Summary
कोशिका की सतह प्रोटीन जैविक रूप से महत्वपूर्ण और व्यापक रूप से ग्लाइकोसिलेटेड हैं. हम सतही नियंत्रण रेखा एमएस आधारित प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए इन प्रोटीनों, solubilize को समृद्ध, और deglycosylate को यहां एक glycopeptide कब्जा दृष्टिकोण का परिचय.
Abstract
बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन सहित कोशिका की सतह प्रोटीन,, इस तरह के विकास, भेदभाव, और प्रसार जैसे सभी प्रमुख सेलुलर प्रक्रियाओं और कार्यों, में भाग लेते हैं. इन प्रोटीनों की एक व्यापक लक्षण वर्णन biomarker खोज, सेल प्रकार की पहचान, और दवा लक्ष्य चयन है, साथ ही सेलुलर जीव विज्ञान और शरीर विज्ञान के बारे में हमारी समझ अग्रिम की मदद करने के लिए अमीर जानकारी प्रदान करता है. सतह प्रोटीन, तथापि, क्योंकि उनकी स्वाभाविक कम बहुतायत, उच्च hydrophobicity, और भारी बाद translational संशोधनों की महत्वपूर्ण विश्लेषणात्मक चुनौतियों मुद्रा. सतह प्रोटीन पर प्रचलित ग्लाइकोसिलेशन का लाभ उठाते हुए, हम यहाँ कई मौजूदा एन glycoproteomics साधन के फायदे को एकीकृत एक उच्च throughput glycopeptide कब्जा दृष्टिकोण का परिचय. हमारे विधि सतह प्रोटीन से व्युत्पन्न glycopeptides को समृद्ध और नियंत्रण रेखा एमएस का उपयोग सतही प्रोटिओमिक्स के लिए उनके ग्लाइकान निकाल सकते हैं. सुलझाया एन glycoproteome inf शामिलप्रोटीन की पहचान और मात्रा के साथ ही ग्लाइकोसिलेशन की अपनी साइटों के ormation. यह विधि कैंसर, स्टेम सेल, और दवा विषाक्तता सहित क्षेत्रों में अध्ययन की एक श्रृंखला के लिए लागू किया गया है. विधि की सीमा नमूनों की एक अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा साइटोसोलिक प्रोटीन पर केंद्रित अध्ययन की तुलना में इस विश्लेषण के लिए आवश्यक है कि इस तरह की सतह झिल्ली प्रोटीन की कम बहुतायत में है.
Introduction
कोशिका की सतह प्रोटीन बाह्य वातावरण के साथ बातचीत और एक सेल के अंदर करने के लिए बाहर से संकेत रिले. इस प्रकार, बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन सहित इन प्रोटीन, सेलुलर जीव विज्ञान और प्रसार, विकास, प्रवास, भेदभाव से बहुत आगे है उम्र बढ़ने और से लेकर शरीर क्रिया विज्ञान के सभी पहलुओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. सतह प्रोटीन अन्य कोशिकाओं, प्रोटीन और छोटे अणुओं 1-3 के साथ बातचीत से कार्य करते हैं. दवाओं के 60% से अधिक सेल सतह प्रोटीन 4 के लिए लक्षित कर रहे हैं के रूप में सेल सतह प्रोटीन की आणविक लक्षण वर्णन, जीव के लिए बल्कि दवा कंपनियों के लिए न केवल महान ब्याज की है.
इसके बेहतर संवेदनशीलता, सटीकता, और प्रोटीन और पेप्टाइड्स की पहचान के लिए throughput के साथ मिलकर जन स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस), वैश्विक प्रोटिओमिक पढ़ाई 5,6 के लिए एक शक्तिशाली उपकरण किया गया है. फिर भी, सतह प्रोटीन के रूप में, एमएस आधारित प्रोटिओमिक्स के लिए महत्वपूर्ण चुनौतियां खड़ीसबसे सतह प्रोटीन कम मात्रा में और भारी संशोधनों के साथ मौजूद हैं. सतह प्रोटीन की झिल्ली फैले क्षेत्रों उन्हें हाइड्रोफोबिक प्रस्तुत करना; यह विशेष रूप से multipass transmembrane प्रोटीन के लिए मामला है. यह एक साबुन की मदद के बिना जलीय समाधान में झिल्ली प्रोटीन भंग करने के लिए इस प्रकार कठिन है; हालांकि डिटर्जेंट का प्रयोग आम तौर पर प्रोटीन की पहचान में HPLC और एमएस 1,7,8 के प्रदर्शन को दबा. इसलिए, झिल्ली प्रोटीन खराब प्रत्यक्ष नियंत्रण रेखा एमएस आधारित प्रोटिओमिक्स में विशेषता किया गया है.
