Summary
les protéines de surface cellulaire sont biologiquement importantes et largement glycosylée. Nous présentons ici une approche glycopeptides capture pour solubiliser, enrichir et deglycosylate ces protéines pour les analyses protéomiques faciles à base LC-MS.
Abstract
les protéines de surface cellulaire, y compris les protéines de la matrice extracellulaire, de participer à tous les processus et les fonctions cellulaires importantes, telles que la croissance, la différenciation et la prolifération. Une caractérisation complète de ces protéines fournit de l'information riche pour la découverte de biomarqueurs, l'identification du type de cellule, et la sélection cible thérapeutique, ainsi que d'aider à faire progresser notre compréhension de la biologie cellulaire et physiologie. protéines de surface, toutefois, posent des défis analytiques importantes, en raison de leur nature faible abondance, hydrophobie élevée, et des modifications post-traductionnelles lourds. Profitant de la glycosylation répandue sur les protéines de surface, nous présentons ici une approche glycopeptides capture à haut débit qui intègre les avantages de plusieurs moyens N-glycoprotéomique existants. Notre méthode peut enrichir les glycopeptides dérivés des protéines de surface et de retirer leurs glycanes pour la protéomique faciles à l'aide de LC-MS. La N-glycoproteome résolu comprend l'information de l'identité de la protéine et la quantité ainsi que de leurs sites de glycosylation. Cette méthode a été appliquée à une série d'études dans des domaines tels que le cancer, les cellules souches, et la toxicité des médicaments. La limitation de la méthode réside dans la faible abondance des protéines membranaires de surface, de telle sorte qu'une quantité relativement importante d'échantillons est nécessaire pour cette analyse par rapport à des études ont porté sur des protéines cytosoliques.
Introduction
les protéines de surface cellulaire interagissent avec l'environnement extracellulaire et transmettent des signaux à partir de l'extérieur vers l'intérieur d'une cellule. Ainsi, ces protéines, comprenant des protéines de la matrice extracellulaire, jouent un rôle essentiel dans tous les aspects de la biologie cellulaire et la physiologie allant de la prolifération, la croissance, la migration, la différenciation au vieillissement et ainsi de suite. les protéines de surface fonctionnent en interaction avec d'autres cellules, des protéines et des petites molécules 3.1. La caractérisation moléculaire des protéines de surface cellulaire est d'un grand intérêt non seulement pour les biologistes, mais aussi pour les sociétés pharmaceutiques, comme plus de 60% des médicaments sont destinées aux protéines de surface cellulaire 4.
Spectrométrie de masse en tandem (MS), avec sa sensibilité supérieure, la précision et débit pour l'identification des protéines et des peptides, a été un outil puissant pour les études protéomiques mondiaux 5,6. Pourtant, les protéines de surface posent des défis importants à la protéomique MS, commela plupart des protéines de surface existent en faibles quantités et avec des modifications lourdes. Les régions transmembranaires des protéines de surface rendent hydrophobe; ce qui est particulièrement le cas pour les protéines transmembranaires multipass. Il est donc difficile de dissoudre les protéines membranaires dans des solutions aqueuses, sans l'aide d'un détergent; toutefois, l'utilisation de détergents supprime généralement la performance de HPLC et MS 1,7,8 dans l'identification des protéines. Par conséquent, les protéines membranaires ont été mal caractérisé en protéomique basées directs LC-MS.
La glycosylation est l'une des modifications post-traductionnelles plus importantes et abondantes qui ont lieu dans les protéines de surface cellulaire 9. L'énorme complexité et l'hétérogénéité des glycanes entravent MS signal de peptides 10. Néanmoins, plusieurs procédés protéomiques ont utilisé cette modification unique pour enrichir les protéines de surface et d'éliminer les fragments de sucre à partir de protéines avant l'analyse LC-MS. Ces procédés comprennent basé lectine capture par affinité 11 et à base d'acide capture chimique ou borique base hydrazide-12 ainsi que des séparations chromatographiques hydrophiles 8,13. La suppression des glycanes transforme les protéines membranaires des protéines réguliers et radicalement simplifie la caractérisation MS. Parce que la glycosylation a également lieu dans les protéines sécrétées qui ont une forte solubilité contrairement aux protéines membranaires, de nombreuses méthodes glycoproteomic sont optimisés pour les protéines solubles, et ont tendance à avoir plus faible sélectivité des glycopeptides et sensibilité lorsqu'il est déployé aux protéines membranaires 8,14. D'autres procédés existent également à enrichir, en particulier, des protéines de surface cellulaire, tels que ceux utilisant une ultracentrifugation 15 et stratégies de marquage 16. Une comparaison détaillée entre notre méthode et d'autres méthodes existantes pour caractériser les protéines membranaires a été menée récemment 17, et les résultats ont indiqué que notre méthode peut effectuer aussi bien, si pasmieux, que toutes les méthodes de protéomique de la membrane par rapport, mais avec simplicité supérieur.
