Summary
חלבונים בתא שטח הם חשובים מבחינה ביולוגית וglycosylated באופן נרחב. אנחנו מציגים כאן גישת glycopeptide ללכוד לsolubilize, להעשיר, וdeglycosylate חלבונים אלה לניתוחי proteomic מבוססים LC-MS קליל.
Abstract
חלבונים פני תא, כוללים חלבונים תאיים מטריקס, משתתפים בכל התהליכים העיקריים הסלולריים ופונקציות, כגון צמיחה, בידול, ושגשוגם. אפיון מקיף של חלבונים אלו מספק מידע עשיר לגילוי סמן ביולוגי, זיהוי סוג התא, ובחירת תרופות יעד, כמו גם לעזור לקדם את ההבנה של ביולוגיה ופיזיולוגיה סלולריות שלנו. חלבוני פני השטח, לעומת זאת, מציבים אתגרים משמעותיים אנליטיים, בגלל השפע שלהם מטבע הנמוך, גבוהה הידרופוביות, ולאחר translational שינויים כבדים. ניצול של glycosylation הנפוץ בחלבוני פני השטח, אנחנו מציגים כאן גישת glycopeptide ללכוד תפוקה גבוהה, המשלבת את היתרונות של כמה אמצעי N-glycoproteomics קיימים. השיטה שלנו יכולה להעשיר glycopeptides נגזר מחלבונים פני השטח ולהסיר glycans לפרוטאומיקה הקלילה באמצעות LC-MS. N-glycoproteome נפתר כולל information זהות חלבון וכמות כמו גם באתריהם של glycosylation. שיטה זו יושמה לסדרה של מחקרים בתחומים שונים, לרבות סרטן, תאי גזע, ורעילויות תרופה. המגבלה של השיטה טמונה בשפע הנמוך של חלבוני קרום פני השטח, כך שכמות גדולה יחסית של דגימות הנדרשות לניתוח זה בהשוואה למחקרים התמקדו בחלבוני cytosolic.
Introduction
חלבונים בתא שטח באינטראקציה עם הסביבה תאית ולהעביר אותות מבחוץ לחלק הפנימי של תא. לפיכך, חלבונים אלה, כוללים חלבוני מטריצת חוץ תאיים, ממלאים תפקידים קריטיים בכל ההיבטים של ביולוגיה ופיזיולוגיה, החל שגשוג, צמיחה, הגירה, בידול להזדקנות וכן הלאה סלולריות. חלבוני פני השטח לתפקד על ידי אינטראקציה עם תאים אחרים, חלבונים ומולקולות קטנות 1-3. אפיון מולקולרי של חלבונים על פני קרום התא הוא עניין רב לא רק לביולוגים, אלא גם לחברות תרופות, שכן יותר מ -60% מתרופות ממוקדים לחלבונים על פני קרום תא 4.
ספקטרומטריית טנדם מסה (MS), עם הרגישות שלה מעולה, דיוק, ותפוקה לזיהוי של חלבונים ופפטידים, כבר כלי רב עוצמה למחקרים proteomic הגלובליים 5,6. עם זאת, חלבוני פני השטח להוות אתגר משמעותי לפרוטאומיקה מבוססת MS, כפירוב חלבוני פני השטח קיימים בכמויות נמוכות ועם שינויים כבדים. האזורים פורש הקרום של חלבוני פני השטח לעבד אותם הידרופובי; זה נכון במיוחד במקרה של חלבונים הטרנסממברני multipass. זה קשה ובכך לפזר חלבוני קרום בתמיסות מימיות ללא העזרה של חומרי ניקוי; עם זאת השימוש בחומרי הניקוי, בדרך כלל מדכא את הביצועים של HPLC ו-MS 1,7,8 בזיהוי חלבון. לכן, חלבוני קרום היו מאופיינים בצורה גרועה בפרוטאומיקה מבוססת LC-MS הישירה.