ग्लाइकोसिलेशन सेल सतह प्रोटीन 9 में जगह लेने के लिए सबसे महत्वपूर्ण और प्रचुर बाद translational संशोधनों में से एक है. ग्लाइकान की भारी जटिलता और विविधता पेप्टाइड्स 'एमएस संकेत 10 बाधा हैं. फिर भी, कई प्रोटिओमिक तरीकों सतह प्रोटीन को समृद्ध करने और पूर्व नियंत्रण रेखा एमएस विश्लेषण करने के लिए प्रोटीन से चीनी moieties निकालने के लिए यह अनूठा संशोधन का इस्तेमाल किया है. ये विधिएस लेक्टिन आधारित संबंध कब्जा 11 और hydrazide आधारित या बोरिक एसिड आधारित रासायनिक कब्जा 12 के साथ ही हाइड्रोफिलिक क्रोमैटोग्राफी विभाजन 8,13 शामिल हैं. ग्लाइकान को दूर करने के लिए नियमित रूप से प्रोटीन के लिए झिल्ली प्रोटीन बदल देती है और काफी एमएस लक्षण वर्णन सरल करता है. ग्लाइकोसिलेशन भी प्रोटीन झिल्ली के विपरीत उच्च विलेयता है कि secreted प्रोटीन में जगह लेता है, क्योंकि कई glycoproteomic तरीकों घुलनशील प्रोटीन के लिए अनुकूलित किया है, और कम glycopeptide चयनात्मकता और प्रोटीन 8,14 झिल्ली तैनात किया जा रहा है जब संवेदनशीलता हो जाते रहे हैं. अन्य तरीकों में भी समृद्ध करने के लिए मौजूद हैं, विशेष रूप से, इस तरह के ultracentrifugation 15 और लेबलिंग रणनीति 16 का उपयोग उन लोगों के रूप में सेल सतह प्रोटीन,. झिल्ली प्रोटीन निस्र्पक के लिए हमारे विधि और अन्य मौजूदा तरीकों के बीच एक विस्तृत तुलना हाल ही में 17 का आयोजन किया, और परिणाम हमारे विधि भी उतना ही अच्छा प्रदर्शन कर सकते हैं संकेत दिया है कि, अगर नहीं गया थासभी तुलना झिल्ली प्रोटिओमिक्स तरीकों की तुलना में, बेहतर है, लेकिन उच्च सादगी के साथ.
शोधकर्ताओं ने इस पद्धति का उपयोग करने में मदद करने के लिए, यहाँ हम विस्तार एक सामान्य प्रोटोकॉल. इस विधि मौजूदा glycoproteomics रणनीतियों के कई फायदे एकीकृत करता है और झिल्ली ग्लाइकोप्रोटीन के लिए विशेष रूप से तैयार कर लिया जाता है, अभी तक विधि secreted प्रोटीन के लिए समान रूप से अच्छी तरह से काम करता है. इस विधि की विशेषताओं में शामिल हैं: 1) झिल्ली प्रोटीन का एक पूरा solubilization, 2) के बजाय एक ठोस कब्जा सब्सट्रेट का उपयोग करते समय संभावित steric बाधा को खत्म करने ग्लाइकोप्रोटीन से glycopeptides का संवर्धन, 3) hydrazide रसायन विज्ञान का उपयोग सहसंयोजक बांड के बीच के लिए फार्म glycopeptides और कब्जा सब्सट्रेट, बंधुआ glycopeptides उच्च glycoselectivity के लिए कड़े washes बर्दाश्त कर सकते हैं, और 4) क्षमता कम नमूना नुकसान और छोटा प्रक्रिया की अवधि के लिए एक ट्यूब में पूरे कब्जा प्रक्रिया का संचालन करने के लिए कि इस तरह के. एक vari का अध्ययन करने के लिए इस विधि को लागू करने के बादकोशिकाओं और ऊतकों सहित जैविक नमूने का ety, हम ग्लाइकोप्रोटीन 8,17,18 के लिए एक उच्च चयनात्मकता (> 90%) मनाया.