Pour aider les chercheurs utilisent cette méthode, nous détaillons ici un protocole général. Cette méthode intègre plusieurs avantages de stratégies de glycoprotéomique existantes et est conçu spécifiquement pour les glycoprotéines membranaires, encore la méthode fonctionne aussi bien pour des protéines sécrétées. Les caractéristiques de ce procédé comprennent: 1) une solubilisation complète de protéines membranaires, 2) l'enrichissement du glycopeptides au lieu de glycoprotéines pour éliminer l'encombrement stérique potentiel lors de l'utilisation d'un substrat solide de capture, 3) l'utilisation de la chimie de l'hydrazide pour former des liaisons covalentes entre glycopeptides et le substrat de capture, telles que des glycopeptides liés peuvent tolérer des lavages strictes pour haute glycoselectivity, et 4) la capacité d'effectuer la procédure de capture dans l'ensemble de tube pour une perte réduite de l'échantillon et de la durée de la procédure raccourcie. Après l'application de cette méthode à l'étude d'une variableciété d'échantillons biologiques, y compris les cellules et les tissus, nous avons observé une sélectivité élevée (> 90%) à des glycoprotéines 8,17,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Récolte membranes
- Ajouter un tampon hypotonique (10 mM Tris-HCl, 10 mM de KCl, 1,5 mM MgCl 2, pH 8,0) avec un cocktail inhibiteur de protease sur un culot de cellules (~ 10 8 cellules) et incuber pendant 15 à 30 min sur de la glace. Lyse des cellules par l'échantillon au travers des aiguilles de seringues (5-10 passes) ou l'homogénéisation de l'échantillon par un homogénéisateur Dounce (15-30 coups). Utilisez un hématimètre et coloration au bleu trypan pour vérifier l'efficacité de la lyse.
- Obtenir la fraction microsomale par une centrifugation différentielle du lysat à 3000 gx 15 min puis à 100 000 gx 2 h. La première centrifugation obtient un culot qui est la fraction nucléaire, et la centrifugation subséquente du surnageant génère une deuxième pastille, qui est la fraction microsomale qui contient la membrane plasmique ainsi que des organelles liées à la membrane 8. Le surnageant final est la fraction cytosolique. Stocker les fractions microsomales dans le congélateur à -80 ° C pour de plus amples analysest comme indiqué ci-dessous.
2. Dissoudre, Dénaturer, et Digest protéines membranaires
- Dissoudre la fraction microsomale dans le tampon de dénaturation (Tris 40 mM, EDTA 10 mM, TCEP 10 mM, 0,5% Rapigest, pH 8) et ensuite incuber la solution à 100 ° C pendant 10 min.
- On refroidit la solution chauffée à température ambiante, ajouter à ultra-haute pureté de l'urée en poudre dans la solution à une concentration finale de 8 M et incuber l'échantillon à 37 ° C pendant 30 min.
- Ajouter la solution mère de l'iodoacétamide à l'échantillon à 15 mM de concentration finale, et incuber la solution à l'obscurité pendant 30 min à température ambiante pour alkyler les thiols libres dans l'échantillon. Ajouter du DTT solution mère de l'échantillon à une concentration finale de 10 mM et incuber la solution pendant encore 10 min à température ambiante pour étancher l'iodoacétamide excessive.
- Diluer la solution obtenue de 10x avec un tampon Tris 40 mM à pH 8, et à la suite de la trypsine à l'échantillon dans un rapport de 01:20 trypsin de la protéine totale. Maintenir la réaction de digestion à 37 ° C un four pendant une nuit pour s'assurer que la réaction est terminée.