Glycosylation הוא אחד לאחר translational השינויים החשובים והנפוצים ביותר המתרחשים בחלבונים על פני קרום תא 9. מורכבות ואת ההטרוגניות עצומות של glycans לעכב MS אות 'פפטידים 10. עם זאת, במספר שיטות proteomic השתמשו השינוי הזה ייחודי להעשרת חלבוני פני השטח ולהסיר את moieties הסוכר מחלבונים לפני ניתוח LC-MS. שיטה אלהים כולל לכידה מבוססת קטיני זיקת 11 ולכידה כימית המבוסס על חומצה בורית או מבוסס hydrazide 12 כמו גם פרידות כרומטוגרפיה הידרופילי 8,13. הסרת glycans הופכת חלבונים בממברנה לחלבונים רגילים ומפשטת באופן דרסטי את אפיון הטרשת הנפוצה. בגלל glycosylation גם מתרחש בחלבונים מופרשים שיש מסיסות גבוהה בניגוד לחלבוני קרום, שיטות רבות glycoproteomic מותאמות לחלבונים מסיסים, ונוטות להיות סלקטיביות glycopeptide נמוכה ורגישות כשנפרס קרום חלבונים 8,14. שיטות אחרות קיימות גם להעשיר, בפרט, חלבונים על פני קרום תא, כגון אלה באמצעות ultracentrifugation 15 ואסטרטגיות תיוג 16. השוואה מפורטת בין השיטה שלנו ושיטות קיימות אחרות לאפיון חלבוני קרום נערכה לאחרונה 17, והתוצאות הצביעו על כך שהשיטה שלנו יכולה לבצע באותה מידה, אם לא, אבל עם יותר טובים, יותר מכל שיטות פרוטאומיקה הקרום לעומת פשטות גבוהה יותר.
כדי לסייע לחוקרים להשתמש בשיטה זו, אנו נפרט כאן פרוטוקול כללי. שיטה זו משלבת מספר יתרונות של אסטרטגיות glycoproteomics קיימות והוא המציא במיוחד עבור גליקופרוטאינים קרום, אך השיטה עובדת פחות טובה לחלבונים מופרשים. המאפיינים של שיטה זו כוללים: 1) solubilization של חלבונים בממברנה מלא, 2) העשרת glycopeptides במקום גליקופרוטאינים לחסל את הפרעה סטרית הפוטנציאלית בעת שימוש במצע הלכידה מוצק, 3) השימוש בכימית hydrazide ליצירת קשרים קוולנטיים בין glycopeptides ומצע לכידה, כך שglycopeptides מלוכד יכול לסבול שוטף מחמיר לגבוה glycoselectivity, ו -4) את היכולת לנהל את ההליך כולו ללכוד בצינור אחד לאובדן מדגם מופחת ומשך הליך מקוצר. לאחר יישום שיטה זו ללימוד ואריאתי של דגימות ביולוגיות כוללים תאים ורקמות, ראה סלקטיביות גבוהה (> 90%) לגליקופרוטאינים 8,17,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ממברנות הקציר
- הוסף חוצץ hypotonic (10 מ"מ טריס-HCl, 10 מ"מ KCl, 1.5 מ"מ MgCl 2, pH 8.0) עם מעכבי פרוטאז קוקטייל על תא גלולה (~ 10 8 תאים) ו דגירה של 15-30 דקות על קרח. Lyse התאים על ידי העברת הדגימה באמצעות מחטי מזרק (5-10 עובר) או שמאחד את המדגם על ידי homogenizer Dounce (15-30 שבץ). השתמש hemocytometer וכתמי כחולי trypan כדי לבדוק את היעילות של תמוגה.
- השג את שבריר microsomal ידי צנטריפוגה ההפרש של lysate ב3,000 דקות 15 GX ולאחר מכן ב100,000 GX 2 שעות. צנטריפוגה הראשונה משיגה גלולה שהוא שבריר הגרעיני, וצנטריפוגה הבאה של supernatant מייצרת גלולה שנייה, המהווה את חלק microsomal המכיל קרום הפלזמה, כמו גם האברונים קרום הנכנס 8. Supernatant הסופי הוא שבריר cytosolic. אחסן את השברים microsomal במקפיא -80 מעלות צלזיוס למשך analys נוסףהוא כמפורט להלן.
