Summary
세포 표면 단백질은 생물학적으로 중요하고 광범위 글리코 실화이다. 우리는 손쉬운 LC-MS 기반 단백체 분석을 위해이 단백질을 용해 풍부하고 deglycosylate 여기 글리코 펩타이드 캡처 방법을 소개합니다.
Abstract
세포 외 기질 단백질을 포함한 세포 표면 단백질은, 이러한 성장, 분화, 증식 등의 모든 주요 셀룰러 프로세스 및 기능에 참여합니다. 이 단백질의 포괄적 인 특성은 바이오 마커 발견, 세포 유형 식별 및 약물 표적 선택뿐만 아니라, 세포 생물학 및 생리학에 대한 우리의 이해를 사전에 도움 풍부한 정보를 제공합니다. 표면 단백질은, 그러나, 그들의 본질적으로 낮은 풍부, 소수성, 무거운 번역 후 변형의 중요한 분석 과제를 포즈. 표면 단백질에 널리 당화을 활용, 우리는 여기에 몇 가지 기존의 N-glycoproteomics 수단의 장점을 통합하는 높은 처리량 글리코 펩타이드 캡처 방법을 소개합니다. 우리의 방법은 표면 단백질에서 파생 된 글리코 펩타이드를 풍부하게하고 LC-MS를 사용하여 손쉬운 프로테오믹스에 대한 자신의 글리 칸을 제거 할 수 있습니다. 확인 된 N-glycoproteome는 INF를 포함한다단백질의 정체성과 양뿐만 아니라 포도당의 자신의 사이트의 ormation. 이 방법은 암, 줄기 세포, 약물 독성을 포함한 영역에서 일련의 연구에 적용되어왔다. 방법의 한계는 샘플의 상대적으로 많은 양의 세포질 단백질을 중심으로 연구와 비교하여 본 분석에 필요한되도록 표면 막 단백질의 낮은 풍부에있다.
Introduction
세포 표면 단백질은 세포 외 환경과 상호 작용하는 세포의 외부에서 내부로의 신호를 중계. 따라서, 세포 외 기질 단백질을 포함하여 이러한 단백질은 세포 생물학 및 증식, 성장, 이동, 분화에서 등 노화에 이르기까지 생리학의 모든 측면에서 중요한 역할을한다. 표면 단백질이 다른 세포, 단백질과 작은 분자 1-3와 상호 작용에 의해 작동합니다. 약물의 60 % 이상이 세포 표면 단백질 4를 대상으로하는 등 세포 표면 단백질의 분자 특성은 생물 학자뿐만 아니라, 제약 회사를위한뿐만 아니라 큰 관심입니다.
뛰어난 감도, 정확성 및 단백질과 펩티드의 식별을위한 처리량 텐덤 질량 분석법 (MS)는 글로벌 프로테오믹스 연구 5,6를위한 강력한 도구이다. 그러나, 표면 단백질은, MS-기반 프로테오믹스에 상당한 도전을 제기대부분의 표면 단백질은 낮은 수량과 무거운 수정으로 존재한다. 표면 단백질의 막에 걸친 영역들을 소수성 렌더링; 이것은 특히 다중 경로 막 횡단 단백질에 대한 경우이다. 이 세제의 도움없이 수용액에 막 단백질을 용해하는 것이 곤란하다; 그러나 세제의 사용은 일반적으로 단백질 식별의 HPLC와 MS -1,7,8,8의 성능을 억제한다. 따라서, 막 단백질은 가난 직접 LC-MS 기반 프로테오믹스 특징으로하고 있습니다.