- Mettre fin à la digestion par l'acidification de la solution d'échantillon à pH 1 avec HCl, une condition qui décompose également le détergent, à savoir Rapigest. Dégrader la Rapigest à 37 ° C pendant 1 heure, et enlever la précipitation développé par centrifugation.
- Nettoyer le surnageant qui contient les peptides échantillon par une cartouche C-18 d'extraction en phase solide (SPE) et sécher l'échantillon obtenu par speedvac.
- Effectuer une analyse SDS-PAGE des échantillons avant et après digestion à la trypsine afin de confirmer l'efficacité de la digestion.
3. Glycopeptides capture
- Dissoudre les peptides nettoyés dans le tampon de couplage (acétate de sodium 100 mM, pH 5,5). Ajouter le periodate de sodium dans la solution de peptide à une concentration finale de 10 mM pendant 30 min à l'obscurité, à température ambiante. Cela permettra d'oxyder les groupes cis-diol dans les glycanes en aldéhydes, Qui permettent de coupler les glycanes de la résine à travers la chimie hydrazide. Étancher le periodate excessive par le sulfite de sodium à une concentration finale de 20 mM et à pH 5 pendant 10 min à température ambiante.
- Introduire la résine transformée en dérivé hydrazide dans la solution de peptide à un rapport de 1:4 (solution de résine) pour coupler des glycopeptides à la résine. Incuber la réaction à 37 ° C pendant 1 à 2 jours avec la rotation de bout en bout pour le couplage complet.
- Éliminer les peptides non liés par lavage de la résine à deux reprises avec 1 ml de chacun des éléments suivants: l'eau DI, 1,5 M de NaCl, de méthanol et 80% d'acétonitrile. Enfin, le lavage de la résine avec 3 x 1 ml de 100 mM de NH 4 HCO 3 à pH 8 pour échanger le tampon du système à 100 mM de NH 4 HCO 3.
- Recueillir le surnageant et les lavages à l'analyse des peptides non liés (en option).
- Libérer les N-glycopeptides à partir de la résine par la PNGase F à une incubation pendant une nuit à 37 ° C avec unn bout-à-bout rotation. Recueillir les peptides libérés par centrifugation et un lavage à l'acétonitrile 80%. Sécher la solution obtenue dans l'speedvac pour l'analyse LC-MS.
4. Fractionnement supplémentaire (en option)
Pour simplifier encore plus la complexité de l'échantillon, fractionner les N-glycopeptides obtenus. Par exemple, les peptides séchés redissoudre dans 10 mM de formiate de l'ammoniac, un pH de 3 avec 20% d'acétonitrile et en utilisant une forte échangeuse de cations (SCX) de chromatographie pour fractionner les peptides. Sécher l'éluant obtenu, puis analyser les fractions peptidiques obtenues par phase inverse LC-MS 8,17,18.
5. Nettoyage des N-glycopeptides libérés (Facultatif)
Si les préoccupations augmentent pour la contamination potentielle des peptides, dissoudre les peptides secs dans de l'acide formique à 0,1% et d'utiliser une colonne MCX SPE pour nettoyer en outre les peptides avant l'analyse de phase inverse LC-MS.
Lors de la coupure sélective de N-glycopeptides au large de la résine, PNGase F convertit l'asparagine N-glycane lié à un acide aspartique. Par conséquent, il existe un décalage 0,9840 Da masse des N-glycopeptides libérées. Pour identifier avec précision ces peptides, cette modification doit être ajouté à des paramètres de recherche ainsi que des modifications communes telles que la carbamidomethylation de la cystéine et de l'oxydation de la méthionine.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Un organigramme représentant la procédure expérimentale est résumée sur la figure 1. L'étiquetage et d'autres étapes de fractionnement sont facultatifs et les détails sont décrits dans une publication récente 18. Une autre option est d'analyser les peptides non modifiés, qui ne réagissent pas avec la résine. Les avantages de l'analyse des peptides non modifiés comprennent l'identification potentielle des peptides et des protéines non glycosylées, telles que les jonctions serrées dans claudines; Un avantage supplémentaire est la quantification plus précise. Sur la base de ces avantages, nous avons appelé cette méthode g lycocapture-un ssisted-g lobes q roteomics p uantitative (gagQP), et l'analyse détaillée dans une des dernières publications 18.