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Protocol
1. हार्वेस्ट झिल्ली
- एक सेल गोली (~ 10 8 कोशिकाओं) पर protease अवरोध कॉकटेल के साथ hypotonic बफर (10 मिमी Tris-एचसीएल, 10 मिमी KCl, 1.5 मिमी 2 MgCl, 8.0 पीएच) जोड़ने और बर्फ पर 15-30 मिनट के लिए सेते हैं. Lyse सिरिंज सुई (5-10 गुजरता) के माध्यम से नमूना गुजर या एक Dounce homogenizer (15-30 स्ट्रोक) से नमूना homogenizing द्वारा कोशिकाओं. सेल की दक्षता की जांच के लिए एक hemocytometer और trypan नीले रंग धुंधला का प्रयोग करें.
- 3000 GX 15 मिनट पर lysate के एक अंतर है centrifugation द्वारा माइक्रोसोमल अंश प्राप्त करें और फिर से कम 100,000 GX 2 घंटा. पहले centrifugation परमाणु अंश है कि एक गोली प्राप्त है, और सतह पर तैरनेवाला के बाद centrifugation के प्लाज्मा झिल्ली के साथ ही झिल्ली ही सीमित organelles 8 होता है कि माइक्रोसोमल अंश है जो एक दूसरे गोली, उत्पन्न करता है. अंतिम सतह पर तैरनेवाला साइटोसोलिक अंश है. आगे analys के लिए -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में माइक्रोसोमल भिन्न स्टोरनीचे दिए गए संकेत के रूप में है.
2. भंग denature, और डाइजेस्ट झिल्ली प्रोटीन
- विकृतीकरण बफर (40 मिमी Tris, 10 मिमी EDTA, 10 मिमी TCEP, 0.5% Rapigest, पीएच 8) में माइक्रोसोमल अंश भंग करने और फिर 10 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर समाधान सेते हैं.
- कमरे के तापमान पर गरम समाधान शांत 8 एम अंतिम एकाग्रता के लिए समाधान में अति उच्च शुद्धता यूरिया पाउडर डालें और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूना सेते हैं.
- 15 मिमी अंतिम एकाग्रता के लिए नमूने के iodoacetamide शेयर समाधान जोड़ें, और नमूने में मुफ्त thiols केलेट के लिए कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए अंधेरे में समाधान सेते हैं. 10 मिमी अंतिम एकाग्रता के लिए नमूना डीटीटी शेयर समाधान जोड़ें और अत्यधिक iodoacetamide बुझाने के लिए कमरे के तापमान पर एक और 10 मिनट के लिए समाधान सेते हैं.
- पीएच 8 में 40 मिमी Tris बफर के साथ प्राप्त समाधान 10x पतला, और बाद में trypsi की एक 1:20 के अनुपात में नमूने के trypsin जोड़कुल प्रोटीन n करने के लिए. प्रतिक्रिया पूरा हो गया है यह सुनिश्चित करने के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस ओवन रात भर में पाचन प्रतिक्रिया बनाए रखें.
- यानी Rapigest एचसीएल, भी डिटर्जेंट टूट जाती है एक शर्त है कि, साथ पीएच 1 के लिए नमूना समाधान acidifying से पाचन बर्खास्त. 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर Rapigest नीचा, और centrifugation द्वारा विकसित की तेज़ी को हटा दें.
- एक सी -18 ठोस चरण निष्कर्षण (एसपीई) कारतूस से नमूना पेप्टाइड्स होता है और speedvac द्वारा प्राप्त नमूना सूखी है कि सतह पर तैरनेवाला साफ करें.
- पहले और पाचन दक्षता पुष्टि करने के लिए पाचन trypsin के बाद नमूनों की एक एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण करते हैं.
3. Glycopeptide कैद
- युग्मन बफर (100 मिमी सोडियम एसीटेट, 5.5 पीएच) में साफ पेप्टाइड्स भंग. कमरे के तापमान पर अंधेरे में 30 मिनट के लिए एक 10 मिमी अंतिम एकाग्रता, पर पेप्टाइड समाधान में सोडियम periodate जोड़ें. इस aldehydes को ग्लाइकान में सीआईएस diol समूहों oxidize होगा, जो hydrazide रसायन शास्त्र के माध्यम से राल के लिए जोड़े को ग्लाइकान अनुमति देते हैं. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए एक 20 मिमी अंतिम एकाग्रता और पीएच 5 में सोडियम sulphite द्वारा अत्यधिक periodate बुझाने.
