavere glycopeptid selektivitet og følsomhed, når bliver indsat til membranproteiner 8,14. Andre metoder findes også at berige navnlig celleoverfladeproteiner, såsom dem, der bruger ultracentrifugering 15 og mærkning strategier 16. En detaljeret sammenligning mellem vores metode og andre eksisterende metoder til karakterisering af membranproteiner blev foretaget for nylig 17, og resultaterne viste, at vores metode kan udføre lige så godt, hvis ikkebedre, end alle de sammenlignede membran proteomics metoder, men med højere enkelhed.
For at hjælpe forskerne bruge denne metode, vi detalje her en generel protokol. Denne metode integrerer adskillige fordele eksisterende glycoproteomics strategier, og der er udformet specielt til membranglycoproteiner, men metoden fungerer lige så godt for secernerede proteiner. Egenskaberne af denne fremgangsmåde omfatter: 1) en fuldstændig solubilisering af membranproteiner, 2) en berigelse af glycopeptider stedet for glycoproteiner at eliminere potentiel sterisk hindring, når der anvendes et fast indfangende substrat, 3) anvendelse af hydrazid kemi til dannelse af kovalente bindinger mellem glycopeptider og den indfangende substrat, således at de bundne glycopeptider kan tåle strenge vasker i høj glycoselectivity, og 4) evnen til at udføre hele indfangningsproceduren i et rør til mindre tab prøve og afkortet procedure varighed. Efter gennemførelsen af denne metode til at studere en variabelETY af biologiske prøver, herunder celler og væv, observerede vi en høj selektivitet (> 90%) til glycoproteiner 8,17,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Harvest Membranes
- Tilføj hypotonisk puffer (10 mM Tris-HCI, 10 mM KCI, 1,5 mM MgCl2, pH 8,0) med proteasehæmmer cocktail på en cellepellet (~ 10 8 celler) og inkuberes i 15-30 min på is. Lyse cellerne ved at lede prøven gennem injektionsnåle (5-10 gennemløb) eller homogenisere prøven ved en Dounce homogenisator (15-30 slag). Brug et hæmocytometer og trypanblåt-farvning for at kontrollere effektiviteten af lysis.
- Opnå den mikrosomale fraktion med en differentiel centrifugering af lysatet ved 3.000 gx 15 minutter og derefter ved 100.000 gx 2 timer. Den første centrifugering opnår en pellet, der er kernefraktionen og den efterfølgende centrifugering af supernatanten genererer en anden pellet, der er mikrosomale fraktion, der indeholder plasmamembranen samt membranbundne organeller 8. Den endelige supernatant den cytosoliske fraktion. Opbevar mikrosomale fraktioner i -80 ° C fryseren for yderligere analyser som angivet nedenfor.
2.. Opløs, Denaturer og Digest Membranproteiner
- Den mikrosomale fraktion opløses i denatureringsbuffer (40 mM Tris, 10 mM EDTA, 10 mM TCEP, 0,5% Rapigest, pH 8), og derefter inkuberes opløsningen ved 100 ° C i 10 min.
- Afkøl opvarmede opløsningen til stuetemperatur tilsættes ultrahøj renhed urinstof pulver i opløsningen til 8 M endelig koncentration og inkubere prøven ved 37 ° C i 30 minutter.
- Tilføj iodacetamid stamopløsning til prøven til 15 mM slutkoncentration, og inkuber opløsningen i mørke i 30 minutter ved stuetemperatur for at alkylere de frie thioler i prøven. Tilføj DTT stamopløsning til prøven til 10 mM slutkoncentration, og der inkuberes opløsningen i yderligere 10 minutter ved stuetemperatur til standsning af overdreven iodacetamid.
- Fortyndes den opnåede opløsning 10x med 40 mM Tris-puffer ved pH 8, og derefter tilføje trypsin til prøven ved en 1:20 af trypsin total protein. Oprethold digereringsreaktionen i en 37 ° C ovn natten over for at sikre, at reaktionen er afsluttet.