Un spectre typique de glycopeptide pris après le procédé d'enrichissement est représenté sur la Figure 2. En glycopeptide obtenu, le N-glycane a été éliminé et le glycane-asparagine-joint (N) wcomme converti en un acide aspartique (D) par la PNGase F; par conséquent, le spectre peut être facilement recherché en utilisant n'importe quel moteur de recherche en protéomique des bases de données de séquences de protéines commun.
La méthode de capture peut être évaluée par des glycoprotéines disponibles dans le commerce des modèles préalablement à son application à des échantillons biologiques complexes et de grande valeur. Certaines glycoprotéines de modèle fréquemment utilisés comprennent l'avidine (poulet), l'ovalbumine (poulet), invertase (levure), α-1 antitrypsine (humaine), conalbumine (poulet), et la ribonucléase B (bovine) (tous peuvent être obtenus auprès de Sigma). Les glycopeptides souvent identifiés à partir de ces protéines peuvent être trouvés dans une publication précédente 8. Une base de données FASTA séquence protéique personnalisée qui est approprié pour la recherche automatique des résultats LC-MS générés à partir de ces protéines modèles peut être téléchargé à partir du lien suivant (http://www.sfu.ca/chemistry/groups/bingyun_sun/tools.html ), qui comprend les protéines modèles énumérés ci-dessus ainsi que d'un rev ersed base de données levure-séquence, les contaminants communs et PNGase F.
Un résultat typique LC-MS des N-glycopeptides capturées est représenté sur la figure 3, dans laquelle plus de 100 glycoprotéines peuvent être identifiés à partir d'un seul passage d'une fraction microsomale de cellules LC-MS. La sélectivité de l'enrichissement deux glycoprotéines et des glycopeptides est généralement supérieure à 90%. Une analyse satisfaisante peut avoir une sélectivité de l'enrichissement de 95%. L'utilisation d'une colonne SCX et le gradient de l'étape de fractionner en outre les échantillons avant l'analyse LC-MS sera généralement le double du nombre d'identifications de la glycoprotéine 17. Parfois, lorsque la quantité des glycopeptides obtenus est faible, l'impureté accumulée à partir des fioles peut être observée dans l'échantillon final. Ces contaminants peuvent être éliminés par le procédé fourni dans l'étape 5.
. Jpg "src =" / files/ftp_upload/51349/51349fig1.jpg "width =" 350 "/>
Étapes et diamants Figure 1. Diagramme de la procédure expérimentale. Rectangles sont tenus sont des étapes facultatives.
Figure 2. Dissociation induite par collision (CID) spectre de AEPIL N ISNAGPWSR de la levure de boulanger après la méthode glycopeptide-capture. L'asparagine soulignée (N) est converti en l'acide aspartique (D) comme mis en évidence en rouge dans la séquence peptidique de la figure .
Tracé de la suite de la N-gl LC-MS Figure 3. 2Dycopeptides obtenus à partir de cellules souches embryonnaires de souris (E14.Tg2a). Les points sont les peptides détectés, et la couleur du point représente la confiance d'identification obtenues statistiquement (c'est à dire un peptide de probabilité).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ici, nous introduisons une stratégie glycopeptides capture pour le profilage des protéines de surface cellulaire. Le procédé peut être appliqué pour étudier les protéines sécrétées, tels que ceux dans le sang, ainsi que dans d'autres liquides corporels ou dans des milieux de culture cellulaire.
Le succès de la méthode repose sur la digestion complète d'échantillons; Par conséquent, une SDS-PAGE, la caractérisation de l'efficacité de la digestion est nécessaire, en particulier pour l'analyse du premier temps d'un échantillon. Une digestion complète peut être difficile pour les protéines de la membrane, et ne peut être possible, après solubilisation complète de la fraction membranaire. Le procédé de solubilisation commence quand le détergent est introduit et se termine après l'incubation de l'urée. Par conséquent, si la nébulosité présente dans l'échantillon avant l'addition de l'urée, mais disparaît après incubation de l'urée, la solubilisation est suffisante. Si la fraction de membrane est difficile à dissoudre, d'augmenter la quantité de détergent utilisée. Pour les échantillons de tissus membranaires richestels que les tissus du cerveau et le tissu adipeux, 5% Rapigest peut être utilisée. Parfois, les précipitations peuvent apparaître lors de la dilution des échantillons avant la digestion de la trypsine, qui est plus fréquemment observée pour les échantillons de sérum humain. La cause de cette précipitation est principalement les concentrations diminuées d'urée et de détergent. Cette précipitation sera généralement éliminé par la trypsine pendant la digestion et n'est pas une préoccupation. Cependant, lorsque les formes de précipitations, il est important de faire tourner le flacon d'échantillon au cours de l'étape de digestion pour assurer un bon mélange. Le pH de l'étape de glycocapture est important parce que les amines primaires de peptides, tels que ceux de la N-terminales et lysines, vont réagir avec les aldéhydes nouvellement formées après l'oxydation au periodate. Ainsi, il est important de protoner ces amines en ajustant le pH de la solution de capture de moins de 6,0 en utilisant un tampon acétate, pour les empêcher d'interférer avec la capture.