2. ממיסים, לפגל, וחלבונים בממברנה Digest
- ממיסים את חלקיק microsomal במאגר denaturation (40 מ"מ טריס, 10 mM EDTA, 10 מ"מ TCEP, 0.5% Rapigest, pH 8) ולאחר מכן דגירה הפתרון ב100 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
- לקרר את הפתרון המחומם לטמפרטורת חדר, להוסיף אבקת אוריאה גבוהה במיוחד טוהר לפתרון ל8 ריכוז סופי M ודגירה המדגם ב37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
- הוספת פתרון מניות iodoacetamide למדגם ל15 מ"מ ריכוז סופי, ודגירת הפתרון בחושך במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר לalkylate thiols בחינם במדגם. הוספת פתרון מניות DTT המדגם לריכוז סופי 10 מ"מ ודגירת הפתרון עוד 10 דקות בטמפרטורת חדר כדי להרוות את iodoacetamide המוגזמת.
- לדלל את 10x הפתרון שהושג עם 40 חיץ מ"מ טריס ב-pH 8, ולאחר מכן להוסיף טריפסין לדוגמא ביחס 1:20 של trypsin לחלבון בסך הכל. שמור את תגובת מערכת העיכול בלילה בתנור 37 ° C כדי להבטיח התגובה הושלמה.
- לסיים את מערכת העיכול על ידי acidifying פתרון המדגם ל-pH 1 עם HCl, מצב זה גם מפרק את חומרי הניקוי, כלומר Rapigest. לבזות את Rapigest ב-C ° 37 עבור שעה 1, ולהסיר את המשקעים שפותחו על ידי צנטריפוגה.
- נקה את supernatant המכיל פפטידים מדגם על ידי מחסנית C-18 מיצוי שלב מוצק (SPE) ולייבש את הדגימה המתקבלת על ידי speedvac.
- לבצע ניתוח SDS-PAGE של דגימות לפני ואחרי טריפסין עיכול כדי לאשר את יעילות העיכול.
3. לכידת glycopeptide
- ממיסים את פפטידים ניקו בחיץ הצימוד (אצטט 100 מ"מ נתרן, pH 5.5). הוספת periodate נתרן לתוך תמיסת פפטיד בריכוז 10 מ"מ סופי ל30 דקות בחושך, בטמפרטורת חדר. זה יהיה לחמצן קבוצות cis-דיאול בglycans לאלדהידים, המאפשרת glycans לבני זוג השרף דרך הכימיה hydrazide. להרוות את periodate המופרז על ידי סולפיט נתרן בריכוז 20 מ"מ סופי וה-pH 5 ל10 דקות בטמפרטורת חדר.
- להציג את שרף derivatized hydrazide לתוך תמיסת פפטיד ביחס של 1:4 (שרף לפתרון) לזוג glycopeptides לשרף. דגירה התגובה על 37 מעלות צלזיוס למשך 1-2 ימים עם סיבוב מקצה לקצה עבור צימוד שלם.
- הסר את פפטידים מאוגדים על ידי שטיפת השרף פעמיים עם 1 מיליליטר של כל אחד מאלה: המים DI, 1.5 M NaCl, מתנול ואצטוניטריל 80%. לבסוף, לשטוף 3x השרף עם 1 מיליליטר של 100 מ"מ NH 4 HCO 3 ב-pH 8 להחליף את החיץ של המערכת ל100 מ"מ NH 4 HCO 3.
- לאסוף את supernatant והשוטף לניתוח של פפטידים מאוגדים (אופציונליים).
- שחרר את N-glycopeptides מהשרף על ידי PNGase F בדגירת לילה בשעה 37 ° C עםn מקצה לקצה רוטציה. לאסוף את הפפטידים שפורסמו על ידי צנטריפוגה ולשטוף אצטוניטריל 80%. ייבש את הפתרון שהתקבל בspeedvac לניתוח LC-MS.