포도당은 세포 표면 단백질 9에서 일어나고있는 가장 중요하고 풍부한 번역 후 변형 중 하나입니다. 글리 칸의 엄청난 복잡성과 이질성은 펩티드 'MS 신호 (10)를 방해. 그럼에도 불구하고, 몇 가지 프로테오믹스 방법은 표면의 단백질을 풍부하게하기 전에 LC-MS 분석에 단백질에서 설탕 부분을 제거하는이 독특한 변형을 사용했다. 이 방법의 렉틴 기반 선호도 캡처 (11)과 하이 드라 지드 기반 또는 붕산 기반 화학 캡처 (12)뿐만 아니라 친수성 크로마토 그래피 분리 8,13 있습니다. 글리 칸의 제거는 일반 단백질에 막 단백질을 변환하고 크게 MS의 특성을 단순화합니다. 당화 또한 단백질 막에 대비 높은 용해도를 분비 단백질에서 발생하기 때문에, 많은 glycoproteomic 방법은 수용성 단백질에 최적화 된 낮은 글리코 펩티드 선택과 단백질 8,14를 막에 배포되는 감도를 갖는 경향이있다. 다른 방법도 풍부하게 존재한다, 특히, 초 원심 분리 (15) 및 라벨 (16) 전략을 사용하는 것과 같은 세포 표면 단백질. 막 단백질의 특성에 대한 우리의 방법과 기존의 방법과 자세한 비교는 최근 17를 실시하고, 그 결과는 우리의 방법이 동일하게 수행 할 수있는 표시, 경우에 없습니다모든 비교 막 단백질 체학 방법보다 더 나은,하지만 더 소박하고.
연구팀은이 방법을 사용하기 위해, 여기에 우리 세부 일반 프로토콜입니다. 이 방법은 기존의 glycoproteomics 전략의 몇 가지 장점을 통합하고 막 당 단백질을 위해 특별히 고안되어, 아직 방법은 분비 단백질을 동일하게 작동합니다. 이 방법의 특징은 1) 막 단백질의 완전한 용해, 2) 대신에 고체 포집 기판을 사용하는 경우 잠재적 인 입체 장해를 제거하는 당 단백질의 글리코 펩타이드의 농축, 3) 하이 드라 지드 화학의 사용은 공유 결합 사이를 형성하도록 글리코 펩타이드와 캡처 기판 접합 글리코 펩타이드가 높은 glycoselectivity 엄격한 세척을 견딜 수 있고, 4) 능력이 감소 샘플 손실 및 단축 절차 기간 동안 하나의 튜브 전체 포착 절차를 수행 할 수 있도록. VARI 연구에이 방법을 실행 한 후세포와 조직 등의 생체 시료 중의 ety, 우리는 당 단백질 8,17,18에 높은 선택성 (> 90 %)을 관찰했다.
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Protocol
1. 수확 막
- 세포 펠렛 (~ 10 8 셀)에 프로테아제 억제제 칵테일 저장성 버퍼 (10 MM 트리스 - 염산, 10 밀리미터의 KCl, 1.5 mM의 MgCl2를, 산도 8.0)을 추가하고 얼음에 15 ~ 30 분 동안 품어. 를 Lyse 주사기 바늘 (5 ~ 10 패스)를 통해 샘플을 통과하거나 다운스 호모 게 나이저 (15 ~ 30 타)로 샘플을 균질화하여 세포. 용해의 효율을 확인하는 혈구와 트리 판 블루 염색법을 사용합니다.
- 3000 GX 15 분에 용해 액의 차등 원심 분리하여 미세 소체 분획을 확보 한 다음에 10 GX 2 시간. 우선 원심 분리 핵 분획 인 펠렛을 취득하고, 상층 액의 원심 분리 이후의 원형질막뿐만 아니라 막 - 결합 세포 기관 (8)를 포함 마이크로 솜 분획 인 제 펠릿을 생성한다. 최종 상층 액을 세포질 부분입니다. 더 분석가를위한 -80 ° C의 냉동고에 미세 소체 분수를 저장아래와 같습니다.
2., 용해 변성, 소화 막 단백질
- 변성 버퍼 (40 MM 트리스, 10 mM의 EDTA, 10 mM의 TCEP, 0.5 % Rapigest, 산도 8)에서 마이크로 솜 분획을 용해 후 10 분 동안 100 ° C에서 솔루션을 품어.