L'utilisation d'un rapport de la résine pour capturer une solutionrond 01 heures 03-01:04 assure un mélange suffisant au cours de l'étape de capture. Un minimum de 50 pi de résine est nécessaire sur la base de notre expérience; des quantités plus faibles vont rendre la série subséquente de lavages difficiles à réaliser et vont introduire une perte importante de l'échantillon due à la perte de résine. Nous avons obtenu de bons résultats en utilisant 100 à 300 ul de résine de 0,5 à 2 mg de protéine totale. Toutefois, le rapport entre la quantité de protéines et de résine peut être dépendante échantillon, nous vous recommandons d'optimiser cette condition pour vos échantillons et des applications spécifiques.
La chimie de l'hydrazide saisit les deux joints et les glycopeptides liés à N sur le substrat; en raison de l'absence d'une enzyme efficace pour libérer tous les glycopeptides O-liés, nous n'avons utilisé PNGase F pour les études N-glycopeptides 8,12. La possibilité d'étudier le type O de glycopeptides peut exiger la découverte ou la bio-ingénierie des hydrolases appropriées.
Cette méthode peut être interrompue à plusieurs placets, notamment: 1) après l'obtention de la fraction membranaire, 2) après la digestion et le nettoyage des peptides, et 3) après la libération de N-glycopeptides trypsine. Des procédures supplémentaires peuvent être introduits au cours de ces intervalles. Par exemple, les peptides digérés peuvent être marqués de façon différentielle par les N-isotags comme indiqué sur la figure 1, pour l'analyse quantitative. En utilisant une méthode appelée gagQP, dans lequel les peptides non modifiés sont analysés en parallèle avec les glycopeptides, la précision de la quantification peut être sensiblement améliorée comme nous l'avons démontré dans une publication récente 18.
Glycopeptide capture lui-même peut efficacement diminuer la complexité de l'échantillon, et il n'est généralement pas nécessaire de fractionner en outre les N-glycopeptides enrichies. Des exceptions s'appliquent à des situations où les échantillons sont abondants mais avec une dynamique de concentration importantes, et les protéines d'intérêt sont peu abondants, comme dans la découverte de biomarqueurs de protéines dans le sang oupour une revue complète des protéines de la surface cellulaire. Dans ces circonstances, un fractionnement supplémentaire peut être mis en œuvre pour les N-glycopeptides capturés pour fournir une meilleure pénétration de la glycoproteome. Comme le fond de la glycoproteome est approchée par fractionnement, l'identification de non-glycopeptides introduites par la liaison non spécifique augmente. Ainsi, une diminution de glycopeptides et la sélectivité de la glycoprotéine (à ~ 85%) seront généralement observés après un fractionnement supplémentaire de N-glycopeptides 17. Par conséquent, les chercheurs doivent peser les avantages et les inconvénients lors de la conception de la procédure la plus appropriée.