4. היפוך חלוק נוסף (אופציונאלי)
כדי לפשט את מורכבות מדגם נוסף, fractionate N-glycopeptides מתקבל. לדוגמא, redissolve פפטידים המיובשים לתוך formate האמוניה 10 מ"מ, pH 3 עם אצטוניטריל 20% ולהשתמש בתמורת קטיון חזקה כרומטוגרפיה (SCX) לfractionate פפטידים. ייבש את eluent שהושג, ולאחר מכן לנתח את שברי פפטיד מתקבלים על ידי הפוך השלב LC-MS 8,17,18.
5. ניקוי של N-glycopeptides פורסם (אופציונלית)
אם חששות לעלות לזיהום הפוטנציאלי של פפטידים, redissolve פפטידים המיובשים לתוך 0.1% חומצה פורמית ולהשתמש בעמודת MCX SPE לנקות עוד יותר את פפטידים לפני ניתוח LC-MS להפוך שלב.
במהלך המחשוף סלקטיבית של N-glycopeptides את השרף, PNGase F ממיר asparagine מקושר N-סוכרים לחומצה אספרטית. לכן, יש שינוי מסת דה 0.9840 של N-glycopeptides המשוחרר. כדי לזהות במדויק את הפפטידים האלה, שינוי זה צריך להוסיף לפרמטרי החיפוש יחד עם שינויים נפוצים כגון carbamidomethylation של ציסטאין והחמצון של מתיונין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תרשים זרימת נציג של הליך הניסוי מסוכם באיור 1. התיוג וצעדי חלוקה נוספים הם אופציונליים ופרטים מתוארים בפרסום האחרון 18. אפשרות נוספת היא לנתח את פפטידים ללא שינוי, שאינו מגיבים עם השרף. היתרונות של ניתוח פפטידים ללא שינוי כוללים את זיהוי הפוטנציאל של פפטידים שאינם מסוכרים וחלבונים, כגון claudins בצומת הדוקים; יתרון נוסף הוא כימות מדויק יותר. בהתבסס על יתרונות אלה, אנו כינה זו גרם שיטת lycocapture-roteomics q lobal ssisted-g uantitative p (gagQP), ופרט את הניתוח בפרסומים אחרונים 18.
ספקטרום glycopeptide טיפוסי נלקח לאחר שיטת ההעשרה מוצג באיור 2. בglycopeptide הושג, N-הסוכרים הוסרו וasparagine מצורף הסוכרים (N) wכמומר לחומצה אספרטית (ד ') על ידי PNGase F; לכן, הספקטרום ניתן לחפש בקלות באמצעות כל מנוע חיפוש פרוטאומיקה מול מסדי נתונים רצף חלבון נפוץ.
שיטת הלכידה יכולה להיות מוערכת על ידי גליקופרוטאינים מודל זמינים מסחרי לקראת יישומה עם דגימות ביולוגיות מורכבות ויקרות. חלק גליקופרוטאינים מודל משמשים לעתים קרובות כוללים avidin (עוף), ovalbumin (עוף), invertase (שמרים), antitrypsin α-1 (אדם), conalbumin (עוף), וribonuclease ב '(שור) (כל ניתן להשיג מSigma). ניתן למצוא glycopeptides לעתים קרובות המזוהה מחלבונים האלה בפרסום קודם 8. מסד הנתונים FASTA חלבון רצף אישית כי הוא מתאים לחיפוש אוטומטי של תוצאות LC-MS שנוצרו מחלבונים דגם אלה ניתן להוריד מהקישור הבא (http://www.sfu.ca/chemistry/groups/bingyun_sun/tools.html ), הכולל את החלבונים מעליה רשומים המודל כמו גם rev מסד הנתונים שמרי רצף ersed, מזהמים נפוצים וPNGase פ
תוצאת LC-MS טיפוסית של N-glycopeptides נתפס מוצגת באיור 3, שבו ניתן לזהות יותר מ -100 גליקופרוטאינים מריצת LC-MS יחידה של שבריר microsomal תא. סלקטיביות ההעשרה לשני גליקופרוטאינים וglycopeptides היא בדרך כלל יותר מ 90%. ניתוח מוצלח יכול להיות סלקטיביות העשרת 95%. שימוש בעמודת SCX ושיפוע צעד לfractionate נוסף הדגימות לפני LC-MS מנתח בדרך כלל להכפיל את מספר הזדהויות גליקופרוטאין 17. לפעמים, כאשר כמות glycopeptides המתקבלת היא נמוכה, הטומאה שנצברה מהבקבוקונים ניתן לצפות במדגם הסופי. מזהמים אלה ניתן להסיר על ידי השיטה הניתנת בשלב 5.