- 실온으로 가열 된 용액을 냉각 에이트 M의 최종 농도로 용액에 초 고순도 우레아 분말을 추가하고 30 분 동안 37 ° C에서 샘플을 배양한다.
- 15 mM의 최종 농도에 샘플에 요오도 아세트 아미드 스톡 용액을 추가하고, 시료에 자유 티올을 알킬화 실온에서 30 분 동안 어두운 용액을 배양한다. 10 mM의 최종 농도 시료에 DTT 주식 솔루션을 추가하고 과도한 요오도 아세트 아미드를 해소하기 위해 실온에서 또 다른 10 분 동안 솔루션을 품어.
- pH를 8에서 40 mM 트리스 완충액으로 얻어진 용액을 10 배 희석하고,이어서 trypsi 1:20의 비율로 샘플을 트립신을 쓰총 단백질 명. 반응이 완료 될 수 있도록 37 ° C 오븐에서 밤새에서 소화 반응을 유지한다.
- 즉 Rapigest 염산, 또한 세제를 분해 조건으로 pH 1로 시료 용액을 산성화하여 소화를 종료합니다. 1 시간 동안 37 ° C에서 Rapigest을 저하하고, 원심 분리에 의해 개발 된 침전을 제거합니다.
- C-18 고체상 추출 (SPE) 카트리지에 의해 샘플 펩티드를 포함하고를 Speedvac에 의해 얻어진 샘플을 건조 뜨는을 청소합니다.
- 이전과 소화 효율을 확인하는 트립신 분해 된 후 샘플의 SDS-PAGE 분석을 수행합니다.
3. 글리코 펩티드 캡처
- 결합 완충액 (100 mM의 아세트산 나트륨, pH를 5.5)에서 세정 펩티드를 용해. 실온에서 어두운 곳에서 30 분 동안 10 mM의 최종 농도에서 펩티드 용액에과 요오드 산 나트륨을 추가. 이 알데히드를 글리 칸의 시스 - 디올기를 산화 할 것이다,하는 하이 드라 지드 화학을 통해 수지 커플 글리 칸이 있습니다. 실온에서 10 분 동안 20 mM의 최종 농도 및 pH를 5로 황산나트륨으로 과도한 요오 담금질.
- 수지에 커플 글리코 펩타이드 1:4 (용액에 수지)의 비율 펩티드 용액에 히드라 지드 - 유도 된 수지를 소개한다. 완전한 연결을위한 엔드 - 투 - 엔드 회전 1-2 일 동안 37 ° C에서 반응을 품어.
- 다음의 각 1 ㎖로 두 번 수지를 세척하여 언 바운드 펩티드를 제거 DI 물, 1.5 M 염화나트륨, 메탄올 80 % 아세토 니트릴. 마지막으로, 100 ㎜ NH 4 HCO 3 시스템의 완충액을 교환하고 pH를 8에서 100 ㎜ NH 4 HCO 3 1 ㎖와 수지 3 회 세척 하였다.
- (옵션) 언 바운드 펩티드의 분석을위한 뜨는 세척을 수집합니다.
- 와 37 ° C에서 하룻밤 배양에 인, PNGase F로 수지에서 N-글리코 펩타이드를 해제N 엔드 - 투 - 엔드 회전. 원심 분리 및 80 % 아세토 니트릴 세척에 의해 방출 된 펩티드를 수집합니다. LC-MS 분석을 위해를 Speedvac에서 얻어진 용액을 건조시켰다.
4. 또한 분별 (선택 사항)
상기 샘플의 복잡성을 단순화하기 위해, 얻어진 N-글리코 펩티드 분획. 예를 들어, 10 mM의 암모니아 메이트, 20 % 아세토 니트릴을 사용하여 pH 3으로 건조 펩티드를 재용 및 펩티드 분획 강한 양이온 교환 (SCX)을 크로마토 그래피를 사용한다. 얻어진 용출액을 건조하고 역상 LC-MS 8,17,18에 의해 얻어진 펩티드 분수를 분석 할 수 있습니다.