Pour les chercheurs qui n'ont jamais utilisé une méthode de N-glycopeptides capture, il est préférable de pratiquer la méthode avec un N-glycoprotéine pur peu (s) ayant connu des sites de glycosylation comme indiqué précédemment 8. Cette méthode est robuste et la sélectivité en N-glycopeptides est élevée. Un inconvénient de ce procédé réside dans la faible abondance inhérente de survisage N-glycoprotéines; pour une caractérisation complète de l'échantillon, une quantité plus élevée est en général nécessaire que celle de la protéomique cytosoliques. Toutefois, si les cellules cultivées peuvent être développées in vitro ou les tissus d'intérêt sont abondantes, cet inconvénient est négligeable.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Cette recherche a été soutenue par le fonds de démarrage de l'Université Simon Fraser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DTT | Sigma | 646563 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Iodoacetamide | Sigma | A3221 | |
| Rapigest SF | Waters | 186001860 | |
| Sodium periodate | Sigma | 311448 | |
| PNGase F | New England Biolabs | P0704S | |
| Affi-Gel Hz hydrazide gel | Bio-Rad | 153-6047 | |
| Trypsin | Worthington Biomedical | LS02115 | |
| Sep-Pak C-18 cartridge | Waters | WAT054955 | |
| Oasis MCX cartridge | Waters | 186000252 | |
| Protease inhibitor coctail | Sigma | P8340 | |
| Urea | Amersco | 568 | |
| Sodium sulphite | Caledon | 8360-1 | |
| Invertase | Sigma | I0408 | |
| α-1 trypsin | Sigma | F2006 | |
| Ribonulease B | Sigma | R7884 | |
| Avidin | Sigma | A9275 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503 | |
| Conalbumin | Sigma | C0755 |
References
- Cho, W., Stahelin, R. V. Membrane-protein interactions in cell signaling and membrane trafficking. Annual review of biophysics and biomolecular structure. 34, 119-151 (2005).
- Tadevosyan, A., Vaniotis, G., Allen, B. G., Hebert, T. E., Nattel, S. G. protein-coupled receptor signalling in the cardiac nuclear membrane: evidence and possible roles in physiological and pathophysiological function. The Journal of physiology. 590, 1313-1330 (2012).
- White, S. H. Biophysical dissection of membrane proteins. Nature. 459, 344-346 (2009).
- Heijne, G. Membrane-protein topology. Nature reviews Molecular cell biology. 7, 909-918 (2006).
- Cox, J., Mann, M. Quantitative high-resolution proteomics for data-driven systems biology. Annual review of biochemistry. 80, 273-299 (2011).
- Lamond, A. I., et al. Advancing cell biology through proteomics in space and time (PROSPECTS). Mol Cell Proteomics. 11, (2012).
- Savas, J. N., Stein, B. D., Wu, C. C., Yates 3rd, J. R. Mass spectrometry accelerates membrane protein analysis. Trends in biochemical sciences. 36, 388-396 (2011).
- Sun, B., et al. Shotgun glycopeptide capture approach coupled with mass spectrometry for comprehensive glycoproteomics. Mol Cell Proteomics. 6, 141-149 (2007).
- Lowe, J. B. Glycosylation, immunity, and autoimmunity. Cell. 104, 809-812 (2001).
- Dodds, E. D. Gas-phase dissociation of glycosylated peptide ions. Mass spectrometry reviews. 31, 666-682 (2012).
- Kaji, H., et al. Lectin affinity capture, isotope-coded tagging and mass spectrometry to identify N-linked glycoproteins. Nat Biotechnol. 21, 667-672 (2003).
- Zhang, H., Li, X. J., Martin, D. B., Aebersold, R. Identification and quantification of N-linked glycoproteins using hydrazide chemistry, stable isotope labeling and mass spectrometry. Nat Biotechnol. 21, 660-666 (2003).
- Hagglund, P., Bunkenborg, J., Elortza, F., Jensen, O. N., Roepstorff, P. A new strategy for identification of N-glycosylated proteins and unambiguous assignment of their glycosylation sites using HILIC enrichment and partial deglycosylation. J Proteome Res. 3, 556-566 (2004).
- Bond, M. R., Kohler, J. J. Chemical methods for glycoprotein discovery. Current opinion in chemical biology. 11, 52-58 (2007).
- Pasini, E. M., et al. In-depth analysis of the membrane and cytosolic proteome of red blood cells. Blood. 108, 791-801 (2006).
- Wollscheid, B., et al. Mass-spectrometric identification and relative quantification of N-linked cell surface glycoproteins. Nat Biotechnol. 27, 378-386 (2009).
- Sun, B., et al. N-Glycoproteome of E14.Tg2a mouse embryonic stem cells. PLoS ONE. 8, (2013).
- Sun, B., et al. Glycocapture-assisted global quantitative proteomics (gagQP) reveals multiorgan responses in serum toxicoproteome. J Proteome Res. 12, 2034-2044 (2013).