. Jpg "src =" / files/ftp_upload/51349/51349fig1.jpg "width =" 350 "/>
צעדים ויהלומים איור 1. תרשים זרימה של ההליך ניסיוני. מלבנים נדרשים צעדים אופציונליים.
ניתוק איור 2. התנגשות מושרה ספקטרום (CID) של AEPIL N ISNAGPWSR מהשמרים של בייקר אחרי שיטת glycopeptide ללכוד. asparagine המודגש (N) מומר לחומצה אספרטית (ד ') כמסומן באדום ברצף פפטיד בדמות .
איור 3. עלילת 2D של תוצאת LC-MS של N-GLycopeptides המתקבל מתאי עכבר גזע עובריים (E14.Tg2a). הנקודות הן פפטידים זוהו, ואת הצבע של הנקודה מייצג את ביטחון זיהוי שהתקבל מבחינה סטטיסטית (כלומר הסתברות פפטיד).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן אנחנו מציגים אסטרטגית glycopeptide ללכוד לאפיון חלבונים על פני קרום תא. השיטה יכולה להיות מיושמת כדי ללמוד חלבונים מופרשים, כגון אלה בדם, כמו גם בנוזלי גוף אחרים או בתקשורת תרבות תא.
ההצלחה של השיטה מסתמכת על העיכול של דגימות המלאה; לכן, אפיון SDS-PAGE של יעילות העיכול הוא הכרחי, במיוחד עבור הניתוח של מדגם בפעם הראשונה. עיכול שלם יכול להיות מאתגר עבור חלבונים בממברנה, והוא יכול להיות אפשרי רק לאחר solubilization יסודי של כל החלק בממברנה. תהליך solubilization מתחיל כאשר חומר הניקוי הוא הציג ומסתיים לאחר הדגירה של אוריאה. לכן, אם עננות מציגה במדגם לפני התוספת של אוריאה אך נעלמה לאחר דגירה אוריאה, solubilization מספיק. אם שבריר הקרום קשה לפזר, להגדיל את כמות חומר הניקוי המשמשת. לדגימות רקמת קרום עשירכגון רקמות מוח ושומן, יכול להיות מנוצל Rapigest 5%. לפעמים, משקעים יכולים להופיע בדילול של דגימות שקדמו לעיכול טריפסין, אשר בתדירות גבוהה יותר נצפה עבור דגימות סרום אנושיות. הסיבה למשקעים זה בעיקר ריכוזי ירידה של אוריאה וחומרי ניקוי. משקעים זה יהיה בדרך כלל להיות הוסרו על ידי טריפסין במהלך העיכול ולא דאגה. עם זאת, כאשר צורות הממטרים, חשוב לסובב את בקבוקון המדגם במהלך שלב העיכול כדי להבטיח ערבוב טוב. ה-pH של צעד glycocapture חשוב כי האמינים הראשוניים בפפטידים, כגון אלה מN-Termini וlysines, יגיבו עם אלדהידים שהוקמו לאחר חמצון periodate. לכן, זה חשוב protonate אמינים אלה על ידי התאמה-pH של תמיסת לכידה אל מתחת 6.0 באמצעות חיץ אצטט, כדי למנוע מהם להפריע ללכידה.