출시 N-글리코 펩티드 5. 청소 (옵션)
문제는 펩티드의 잠재적 인 오염 상승하면 0.1 % 포름산으로 건조 된 펩티드를 재용하고 추가 할 수 역상 LC-MS 분석 이전에 펩티드를 청소 MCX SPE 열을 사용합니다.
수지 오프 N-글리코 펩타이드를 선택적으로 절단하는 동안, 인, PNGase F는 아스파르트 산에 N-글리 칸 연결 아스파라긴을 변환합니다. 따라서 해방 된 N-글리코 펩타이드의 0.9840 다 질량 변화가있다. 정확하게이 펩티드를 확인하려면,이 수정은 메티오닌, 시스테인 산화의 carbamidomethylation 일반적인 수정과 함께 검색 매개 변수를 추가해야합니다.
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Representative Results
실험 절차의 대표적인 흐름도는도 1에 요약되어있다. 라벨 및 상기 분류 단계는 선택적이며 상세는 최근 간행물 (18)에 기재되어있다. 또 다른 옵션은 수지와 반응하지 않는 비 변형 펩티드를 분석하는 것이다. 변형되지 않은 펩티드를 분석의 장점은 단단한 접합부에서 claudins 같은 비 - 글리코 실화 된 펩티드 및 단백질의 가능성 식별을 포함한다; 추가적인 장점은보다 정확한 정량이다. 이러한 장점을 바탕으로, 우리는 불리는이 방법 G lycocapture-ssisted-G의 lobal의 Q uantitative P의 roteomics (gagQP), 그리고 최근의 출판물 (18)에 분석을 자세히 설명합니다.
농축 방법 후에 취한 전형적인 글리코 펩티드 스펙트럼은도 2에 도시된다. 수득 글리코 펩타이드에서 N-글리 칸을 글리 칸 부착 아스파라긴 (N) w 제거하고,인, PNGase F에 의해 아스파르트 산 (D)로 변환으로; 따라서 스펙트럼은 쉽게 일반적인 단백질 서열 데이터베이스에 대해 어떤 프로테오믹스 검색 엔진을 사용하여 검색 할 수 있습니다.
캡쳐 방법은 이전의 복잡하고 중요한 생물학적 샘플에서 응용 프로그램에 상용 모델 당 단백질에 의해 평가 될 수있다. 자주 사용하는 모델 당 단백질은 아비딘 (닭), 알부민 (닭), 전화 효소 (이스트), α-1 antitrypsin의 (인간), 콘 알부민 (닭)과 리보 뉴 클레아 B (소) (모든 시그마에서 얻을 수있다) 등이있다. 이 단백질에서 자주 확인 글리코 펩타이드는 이전 게시 8에서 찾을 수 있습니다. 이 모델 단백질에서 생성 된 LC-MS 결과의 자동 검색에 적합한 맞춤형 단백질 시퀀스 FASTA 데이터베이스는 다음과 같은 링크 (http://www.sfu.ca/chemistry/groups/bingyun_sun/tools.html에서 다운로드 할 수 있습니다 ) 위에 나열된 모델 단백질뿐만 아니라 회전을 포함하는 ersed 효모 시퀀스 데이터베이스, 일반 오염 물질 인, PNGase F.
캡처 된 N-글리코 펩타이드의 전형적인 LC-MS 결과는 100 개 이상의 당 단백질은 세포 마이크로 솜 분획의 단일 LC-MS 실행에서 식별 할 수있는, 그림 3에서 볼 수 있습니다. 당 단백질 및 글리코 펩티드 모두에 농축 선택성은 일반적으로 90 % 이상이다. 성공적인 분석은 95 %의 농축 선택을 할 수 있습니다. 추가 샘플을 분별하는 SCX 열 단계의 그라데이션을 사용하면 이전에 LC-MS에 일반적으로 당 단백질의 동정 (17)의 수를 두 배로 분석합니다. 수득 글리코 펩타이드의 양이 적을 때, 때때로, 바이알로부터 축적 불순물은 최종 샘플에서 관찰 할 수있다. 이러한 오염 물질은 5 단계에서 제공된 방법에 의해 제거 될 수있다.