- Afslut fordøjelse ved syrning af prøven til pH 1 med HCI, en tilstand, som også nedbryder vaskemiddel, dvs Rapigest. Forringe Rapigest ved 37 ° C i 1 time, og fjerne den udviklede fældning ved centrifugering.
- Rengør supernatanten, der indeholder prøve peptider med en C-18 fast fase-ekstraktion (SPE) patron og tørre den opnåede prøve ved Speedvac.
- Udfør en SDS-PAGE-analyse af prøver før og efter trypsinspaltning at bekræfte fordøjelsen effektivitet.
3.. Glycopeptid Capture
- Opløses de rensede peptider i koblingsbuffer (100 mM natriumacetat, pH 5,5). Tilføj natriumperiodat i peptidet opløsning ved en 10 mM slutkoncentration i 30 minutter i mørke ved stuetemperatur. Dette vil oxidere cis-diolgrupper i glycans til aldehyder, Som tillader glycanerne til par til harpiksen gennem hydrazid kemi. Quench overdreven periodat ved natriumsulfit ved en 20 mM slutkoncentration, og pH 5 til 10 minutter ved stuetemperatur.
- Indføre hydrazid-derivatiseret harpiks i peptidet opløsning ved et forhold på 1:4 (harpiks opløsning) til par glycopeptider til harpiksen. Inkuberes reaktionsblandingen ved 37 ° C i 1-2 dage med ende-til-ende rotation i komplet kobling.
- Fjern de ubundne peptider ved vask af harpiksen to gange med 1 ml af hver af følgende: DI-vand, 1,5 M NaCl, methanol og 80% acetonitril. Endelig vaskes harpiksen 3x med 1 ml 100 mM NH4 HCO3 ved pH 8 for at udveksle bufferen i systemet til 100 mM NH4 HCO3.
- Saml supernatanten og vask til analyse af ubundne peptider (valgfrit).
- Slip N-glycopeptider fra harpiksen ved PNGase F i en inkubation natten over ved 37 ° C med enn ende-til-ende rotation. Indsamle de frigjorte peptider ved centrifugering, og en 80% acetonitril vask. Tør den opnåede opløsning i speedvac for LC-MS-analyse.
4.. Yderligere Fraktionering (valgfri)
For yderligere at forenkle prøve kompleksitet, fractionate de opnåede N-glycopeptider. For eksempel genopløse de tørrede peptider i 10 mM ammoniak, pH 3 med 20% acetonitril og bruge stærke kationbytter (SCX) kromatografi for at fraktionere peptiderne. Tør den opnåede eluent og derefter analysere de opnåede peptid-fraktioner ved omvendt fase LC-MS 8,17,18.
5.. Rensning af de frigivne N-glycopeptider (valgfri)
Hvis bekymringer stige for den potentielle forurening af peptiderne, genopløse de tørrede peptider til 0,1% myresyre og bruge en MCX SPE-søjle yderligere rense peptiderne før omvendt fase LC-MS-analyse.
Under selektiv spaltning af N-glycopeptider off harpiksen PNGase F omdanner N-glycan forbundet asparagin til en asparaginsyre. Der er derfor en 0,9840 Da masse skift af frigivne N-glycopeptider. Til præcist at identificere disse peptider, skal føjes til de søgeparametre sammen med almindelige modifikationer såsom carbamidomethylation af cystein og oxidation af methionin denne ændring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et repræsentativt flowdiagram for den eksperimentelle procedure er opsummeret i fig. 1. Mærkningen og yderligere fraktioneringstrin er valgfri og detaljer er beskrevet i en nylig publikation 18. En anden mulighed er at analysere de umodificerede peptider, som ikke reagerer med harpiksen. Fordelene ved at analysere de umodificerede peptider indbefatter potentielle identifikation af ikke-glycosylerede peptider og proteiner, såsom claudins i tight junctions; en yderligere fordel er mere nøjagtig kvantificering. Baseret på disse fordele, vi kaldt denne metode g lycocapture-a ssisted-g lobal q uantitative p roteomics (gagQP), og detaljeret analyse i et nyere publikationer 18.
