Summary
Белки клеточной поверхности являются биологически важной и широко гликозилированный. Введем здесь подход гликопептид захвата для растворения, обогатить и deglycosylate эти белки для легковесных протеомных анализа на основе ЖХ-МС.
Abstract
Белки клеточной поверхности, в том числе белков внеклеточного матрикса, участвовать во всех крупных клеточных процессов и функций, таких как рост, дифференцировку и пролиферацию. Комплексный характеристика этих белков обеспечивает богатую информацию для поиска биомаркеров, идентификации камерного типа, и выбор лекарственной целевой, а также помогая продвинуть наше понимание клеточной биологии и физиологии. Поверхностные белки, однако, создают значительные аналитические проблемы, из-за их изначально низкой численности, высокой гидрофобностью и тяжелых пост-трансляционных модификаций. Воспользовавшись тем, что распространенной гликозилирования на поверхностных белков, введем здесь высокой пропускной подход гликопептид захвата, которая объединяет в себе преимущества нескольких существующих N-glycoproteomics средств. Наш метод может обогатить гликопептиды, полученные из поверхностных белков и удалить их гликаны для легковесных протеомики с использованием ЖХ-МС. Разрешенный N-glycoproteome включает инфormation идентичности белка и количества, а также их сайтов гликозилирования. Этот метод был применен к серии исследований в областях, в том числе рака, стволовых клеток и токсичности препаратов. Ограничение метода заключается в низкой численности поверхностных мембранных белков, таких, что относительно большое количество образцов, необходимых для проведения такого анализа по сравнению с исследований сосредоточены на цитозольными белков.
Introduction
Белки клеточной поверхности взаимодействуют с внеклеточной среде и передают сигналы с внешней стороны к внутренней части клетки. Таким образом, эти белки, в том числе белков внеклеточного матрикса, играют важную роль во всех аспектах клеточной биологии и физиологии, начиная от распространения, роста миграции, дифференциации к старению и так далее. Поверхностные белки функционируют за счет взаимодействия с другими клетками, белков и малых молекул 1-3. Молекулярная характеристика белков клеточной поверхности представляет большой интерес не только для биологов, но и для фармацевтических компаний, так как более 60% лекарственных средств направлены на клеточной поверхности белков 4.
Тандемной масс-спектрометрии (МС), с превосходной чувствительностью, точностью и пропускной способности для идентификации белков и пептидов, был мощным инструментом для глобальных протеомных исследований 5,6. Тем не менее, поверхностные белки создают значительные проблемы для протеомики MS-основе, каксуществует большинство поверхностные белки в небольших количествах и с тяжелыми изменениями. Мембранные охватывающей регионы поверхностных белков сделать их гидрофобными; это особенно касается многопроходных белков трансмембранных. Таким образом, трудно растворим мембранных белков в водных растворах без помощи моющего средства; Однако использование моющих средств обычно подавляет производительность ВЭЖХ и МС 1,7,8 в идентификации белков. Таким образом, мембранные белки были слабо отличающийся тем, прямых протеомики на основе LC-MS.
Гликозилирование является одним из наиболее важных и распространенных пост-трансляционных модификаций, происходящих в белков клеточной поверхности 9. Огромный сложность и неоднородность гликанах препятствовать MS сигнальных пептидов '10. Тем не менее, несколько протеомические методы использовали эту уникальную модификацию обогатить поверхностные белки и удалить остатки сахара из белков до ЖХ-МС анализа. Это методс включить лектина на основе сродства захвата 11 и гидразида на основе борной кислоты или на основе химического захвата 12, а также гидрофильные хроматографии разделения 8,13. Удаление гликанах превращает мембранные белки с обычными белками и резко упрощает MS характеристику. Потому гликозилирования также происходит в секретируемых белков, которые имеют высокую растворимость в отличие от мембранных белков, многие glycoproteomic методы оптимизированы для растворимых белков, и, как правило, имеют более низкий гликопептидам селективности и чувствительности, когда развертывается с мембранными белками 8,14. Другие методы также существуют для обогащения, в частности, белков клеточной поверхности, такие как те, которые используют ультрацентрифугирования 15 и маркировка стратегии 16. Подробное сравнение между нашего метода и других существующих методов для характеристики мембранных белков проводили в последнее 17, и результаты показали, что наш метод может функционировать одинаково хорошо, если нелучше, чем все сравниваемых методов мембранные протеомики, но с более высокой простоты.