באמצעות יחס של שרף כדי ללכוד פתרוןסיבוב 1:03-01:04 מבטיח ערבוב מספיק במהלך שלב הלכידה. מינימום של 50 μl של שרף הוא הכרחי על סמך הניסיון שלנו; כמויות נמוכות יותר תהפוכנה את הסדרה הבאה של שוטף קשה לביצוע ותצגנה הפסד מדגם קשה עקב האובדן של שרף. יש לנו להשיג תוצאות טובות באמצעות 100-300 μl של שרף ל0.5-2 מ"ג של חלבון בסך הכל. עם זאת, היחס בין כמות החלבון והשרף יכול להיות מדגם תלוי, אנו ממליצים לך לייעל את המצב הזה לדוגמאות הספציפיות שלך ויישומים.
הכימיה hydrazide לוכדת שני O-וglycopeptides N הצמוד על פני המצע; בשל המחסור באנזים יעיל לשחרר את כל glycopeptides צמוד O, אנחנו רק בשימוש PNGase F ללימודי N-glycopeptide 8,12. האפשרות ללמוד O-הסוג של glycopeptides עשויה לדרוש גילוי או bioengineering של hydrolases המתאים.
שיטה זו יכולה להיות מושהה בכמה pשרוכים ובם: 1) לאחר קבלת החלק בממברנה, 2) לאחר עיכול טריפסין וניקוי של פפטידים, ו3) לאחר שחרורו של N-glycopeptides. יכולים להיות הציגו נהלים נוספים במרווחים אלה. לדוגמא, פפטידים מתעכלים יכולים להיות מתויגים באופן דיפרנציאלי על ידי N-isotags כפי שמצוינים באיור 1, לניתוח כמוני. באמצעות שיטה הנקראת gagQP, שבו פפטידים ללא שינוי מנותחים במקביל לglycopeptides, דיוק quantitation ניתן לשפר באופן משמעותי כפי שהראינו בפרסום האחרון 18.
לכידת glycopeptide עצמו יכול למעשה להקטין את מורכבות מדגם, וזה בדרך כלל לא נחוץ כדי fractionate נוסף N-glycopeptides המועשר. חריגים למצבים שבם הדגימות נמצאות בשפע, אבל עם דינמיקת ריכוז משמעותית, והחלבונים של עניין נמצאים בשפע נמוך, כמו בגילוי של סמנים ביולוגיים חלבון דם אולסקירה של חלבונים בתא שטח מלא. בנסיבות אלה חלוקה נוספת יכולה להיות מיושמת עבור N-glycopeptides נתפס לספק חדירה טובה יותר של glycoproteome. כתחתית glycoproteome מתבצעת פנתה באמצעות חלוקה, זיהוי שאינו glycopeptides הוצג על ידי כריכה ספציפי יגדל. לכן ירידה של glycopeptide וסלקטיביות גליקופרוטאין (ל~ 85%) תהיו בדרך כלל נצפו לאחר חלוקה נוספת של N-glycopeptides 17. לכן, חוקרים צריכים לשקול את היתרונות וחסרונות בעת תכנון את ההליך המתאים ביותר.
לחוקרים שמעולם לא השתמשו בשיטת N-glycopeptide ללכוד, עדיף לתרגל את השיטה עם כמה N-גליקופרוטאין טהור (ים) שידוע באתרי glycosylation כמפורט לעיל 8. שיטה זו היא חזקה ואת הסלקטיביות לN-glycopeptides היא גבוהה. חסרון של שיטה זו טמונה בשפע הנמוך הגלום בsurפנים N-גליקופרוטאינים; לאפיון מקיף של המדגם, כמות גבוהה יותר בדרך כלל נדרשת יותר מזה של פרוטאומיקה cytosolic. עם זאת, אם ניתן להרחיב תאים בתרבית במבחנה או הרקמות של עניין נמצאים בשפע, החסרון הזה הוא זניח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי הקרן הזנק של אוניברסיטת סיימון פרייזר.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DTT | Sigma | 646563 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Iodoacetamide | Sigma | A3221 | |
| Rapigest SF | Waters | 186001860 | |
| Sodium periodate | Sigma | 311448 | |
| PNGase F | New England Biolabs | P0704S | |
| Affi-Gel Hz hydrazide gel | Bio-Rad | 153-6047 | |
| Trypsin | Worthington Biomedical | LS02115 | |
| Sep-Pak C-18 cartridge | Waters | WAT054955 | |
| Oasis MCX cartridge | Waters | 186000252 | |
| Protease inhibitor coctail | Sigma | P8340 | |
| Urea | Amersco | 568 | |
| Sodium sulphite | Caledon | 8360-1 | |
| Invertase | Sigma | I0408 | |
| α-1 trypsin | Sigma | F2006 | |
| Ribonulease B | Sigma | R7884 | |
| Avidin | Sigma | A9275 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503 | |
| Conalbumin | Sigma | C0755 |
References
- Cho, W., Stahelin, R. V. Membrane-protein interactions in cell signaling and membrane trafficking. Annual review of biophysics and biomolecular structure. 34, 119-151 (2005).