- राल के लिए जोड़े glycopeptides को 1:04 (समाधान करने के लिए राल) के अनुपात में पेप्टाइड समाधान में hydrazide-derivatized राल का परिचय. पूरा युग्मन के लिए अंत करने के लिए अंत रोटेशन के साथ 1-2 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया सेते हैं.
- निम्न में से प्रत्येक के 1 मिलीलीटर के साथ दो बार राल धोने से अनबाउंड पेप्टाइड्स निकालें: डि पानी, 1.5 एम NaCl, मेथनॉल और 80% acetonitrile. अंत में, 100 मिमी एनएच 4 HCO 3 करने के लिए प्रणाली का बफर का आदान प्रदान करने के लिए पीएच 8 में 100 मिमी एनएच 4 HCO 3 में से 1 मिलीलीटर के साथ राल 3x धो लो.
- (वैकल्पिक) अनबाउंड पेप्टाइड्स के विश्लेषण के लिए सतह पर तैरनेवाला और washes लीजिए.
- एक साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक रात ऊष्मायन में PNGase एफ द्वारा राल से एन glycopeptides रिलीजn अंत करने के लिए अंत रोटेशन. Centrifugation और एक 80% acetonitrile धोने द्वारा जारी पेप्टाइड्स लीजिए. नियंत्रण रेखा एमएस विश्लेषण के लिए speedvac में प्राप्त समाधान सूखी.
4. इसके अलावा Fractionation (वैकल्पिक)
आगे नमूना जटिलता को आसान बनाने के लिए, प्राप्त एन glycopeptides fractionate. उदाहरण के लिए, 10 मिमी अमोनिया formate, 20% acetonitrile साथ पीएच 3 में सूखे पेप्टाइड्स redissolve और पेप्टाइड्स fractionate को मजबूत कटियन विनिमय (SCX) क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करें. प्राप्त eluent सूखी, और फिर रिवर्स चरण नियंत्रण रेखा एमएस 8,17,18 द्वारा प्राप्त पेप्टाइड अंशों का विश्लेषण.
विमोचन एन glycopeptides के 5. सफाई (वैकल्पिक)
चिंताओं पेप्टाइड्स के संभावित संदूषण के लिए वृद्धि, तो 0.1% चींटी एसिड में सूखे पेप्टाइड्स redissolve और आगे के लिए रिवर्स चरण नियंत्रण रेखा एमएस विश्लेषण पूर्व पेप्टाइड्स साफ करने के लिए एक एमसीएक्स विशेष स्तंभ का उपयोग करें.
राल बंद एन glycopeptides के चुनिंदा दरार के दौरान, PNGase एफ एक एसपारटिक एसिड एन glycan जुड़ा हुआ asparagine धर्मान्तरित. इसलिए, मुक्त एन glycopeptides की एक .9840 दा जन बदलाव है. सही इन पेप्टाइड्स की पहचान करने के लिए, यह संशोधन ऐसे methionine के सिस्टीन और ऑक्सीकरण की carbamidomethylation के रूप में आम संशोधनों के साथ खोज मापदंडों को जोड़ा जाना चाहिए.
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Representative Results
प्रयोगात्मक प्रक्रिया का एक प्रतिनिधि प्रवाह चार्ट चित्रा 1 में संक्षेप. लेबलिंग और आगे fractionation चरण वैकल्पिक हैं और विवरण के हाल के एक प्रकाशन 18 में वर्णित हैं. एक अन्य विकल्प राल के साथ प्रतिक्रिया नहीं करते जो असंशोधित पेप्टाइड्स, विश्लेषण करने के लिए है. असंशोधित पेप्टाइड्स का विश्लेषण करने के फायदे ऐसी तंग जंक्शनों में claudins के रूप में गैर ग्लाइकोसिलेटेड पेप्टाइड और प्रोटीन की संभावित पहचान शामिल है; एक अतिरिक्त लाभ यह है कि अधिक सटीक quantitation है. इन फायदों के आधार पर हमने करार दिया इस पद्धति जी lycocapture एक ssisted जी lobal क्यू uantitative पी roteomics (gagQP), और हाल ही में एक प्रकाशनों 18 में विश्लेषण विस्तृत जानकारी दी.