Чтобы помочь исследователям использовать этот метод, мы здесь подробно общий протокол. Этот метод объединяет несколько преимуществ существующих glycoproteomics стратегий и разработали специально для мембранных гликопротеинов, но метод работает одинаково хорошо для секретируемых белков. Характеристики этого метода включают: 1) полное солюбилизации мембранных белков, 2) обогащение гликопептидов вместо гликопротеинов Для устранения возможности пространственное затруднение при использовании твердого захваченной подложку, 3) использование гидразида химии с образованием ковалентных связей между гликопептиды и захвата подложки, таким образом, что соединенные гликопептиды могут переносить жесткие моет для высокого glycoselectivity и 4) способность проводить всю процедуру захвата в одну трубку для снижения потерь образца и продолжительности укороченной процедуры. После реализации этого метода к изучению с переменнымщества биологических образцов, включая клетки и ткани, мы наблюдали высокую селективность (> 90%), чтобы гликопротеинов 8,17,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Harvest Мембраны
- Добавить гипотонического буфера (10 мМ Трис-HCl, 10 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl2, рН 8,0) с коктейль ингибиторов протеаз на клеточного осадка (~ 10 8 клеток) и инкубируют в течение 15-30 мин на льду. Lyse клетки при прохождении пробы через шприцев игл (5-10 проходов) или гомогенизации образца на гомогенизаторе Даунса (15-30 ударов). Используйте гемоцитометра и окрашивания трипановым синим, чтобы проверить эффективность лизиса.
- Получение микросомальной фракции дифференциальным центрифугированием при 3000 лизата GX 15 мин и затем при 100000 GX 2 час. Первый центрифугирование получает осадок, который ядерная часть, и последующее центрифугирование супернатанта генерирует второй шарик, который микросомальной фракции, которая содержит плазматическую мембрану, а также мембраносвязанных органеллы 8. Окончательный супернатант цитозольной фракции. Храните микросомальные фракции в -80 ° C морозильник для дальнейших Analysэто, как указано ниже.
2. Растворите, Денатурировать и Дайджест мембранных белков
- Растворить микросомальной фракции в буфере денатурации (40 мМ Трис, 10 мМ ЭДТА, 10 мМ TCEP, 0,5% Rapigest, рН 8), а затем инкубируют раствор при 100 ° С в течение 10 мин.
- Охлаждают нагретого раствора до комнатной температуры, добавляют порошок мочевины сверхвысокой чистоты в раствор до 8 м конечной концентрации и инкубировать образец при 37 ° С в течение 30 мин.
- Добавить иодацетамидом маточного раствора к образцу в 15 мМ конечной концентрации, и инкубируют раствор в темноте в течение 30 мин при комнатной температуре дл алкилировани свободных тиолов в образце. Добавить DTT маточного раствора к образцу до 10 мМ конечной концентрации и инкубировать решение для еще 10 мин при комнатной температуре, чтобы подавить чрезмерную иодацетамида.
- Развести полученный раствор 10x с 40 мМ Трис-буфера при рН 8, и затем добавить трипсин к образцу в соотношении 1:20 trypsiн для общего белка. Поддержания реакции переваривания в печи в течение ночи 37 ° C, чтобы обеспечить завершения реакции.
- Завершить пищеварение путем подкисления раствора образца до рН 1 HCl, состояние, которое также разрушает моющее средство, то есть Rapigest. Ухудшить Rapigest при 37 ° С в течение 1 часа, и удалить разработанный осаждение центрифугированием.
- Очистите супернатант, содержащий образцы пептидов на С-18 твердофазной экстракции (SPE) картриджа и высушить полученный образец с SpeedVac.