- Tadevosyan, A., Vaniotis, G., Allen, B. G., Hebert, T. E., Nattel, S. G. protein-coupled receptor signalling in the cardiac nuclear membrane: evidence and possible roles in physiological and pathophysiological function. The Journal of physiology. 590, 1313-1330 (2012).
- White, S. H. Biophysical dissection of membrane proteins. Nature. 459, 344-346 (2009).
- Heijne, G. Membrane-protein topology. Nature reviews Molecular cell biology. 7, 909-918 (2006).
- Cox, J., Mann, M. Quantitative high-resolution proteomics for data-driven systems biology. Annual review of biochemistry. 80, 273-299 (2011).
- Lamond, A. I., et al. Advancing cell biology through proteomics in space and time (PROSPECTS). Mol Cell Proteomics. 11, (2012).
- Savas, J. N., Stein, B. D., Wu, C. C., Yates 3rd, J. R. Mass spectrometry accelerates membrane protein analysis. Trends in biochemical sciences. 36, 388-396 (2011).
- Sun, B., et al. Shotgun glycopeptide capture approach coupled with mass spectrometry for comprehensive glycoproteomics. Mol Cell Proteomics. 6, 141-149 (2007).
- Lowe, J. B. Glycosylation, immunity, and autoimmunity. Cell. 104, 809-812 (2001).
- Dodds, E. D. Gas-phase dissociation of glycosylated peptide ions. Mass spectrometry reviews. 31, 666-682 (2012).
- Kaji, H., et al. Lectin affinity capture, isotope-coded tagging and mass spectrometry to identify N-linked glycoproteins. Nat Biotechnol. 21, 667-672 (2003).
- Zhang, H., Li, X. J., Martin, D. B., Aebersold, R. Identification and quantification of N-linked glycoproteins using hydrazide chemistry, stable isotope labeling and mass spectrometry. Nat Biotechnol. 21, 660-666 (2003).
- Hagglund, P., Bunkenborg, J., Elortza, F., Jensen, O. N., Roepstorff, P. A new strategy for identification of N-glycosylated proteins and unambiguous assignment of their glycosylation sites using HILIC enrichment and partial deglycosylation. J Proteome Res. 3, 556-566 (2004).
- Bond, M. R., Kohler, J. J. Chemical methods for glycoprotein discovery. Current opinion in chemical biology. 11, 52-58 (2007).
- Pasini, E. M., et al. In-depth analysis of the membrane and cytosolic proteome of red blood cells. Blood. 108, 791-801 (2006).
- Wollscheid, B., et al. Mass-spectrometric identification and relative quantification of N-linked cell surface glycoproteins. Nat Biotechnol. 27, 378-386 (2009).
- Sun, B., et al. N-Glycoproteome of E14.Tg2a mouse embryonic stem cells. PLoS ONE. 8, (2013).
- Sun, B., et al. Glycocapture-assisted global quantitative proteomics (gagQP) reveals multiorgan responses in serum toxicoproteome. J Proteome Res. 12, 2034-2044 (2013).