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그림 1. 실험 절차의 흐름도. 사각형이 필요한 단계와 다이아몬드는 선택 단계입니다.
그림의 펩타이드 서열에 빨간색으로 강조 표시로 글리코 펩티드 캡처 방법 후 빵 효모에서 AEPIL N ISNAGPWSR의 그림 2. 충돌이 유발 분해 (CID) 스펙트럼. 밑줄 아스파라긴 (N)는 아스파르트 산 (D)로 변환 .
N-GL의 LC-MS 결과 그림 3. 2D 플롯마우스 배아 줄기 세포 (E14.Tg2a)로부터 획득 ycopeptides. 점이 검출 된 펩티드이고, 도트의 색이 통계적으로 얻어진 식별 신뢰 (즉 펩티드 확률)을 나타낸다.
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Discussion
여기에서 우리는 세포 표면 단백질 프로파일에 대한 글리코 펩타이드 캡처 전략을 소개합니다. 방법은 분비 된 혈액에서와 단백질뿐 아니라 기타 체액 또는 세포 배양 배지에서 연구에 적용될 수있다.
방법의 성공은 샘플의 완전 분해에 의존한다; 따라서 소화 효율의 SDS-PAGE 특성화 특히 시료의 처음 분석을 위해 필요하다. 완전한 소화는 막 단백질에 대한 도전 할 수 있고, 단지 막 분획의 철저한 가용화 후 가능할 수있다. 가용화 처리는 세제가 도입 될 때 시작하고 우레아의 배양 후 종료한다. 구름 양이 요소를 추가하기 전에 샘플로 제시하지만, 요소 배양 후에 사라 따라서, 가용화 충분하다. 막 분획이 녹기 어려운 경우에는, 사용되는 세제의 양을 증가시킨다. 막 풍부한 조직 샘플에 대한뇌 및 지방 조직으로, 5 % Rapigest가 이용 될 수있다. 때때로, 강수량은 이전에 더 자주 인간 혈청 샘플에서 관찰 된 트립신 소화에 샘플을 희석하는 동안 나타날 수 있습니다. 이러한 침전의 원인은 주로 우레아 및 세제의 감소 농도이다. 이 강수량은 일반적으로 소화하는 동안 트립신에 의해 제거하고 중요하지 않은 것입니다. 그러나, 석출 형태는, 그것이 양호한 혼합을 보장하기 위해 소화 단계 동안 샘플 바이알을 회전 할 때 중요하다. 이러한 N-말단 및 리신으로부터 것과 펩티드에서 일차 아민과 요오드 산화 후에 새로 형성된 알데히드와 반응하므로 glycocapture 단계의 pH는 중요하다. 따라서, 촬영을 방해하지 못하도록하는, 아세트산 버퍼를 사용하여 6.0 이하로 캡처 용액의 pH를 조정함으로써 이러한 아민을 양성자 화하는 것이 중요하다.
용액을 캡처하는 수지의 비율을 이용라운드 1시 3분 1:4는 캡처 단계에서 충분한 혼합을 보장합니다. 수지의 50 μL의 최소는 우리의 경험에 근거를 둔 필요가있다; 낮은 수량을 수행하기 어려운 세척의 후속 시리즈를 렌더링 인해 수지의 손실이 심각한 샘플 손실을 소개합니다. 우리는 전체 단백질의 0.5 MG에 대한 수지의 100 ~ 300 μl를 사용하여 좋은 결과를 얻었다. 그러나 단백질과 수지의 양의 비율은 우리는 당신이 특정 샘플 및 응용 프로그램이 조건을 최적화 권장 따라 샘플이 될 수 있습니다.