En typisk glycopeptid spektrum taget efter berigelse metode er vist i fig. 2. I den opnåede glycopeptid, N-glycan blev fjernet, og glycan-attached asparagin (N) wsom omdannes til en asparaginsyre (D) med PNGase F; derfor kan spektret let søges ved hjælp af en proteomics søgemaskine imod fælles protein sekvensdatabaser.
Tilfangetagelsen metode kan evalueres ved kommercielt tilgængelige model glycoproteiner før dens anvendelse med komplekse og værdifulde biologiske prøver. Nogle hyppigt anvendte model glycoproteiner indbefatter avidin (kylling), ovalbumin (kylling), invertase (gær), α-1-antitrypsin (human), Konalbumin (kylling), og ribonuklease B (kvæg) (alle kan fås fra Sigma). De hyppigst identificerede glycopeptider fra disse proteiner kan findes i en tidligere publikation 8. En skræddersyet protein-sekvens FASTA database, der er egnet til automatisk søgning af LC-MS resultater fra disse model proteiner kan downloades fra følgende link (http://www.sfu.ca/chemistry/groups/bingyun_sun/tools.html ), der omfatter de ovennævnte model proteiner samt en omdrejningstæller ersed gær-sekvens database, fælles forurenende stoffer og PNGase F.
En typisk LC-MS følge af tilfangetagne N-glycopeptider er vist i figur 3, hvor mere end 100 glycoproteiner kan identificeres fra en enkelt LC-MS løb af en celle mikrosomal fraktion. Berigelse selektivitet for både glycoproteiner og glycopeptider er generelt mere end 90%. En vellykket analyse kan have en berigelse selektivitet på 95%. Ved hjælp af en SCX-søjle og trinvis gradient til yderligere fraktionering prøverne forud for LC-MS-analyser vil normalt fordoble antallet af glycoprotein identifikationer 17. Nogle gange, når mængden af de opnåede glycopeptider er lav, kan der observeres urenheden akkumuleret fra hætteglassene i den endelige prøve. Disse forureninger kan fjernes ved metoden i trin 5..
. Jpg "src =" / files/ftp_upload/51349/51349fig1.jpg "width =" 350 "/>
Figur 1.. Flow diagram af den eksperimentelle procedure. Rektangler er nødvendige trin og diamanter er valgfrie trin.
Figur 2.. Kollision dissociation (CID) spektrum af AEPIL N ISNAGPWSR fra bagegær efter glycopeptidet-capture-metoden. Den understregede asparagin (N) omdannes til asparaginsyre (D) som fremhævet i rødt i peptidsekvens i figuren .
Figur 3. 2D plot af LC-MS følge af N-GLycopeptides opnået fra muse embryonale stamceller (E14.Tg2a). Prikkerne er de fundne peptider og farven på prik repræsenterer identifikationen tillid opnået statistisk (dvs. peptid sandsynlighed).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her introducerer vi et glycopeptid-capture strategi for profilering celleoverfladeproteiner. Fremgangsmåden kan anvendes til at studere secernerede proteiner, såsom de i blod, såvel som i andre kropsvæsker eller celledyrkningsmedier.
Succesen af Metoden bygger på fuldstændig fordøjelse af prøver; Derfor er det nødvendigt med en SDS-PAGE karakterisering af fordøjelsen effektivitet, især for første gang en analyse af en prøve. En komplet fordøjelse kan være en udfordring for membranproteiner, og kan kun være muligt efter grundig opløsning af membranfraktionen. Solubiliseringen proces begynder, når detergentet indføres og slutter efter inkubation af urinstof. Derfor, hvis uklarhed viser i prøven før tilsætning af urinstof, men forsvinder efter urinstof inkubation solubiliseringen er tilstrækkelig. Hvis membranfraktionen er vanskeligt at opløse, øge mængden af vaskemiddel. For membran-rige vævsprøversåsom hjerne-og fedtvæv, kan 5% Rapigest udnyttes. Nogle gange kan udfældning forekomme under fortynding af prøver forud for trypsinfordøjelse, der hyppigere observeret for menneskerettighederne serumprøver. Årsagen til denne udfældning er især de nedsatte koncentrationer af urinstof og vaskemiddel. Denne udfældning vil i almindelighed blive fjernet med trypsin under fordøjelsen og er ikke et problem. Men når nedbørs former, er det vigtigt at rotere prøvehætteglasset under spaltningstrinnet at sikre en god blanding. PH af glycocapture trin er vigtigt, fordi de primære aminer i peptider, såsom dem fra N-terminalerne og lysiner, vil reagere med de nyligt dannede aldehyder efter periodat oxidation. Således er det vigtigt at protonere disse aminer ved at justere pH-værdien af den indfangende opløsning til under 6,0 ved anvendelse af acetatbuffer, for at forhindre dem i at interferere med opsamling.