संवर्धन विधि के बाद लिया एक ठेठ glycopeptide स्पेक्ट्रम चित्रा 2 में दिखाया गया है. प्राप्त glycopeptide में, एन glycan glycan संलग्न asparagine (एन) डब्ल्यू हटा दिया गया था औरPNGase एफ द्वारा एक एसपारटिक एसिड (डी) के लिए परिवर्तित रूप में; इसलिए, स्पेक्ट्रम आसानी से आम प्रोटीन अनुक्रम डेटाबेस के खिलाफ किसी भी प्रोटिओमिक्स खोज इंजन का उपयोग कर खोजा जा सकता है.
विधि कब्जा पूर्व जटिल और मूल्यवान जैविक नमूनों के साथ अपने आवेदन करने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मॉडल ग्लाइकोप्रोटीन द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है. कुछ अक्सर इस्तेमाल मॉडल ग्लाइकोप्रोटीन avidin (चिकन), ovalbumin (चिकन), invertase (खमीर), α-1 antitrypsin (मानव), conalbumin (चिकन), और ribonuclease बी (गोजातीय) (सभी सिग्मा से प्राप्त किया जा सकता है) शामिल हैं. इन प्रोटीनों से अक्सर पहचान glycopeptides पिछले एक प्रकाशन 8 में पाया जा सकता है. इन मॉडल प्रोटीन से उत्पन्न नियंत्रण रेखा एमएस परिणाम की स्वत: खोज के लिए उपयुक्त है एक अनुकूलित प्रोटीन अनुक्रम FASTA डेटाबेस नीचे दिए गए लिंक (http://www.sfu.ca/chemistry/groups/bingyun_sun/tools.html से डाउनलोड किया जा सकता है ), ऊपर सूचीबद्ध मॉडल प्रोटीन के साथ ही एक राजस्व भी शामिल है जो ersed खमीर अनुक्रम डेटाबेस, आम contaminants और PNGase एफ
पर कब्जा कर लिया एन glycopeptides का एक विशिष्ट नियंत्रण रेखा एमएस परिणाम 100 से अधिक ग्लाइकोप्रोटीन एक सेल माइक्रोसोमल अंश की एक एकल नियंत्रण रेखा एमएस रन से पहचाना जा सकता है, जिसमें 3 चित्र में दिखाया गया है. ग्लाइकोप्रोटीन और glycopeptides दोनों को संवर्धन चयनात्मकता आम तौर पर 90% से अधिक है. एक सफल विश्लेषण 95% की एक संवर्धन चयनात्मकता हो सकता है. आगे नमूने fractionate को एक SCX स्तंभ और कदम ढाल का उपयोग कर से पहले नियंत्रण रेखा एमएस करने के लिए आमतौर पर ग्लाइकोप्रोटीन पहचान 17 की संख्या दोगुनी हो जाएगी विश्लेषण करती है. प्राप्त glycopeptides की मात्रा कम होने पर कभी कभी,, शीशियों से संचित अशुद्धता अंतिम नमूने में मनाया जा सकता है. इन contaminants चरण 5 में प्रदान की विधि द्वारा हटाया जा सकता है.
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चित्रा 1. प्रायोगिक प्रक्रिया का चार्ट प्रवाह. आयतों आवश्यक हैं चरणों और हीरे वैकल्पिक कदम उठाए हैं.
चित्रा में पेप्टाइड अनुक्रम में लाल रंग में हाइलाइट रूप glycopeptide कब्जा विधि के बाद बेकर की खमीर से AEPIL एन ISNAGPWSR की चित्रा 2. टक्कर प्रेरित पृथक्करण (सीआईडी) स्पेक्ट्रम. रेखांकित asparagine (एन) एसपारटिक एसिड (डी) में बदल जाती है .
एन जीएल की नियंत्रण रेखा एमएस परिणाम की चित्रा 3. 2 डी साजिशमाउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं (E14.Tg2a) से प्राप्त ycopeptides. डॉट्स का पता चला पेप्टाइड्स हैं, और डॉट के रंग सांख्यिकीय प्राप्त पहचान विश्वास (यानी पेप्टाइड संभावना) का प्रतिनिधित्व करता है.
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Discussion
यहाँ हम सेल सतह प्रोटीन की रूपरेखा के लिए एक glycopeptide कब्जा रणनीति का परिचय. विधि स्रावित जैसे रक्त में उन के रूप में प्रोटीन,, साथ ही शरीर के अन्य तरल पदार्थ में या सेल संस्कृति मीडिया में अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है.