히드라 지드 화학은 기판 상에 모두 O-및 N-결합 글리코 펩타이드를 캡처; 때문에 모든 O-결합 글리코 펩타이드를 분리 효과적인 효소의 부족 때문에, 우리는 N-글리코 펩타이드에 대한 연구 결과 8,12 인, PNGase F를 사용 하였다. 글리코 펩타이드의 O 형을 연구의 가능성은 적절한 가수 분해 효소의 발견 또는 생명 공학을 필요로 할 수있다.
이 방법은 몇 가지 P를 일시 중지 할 수있다끈 등 : 1) 막 분획을 수득 한 후, 2) 트립신 소화 펩티드의 세정, 및 3) N-글리코 펩타이드의 방출 된 후 후. 추가 절차는 이러한 간격 중에 도입 될 수있다. 도 1에 나타낸 바와 같이 예를 들면, 펩타이드는 소화 차분 정량 분석을 위해, N-isotags 의해 표시 될 수있다. 우리는 최근 간행물 (18)에서와 같이 수정되지 않은 펩타이드가 글리코 펩타이드와 병렬로 분석되는 gagQP 불리는 방법을 이용하여, 정량 정밀도를 대폭 향상시킬 수있다.
글리코 펩티드 캡처 자체 효과적으로 샘플의 복잡성을 줄일 수 있고, 더 농축 된 N-글리코 펩타이드를 분별하는 것이 일반적으로 필요하지 않다. 예외는 혈액 단백질 바이오 마커의 발견 또는 같이 샘플이 풍부하지만 상당한 농도의 역학, 그리고 관심의 단백질이 낮은 풍부에 상황에 적용세포 표면 단백질의 전체 설문 조사. 이러한 상황 하에서 상기 분획은 glycoproteome의 침투를 더 제공하기 위해 캡처 된 N-글리코 펩타이드에 대해 구현 될 수있다. glycoproteome의 바닥 분획을 통해 접근되는 바와 같이, 비특이적 결합에 의해 도입 된 비 - 글리코 펩타이드의 식별은 증가 할 것이다. 따라서 당 펩타이드의 감소 및 (~ 85 %) 당 단백질의 선택은 일반적으로 N-글리코 펩티드 (17)의 추가 분류 후 관찰됩니다. 따라서, 연구진은 가장 적합한 절차를 설계 할 때 장단점의 무게를해야합니다.
N-글리코 펩타이드 캡처 방법을 사용한 적이 연구원의 경우, 몇 가지 순수 N-당 단백질 (들)과 방법을 연습하는 것이 가장 좋습니다 이전에 8 나열된 당화 사이트 알려진 한. 이 방법은 강력하고 N-글리코 펩타이드에 대한 선택성이 높다. 이 방법의 단점은 쉬르의 고유 낮은 풍요 로움에있다얼굴 N-당 단백질; 샘플의 포괄적 인 특성화, 더 높은 양이 일반적으로 세포질 단백질 체학보다 필요합니다. 배양 된 세포는 체외에서 확장 할 수 있습니다 또는 그 조직이 풍부 경우이 단점은 무시할 수있다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 사이먼 프레이저 대학의 시작 기금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DTT | Sigma | 646563 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Iodoacetamide | Sigma | A3221 | |
| Rapigest SF | Waters | 186001860 | |
| Sodium periodate | Sigma | 311448 | |
| PNGase F | New England Biolabs | P0704S | |
| Affi-Gel Hz hydrazide gel | Bio-Rad | 153-6047 | |
| Trypsin | Worthington Biomedical | LS02115 | |
| Sep-Pak C-18 cartridge | Waters | WAT054955 | |
| Oasis MCX cartridge | Waters | 186000252 | |
| Protease inhibitor coctail | Sigma | P8340 | |
| Urea | Amersco | 568 | |
| Sodium sulphite | Caledon | 8360-1 | |
| Invertase | Sigma | I0408 | |
| α-1 trypsin | Sigma | F2006 | |
| Ribonulease B | Sigma | R7884 | |
| Avidin | Sigma | A9275 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503 | |
| Conalbumin | Sigma | C0755 |
References
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