- Проведение анализа в ДСН-ПААГ образцах до и после трипсин-переваривание, чтобы подтвердить эффективность пищеварения.
3. Гликопептиды Захват
- Растворить очищенные пептиды в соединительной буфера (100 мМ ацетата натрия, рН 5,5). Добавить периодат натрия в пептидной растворе при 10 мМ конечной концентрации в течение 30 мин в темноте при комнатной температуре. Это будет окислять цисдиольными группами в гликанов в альдегиды, Которые позволяют гликаны в пару к смоле через гидразидной химии. Гасят чрезмерного периодат по сульфита натрия в 20 мМ конечной концентрации и рН 5 в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Представьте гидразида-производные смолы в пептидном растворе при соотношении 1:4 (смолы в растворе) в паре гликопептиды со смолой. Выдержите реакцию при 37 ° С в течение 1-2 дней с конца в конец вращения для полного сцепления.
- Удаления несвязанного пептиды промыванием смолы дважды 1 мл каждого из следующих: DI воды, 1,5 М NaCl, метанол и 80% ацетонитрила. Наконец, промойте смолы 3 раза с 1 мл 100 мМ NH 4 HCO 3 при рН 8 для обмена буфер системы до 100 мм NH 4 HCO 3.
- Сбор супернатант и моет для анализа несвязанных пептидов (опционально).
- Отпустите N-гликопептиды из смолы по PNGase F в инкубации в течение ночи при 37 ° С сн конца в конец вращения. Соберите выпущенные пептиды путем центрифугирования и 80% стирки ацетонитрила. Сушат полученный раствор в SpeedVac для анализа LC-MS.
4. Кроме того фракционирования (необязательно)
Для дальнейшего упрощения сложности образца, фракционирования полученных N-гликопептиды. Например, повторного растворения высушенных пептидов в 10 мМ формиата аммония, рН 3 с помощью 20% ацетонитрила и использовать сильного катионита (SCX) для фракционирования хроматографии пептидов. Сушат полученный элюент, а затем анализируют полученные пептидные фракции с обращенной фазой ЖХ-МС 8,17,18.
5. Очистка разрешением N-гликопептидами (необязательно)
Если проблемы поднимаются для потенциального загрязнения пептидов, повторного растворения высушенных пептидов в 0,1%-ной муравьиной кислоты и использовать колонку SPE MCX для дальнейшего очистки пептидов до обращенной фазой ЖХ-МС анализ.
Во время избирательной расщепления N-гликопептидами от смолы, PNGase F преобразует N-гликана связанный аспарагин к аспарагиновой кислоты. Таким образом, существует 0,9840 Da сдвиг массы освобожденных N-гликопептидами. Чтобы точно определить эти пептиды, эта модификация должна быть добавлена параметров поиска вместе с общими модификаций, таких как carbamidomethylation цистеина и окисление метионина.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Представитель блок-схема экспериментальной процедуры приводится на рисунке 1. Маркировка и дальнейшие шаги фракционирования являются необязательными и детали описаны в недавней публикации 18. Другой вариант заключается в анализе немодифицированных пептидов, которые не вступают в реакцию со смолой. Преимущества анализа немодифицированных пептидов включают идентификацию потенциального негликозилированной пептидов и белков, таких как клаудины в плотных контактов; Дополнительным преимуществом является более точным количественный. Исходя из этих преимуществ, мы назвали этот метод г lycocapture-а ssisted-г ЛОБАЛЬНАЯ Q uantitative р roteomics (gagQP), и подробно анализ через последних публикаций 18.
Типичный гликопептид спектр принято после метода обогащения показано на рисунке 2. В полученном гликопептида, N-гликанов удаляли и гликанов-прикреплен аспарагин (N) Wв пересчете на аспарагиновую кислоту (D) по PNGase F; Таким образом, спектр может быть легко найдены при помощи любой поисковой протеомики двигатель к базам данных общего белка последовательностей.