विधि की सफलता के नमूनों का पूरा पाचन पर निर्भर करता है; इसलिए, पाचन क्षमता का एक एसडीएस पृष्ठ लक्षण वर्णन विशेष रूप से एक नमूना के पहले समय विश्लेषण के लिए आवश्यक है. एक पूरा पाचन झिल्ली प्रोटीन के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है और केवल झिल्ली अंश का पूरी तरह से solubilization के बाद संभव हो सकता है. solubilization प्रक्रिया डिटर्जेंट पेश किया है जब शुरू होता है और यूरिया की ऊष्मायन के बाद समाप्त हो जाती है. बादल छाए हुए यूरिया के अलावा पहले नमूने में प्रस्तुत करता है, लेकिन यूरिया ऊष्मायन के बाद गायब हो जाता है, इसलिए, solubilization पर्याप्त है. झिल्ली अंश को भंग करने के लिए मुश्किल है, तो इस्तेमाल किया डिटर्जेंट की मात्रा में वृद्धि. झिल्ली युक्त ऊतक के नमूने लिएइस तरह के मस्तिष्क और वसा ऊतकों के रूप में, 5% Rapigest उपयोग किया जा सकता है. कभी कभी, वर्षा से पहले अधिक बार मानव सीरम के नमूने के लिए मनाया जाता है जो trypsin पाचन, के लिए नमूने के कमजोर पड़ने के दौरान प्रकट कर सकते हैं. इस वर्षा के कारण मुख्य रूप से यूरिया और डिटर्जेंट की कमी हुई सांद्रता है. इस तेज़ी आम तौर पर पाचन के दौरान trypsin से हटा दिया है और एक चिंता का विषय नहीं है किया जाएगा. हालांकि, तेज़ी रूपों, यह एक अच्छा मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए पाचन कदम के दौरान नमूना शीशी को घुमाने के लिए महत्वपूर्ण है. जैसे एन टर्मिनी और lysines से उन के रूप में पेप्टाइड्स, में प्राथमिक amines periodate ऑक्सीकरण के बाद नवगठित aldehydes साथ प्रतिक्रिया होगी क्योंकि glycocapture कदम का पीएच महत्वपूर्ण है. इस प्रकार, यह कब्जा के साथ हस्तक्षेप से उन्हें रोकने के लिए, एसीटेट बफर का उपयोग कर नीचे 6.0 पर कब्जा समाधान के पीएच समायोजन करके इन amines protonate के लिए महत्वपूर्ण है.
समाधान एक पर कब्जा करने के लिए राल का एक अनुपात का उपयोगदौर 1:03-01:04 कब्जा चरण के दौरान पर्याप्त मिश्रण सुनिश्चित करता है. राल की 50 μl की एक न्यूनतम हमारे अनुभव के आधार पर आवश्यक है; कम मात्रा में प्रदर्शन करने के लिए मुश्किल washes के बाद श्रृंखला प्रस्तुत करना होगा और कारण राल के नुकसान के लिए गंभीर नमूना नुकसान का परिचय देंगे. हम कुल प्रोटीन की 0.5-2 मिलीग्राम के लिए राल के 100-300 μl का उपयोग कर अच्छे परिणाम प्राप्त किया है. हालांकि, प्रोटीन और राल की राशि के बीच अनुपात हम आप अपने विशिष्ट नमूने और अनुप्रयोगों के लिए इस शर्त का अनुकूलन की सलाह देते हैं, निर्भर नमूना हो सकता है.
hydrazide रसायन विज्ञान सब्सट्रेट पर दोनों ओ और एन से जुड़े glycopeptides कब्जा; कारण सब ओ से जुड़े glycopeptides जारी करने के लिए एक प्रभावी एंजाइम की कमी के कारण, हम केवल एन glycopeptide पढ़ाई 8,12 के लिए PNGase एफ इस्तेमाल किया. glycopeptides हे प्रकार का अध्ययन करने की संभावना उपयुक्त हाइड्रोलिसिस की खोज या जैव अभियांत्रिकी आवश्यकता हो सकती है.