Anvendelse af et forhold mellem harpiks og fange opløsning enrunde 1:03 til 1:04 sikrer tilstrækkelig blanding under opsamling trin. Et minimum af 50 pi harpiks er nødvendig baseret på vores erfaring; mindre mængder vil gøre den efterfølgende serie af vaske svære at udføre og vil indføre alvorlig prøve tab på grund af tabet af harpiks. Vi har opnået gode resultater ved hjælp af 100-300 pi af harpiks til 0,5-2 mg totalt protein. Forholdet mellem mængden af protein og harpiks kan imidlertid være prøve afhængige, vi anbefaler, at du optimerer denne betingelse for dine specifikke prøver og applikationer.
Hydrazid kemi indfanger både O-og N-bundne glycopeptider på substratet; på grund af manglen på et effektivt enzym til at frigive alle de O-bundne glycopeptider, vi kun brugt PNGase F til N-glycopeptid undersøgelser 8,12. Mulighed for at studere O-type glycopeptider kan kræve opdagelse eller bioteknologi passende hydrolaser.
Denne metode kan sættes på pause på flere psnørebånd herunder: 1) Efter opnåelse membranfraktionen, 2) efter trypsinfordøjelse og rensning af peptiderne, og 3) efter frigivelsen af N-glycopeptider. Yderligere procedurer kan indføres i disse intervaller. For eksempel kan de spaltede peptider differentielt mærket ved N-isotags som angivet i figur 1, til kvantitativ analyse. Ved hjælp af en metode, der kaldes gagQP, hvor de umodificerede peptider analyseres parallelt med de glycopeptider, kan nøjagtigheden af kvantificering forbedres betydeligt, da vi påvist i en nylig publikation 18.
Glycopeptid fange selv effektivt kan reducere prøve kompleksitet, og det er generelt ikke nødvendigt at fraktionere beriget N-glycopeptider. Undtagelser gælder for situationer, hvor prøverne er rigelige, men med betydelige koncentration dynamik, og proteinerne af interesse er i lav tæthed, såsom i opdagelsen af blod protein biomarkører ellerfor en komplet undersøgelse af celleoverfladeproteiner. Under disse omstændigheder yderligere fraktionering kan gennemføres for de indfangede N-glycopeptider til at give en bedre penetration af glycoproteome. Da bunden af glycoproteome bliver kontaktet via fraktionering vil identificere ikke-glycopeptider indført ved specifik binding stige. Således vil en formindskelse af glycopeptid og glycoprotein selektivitet (til ~ 85%) vil typisk blive observeret efter en yderligere fraktionering af N-glycopeptider 17. Derfor er forskerne nødt til at afveje fordele og ulemper ved udformningen den bedst egnede procedure.