यह विधि कई पी में रोक दिया जा सकतासहित लेस: 1) झिल्ली अंश प्राप्त करने के बाद, 2) trypsin पाचन और पेप्टाइड्स की सफाई, और 3) एन glycopeptides की रिहाई के बाद के बाद. अतिरिक्त प्रक्रियाओं इन अंतराल के दौरान पेश किया जा सकता है. चित्रा 1 में संकेत के रूप में उदाहरण के लिए, पच पेप्टाइड्स विभिन्न मात्रात्मक विश्लेषण के लिए, एन isotags द्वारा लेबल किया जा सकता है. हम हाल ही में एक प्रकाशन के 18 में प्रदर्शन के रूप असंशोधित पेप्टाइड्स glycopeptides साथ समानांतर में विश्लेषण कर रहे हैं जिसमें gagQP नामक विधि का प्रयोग, quantitation की सटीकता काफी सुधार किया जा सकता है.
Glycopeptide कब्जा ही प्रभावी ढंग से नमूना जटिलता कम कर सकते हैं, और यह आगे समृद्ध एन glycopeptides fractionate के लिए आम तौर पर आवश्यक नहीं है. अपवाद जैसे रक्त प्रोटीन biomarkers की खोज या में नमूने के रूप में प्रचुर मात्रा में है लेकिन पर्याप्त एकाग्रता गतिशीलता के साथ कर रहे हैं, और ब्याज की प्रोटीन कम बहुतायत में हैं जहां स्थितियों के लिए लागूकोशिका की सतह प्रोटीन का एक पूरा सर्वेक्षण के लिए. उन परिस्थितियों में आगे fractionation glycoproteome का एक बेहतर पैठ प्रदान करने के लिए कब्जा कर लिया एन glycopeptides के लिए लागू किया जा सकता है. Glycoproteome के नीचे विभाजन के माध्यम से संपर्क किया जा रहा है, nonspecific बंधन से शुरू की गैर glycopeptides की पहचान में वृद्धि होगी. इस प्रकार एक glycopeptide की कमी और (~ 85%) ग्लाइकोप्रोटीन चयनात्मकता आमतौर पर एन glycopeptides 17 का एक और विभाजन के बाद मनाया जाएगा. इसलिए, शोधकर्ताओं ने सबसे उपयुक्त प्रक्रिया की रूपरेखा बनाते समय पेशेवरों और विपक्ष तौलना चाहिए.
एक एन glycopeptide कब्जा विधि का इस्तेमाल कभी नहीं किया है, जो शोधकर्ताओं के लिए, यह कुछ शुद्ध एन ग्लाइकोप्रोटीन (एस) के साथ विधि का अभ्यास करने के लिए सबसे अच्छा है कि पहले 8 के रूप में सूचीबद्ध ग्लाइकोसिलेशन साइटों में जाना जाता रहा. इस विधि मजबूत है और एन glycopeptides को चयनात्मकता उच्च है. इस पद्धति का एक दोष यह है कि सुर के निहित कम बहुतायत में निहित हैचेहरा एन ग्लाइकोप्रोटीन; नमूना के लिए एक व्यापक लक्षण वर्णन के लिए, उच्च मात्रा आम तौर पर साइटोसोलिक प्रोटिओमिक्स की तुलना में आवश्यक है. संवर्धित कोशिकाओं इन विट्रो में विस्तार किया जा सकता है या ब्याज के ऊतकों में प्रचुर मात्रा में हैं, तो हालांकि, इस खामी नगण्य है.
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Disclosures
लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.
Acknowledgments
इस शोध साइमन फ्रेजर विश्वविद्यालय के स्टार्टअप कोष द्वारा समर्थित किया गया है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DTT | Sigma | 646563 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Iodoacetamide | Sigma | A3221 | |
| Rapigest SF | Waters | 186001860 | |
| Sodium periodate | Sigma | 311448 | |
| PNGase F | New England Biolabs | P0704S | |
| Affi-Gel Hz hydrazide gel | Bio-Rad | 153-6047 | |
| Trypsin | Worthington Biomedical | LS02115 | |
| Sep-Pak C-18 cartridge | Waters | WAT054955 | |
| Oasis MCX cartridge | Waters | 186000252 | |
| Protease inhibitor coctail | Sigma | P8340 | |
| Urea | Amersco | 568 | |
| Sodium sulphite | Caledon | 8360-1 | |
| Invertase | Sigma | I0408 | |
| α-1 trypsin | Sigma | F2006 | |
| Ribonulease B | Sigma | R7884 | |
| Avidin | Sigma | A9275 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503 | |
| Conalbumin | Sigma | C0755 |
References
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