For forskere, der aldrig har brugt en N-glycopeptid-capture-metoden, er det bedst at praktisere metoden med et par rent N-glycoprotein (r) efter at have kendt glykosyleringssites som anført tidligere 8. Denne metode er robust og selektiviteten til N-glycopeptider er høj. En ulempe ved denne fremgangsmåde ligger i den iboende lav overflod af suransigt N-glycoproteiner; for en omfattende karakterisering af prøven, er større mængde normalt kræves end cytosole proteomics. Men hvis dyrkede celler kan udvides in vitro eller væv af interesse er rigelige, denne ulempe er ubetydelig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Denne forskning er blevet støttet af opstart fond af Simon Fraser University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DTT | Sigma | 646563 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Iodoacetamide | Sigma | A3221 | |
| Rapigest SF | Waters | 186001860 | |
| Sodium periodate | Sigma | 311448 | |
| PNGase F | New England Biolabs | P0704S | |
| Affi-Gel Hz hydrazide gel | Bio-Rad | 153-6047 | |
| Trypsin | Worthington Biomedical | LS02115 | |
| Sep-Pak C-18 cartridge | Waters | WAT054955 | |
| Oasis MCX cartridge | Waters | 186000252 | |
| Protease inhibitor coctail | Sigma | P8340 | |
| Urea | Amersco | 568 | |
| Sodium sulphite | Caledon | 8360-1 | |
| Invertase | Sigma | I0408 | |
| α-1 trypsin | Sigma | F2006 | |
| Ribonulease B | Sigma | R7884 | |
| Avidin | Sigma | A9275 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503 | |
| Conalbumin | Sigma | C0755 |
References
- Cho, W., Stahelin, R. V. Membrane-protein interactions in cell signaling and membrane trafficking. Annual review of biophysics and biomolecular structure. 34, 119-151 (2005).
- Tadevosyan, A., Vaniotis, G., Allen, B. G., Hebert, T. E., Nattel, S. G. protein-coupled receptor signalling in the cardiac nuclear membrane: evidence and possible roles in physiological and pathophysiological function. The Journal of physiology. 590, 1313-1330 (2012).
- White, S. H. Biophysical dissection of membrane proteins. Nature. 459, 344-346 (2009).
- Heijne, G. Membrane-protein topology. Nature reviews Molecular cell biology. 7, 909-918 (2006).
- Cox, J., Mann, M. Quantitative high-resolution proteomics for data-driven systems biology. Annual review of biochemistry. 80, 273-299 (2011).
- Lamond, A. I., et al. Advancing cell biology through proteomics in space and time (PROSPECTS). Mol Cell Proteomics. 11, (2012).
- Savas, J. N., Stein, B. D., Wu, C. C., Yates 3rd, J. R. Mass spectrometry accelerates membrane protein analysis. Trends in biochemical sciences. 36, 388-396 (2011).
- Sun, B., et al. Shotgun glycopeptide capture approach coupled with mass spectrometry for comprehensive glycoproteomics. Mol Cell Proteomics. 6, 141-149 (2007).
- Lowe, J. B. Glycosylation, immunity, and autoimmunity. Cell. 104, 809-812 (2001).
- Dodds, E. D. Gas-phase dissociation of glycosylated peptide ions. Mass spectrometry reviews. 31, 666-682 (2012).
- Kaji, H., et al. Lectin affinity capture, isotope-coded tagging and mass spectrometry to identify N-linked glycoproteins. Nat Biotechnol. 21, 667-672 (2003).
- Zhang, H., Li, X. J., Martin, D. B., Aebersold, R. Identification and quantification of N-linked glycoproteins using hydrazide chemistry, stable isotope labeling and mass spectrometry. Nat Biotechnol. 21, 660-666 (2003).
- Hagglund, P., Bunkenborg, J., Elortza, F., Jensen, O. N., Roepstorff, P. A new strategy for identification of N-glycosylated proteins and unambiguous assignment of their glycosylation sites using HILIC enrichment and partial deglycosylation. J Proteome Res. 3, 556-566 (2004).
- Bond, M. R., Kohler, J. J. Chemical methods for glycoprotein discovery. Current opinion in chemical biology. 11, 52-58 (2007).
- Pasini, E. M., et al. In-depth analysis of the membrane and cytosolic proteome of red blood cells. Blood. 108, 791-801 (2006).
- Wollscheid, B., et al. Mass-spectrometric identification and relative quantification of N-linked cell surface glycoproteins. Nat Biotechnol. 27, 378-386 (2009).
- Sun, B., et al. N-Glycoproteome of E14.Tg2a mouse embryonic stem cells. PLoS ONE. 8, (2013).
- Sun, B., et al. Glycocapture-assisted global quantitative proteomics (gagQP) reveals multiorgan responses in serum toxicoproteome. J Proteome Res. 12, 2034-2044 (2013).