Способ захвата может быть оценена с помощью коммерчески доступных моделей гликопротеинов до его применения со сложными и ценных биологических образцах. Некоторые часто используемые модели гликопротеинов включают авидин (курица), яичный альбумин (цыпленок), инвертазу (дрожжи), α-1 антитрипсина (человека), conalbumin (цыпленок), и рибонуклеазы B (бычий) (все могут быть получены из Sigma). Наиболее распространенным на гликопептиды из этих белков можно найти в предыдущей публикации 8. Настроены белок последовательности базы данных FASTA, который подходит для автоматического поиска результатов LC-MS, полученных от этих модельных белков можно скачать по следующей ссылке (http://www.sfu.ca/chemistry/groups/bingyun_sun/tools.html ), который включает перечисленные выше модели белков, а также изм ersed базы данных дрожжей последовательности, общие загрязнения и PNGase Ф.
Типичный ЖХ-МС результат захваченных N-гликопептидов показано на рисунке 3, в котором более 100 гликопротеины могут быть определены из одного LC-MS перспективе клетки микросомальной фракции. Селективность обогащение в обоих гликопротеинов и гликопептидов, как правило, более 90%. Успешный анализ может иметь селективность обогащения 95%. Использование столбец SCX и ступенчатый градиент для дальнейшего фракционирования образцов до ЖХ-МС анализ, как правило, удвоить количество гликопротеинов идентификаций 17. Иногда, когда количество полученных гликопептидов низка, примеси накапливаются из флаконов можно наблюдать в конечном образце. Эти примеси могут быть удалены по методике, приведенной в пункте 5.
. JPG "Первоначально" / files/ftp_upload/51349/51349fig1.jpg "ширина =" 350 "/>
Рисунок 1. Блок-схема экспериментальной процедуры. Прямоугольники необходимые шаги и бриллианты являются необязательными шаги.
Рисунок 2. Столкновение индуцированных диссоциация (CID) Спектр AEPIL N ISNAGPWSR из хлебопекарных дрожжей по методу гликопептид захвата. Подчеркнутый аспарагин (N) превращают в аспарагиновой кислоты (D) в качестве выделены красным цветом в пептидной последовательности на рисунке .
Рисунок 3. 2D сюжет результате ЖХ-МС в N-GLycopeptides, полученные из мышиных эмбриональных стволовых клеток (E14.Tg2a). Точки являются обнаруженные пептиды, и цвет точки представляет собой уверенность идентификации, полученную статистически (т.е. вероятности пептид).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы вводим стратегию гликопептид-захвата для профилирования белков клеточной поверхности. Этот метод может быть применен для изучения секретируемые белки, такие как те в крови, а также в других жидкостей организма или в культуральной среде клеток.
Успех метода зависит от полного переваривания проб; Поэтому SDS-PAGE характеристика эффективности пищеварения необходимо, особенно для впервые анализа образца. Полный пищеварение может быть сложным для мембранных белков, и может быть возможно только после тщательного растворения мембранной фракции. Процесс начинается растворение при введении моющего средства и заканчивается после инкубации мочевины. Поэтому, если влажность представляет в образце перед добавлением мочевины, но исчезает после мочевины инкубации солюбилизации является достаточным. Если мембранную фракцию трудно растворим, увеличить количество моющего средства. Для образцов тканей мембранных богатыхтакие как головного мозга и жировой ткани, 5% Rapigest могут быть использованы. Иногда, осадки могут появиться во время разведения образцов до трипсин-переваривание, который чаще наблюдается для образцов сыворотки человека. Причиной этого осадков основном это снижение концентрации мочевины и моющего средства. Это осаждение как правило, будут удалены трипсином в течение пищеварения и не является проблемой. Однако, когда осадки формы, важно, чтобы вращать флакон образца в ходе стадии варки, чтобы обеспечить хорошее перемешивание. Значение рН на стадии glycocapture важно, потому что первичные амины в пептидов, таких как те, от N-концов и лизина, будет реагировать с вновь образованных альдегидов после окисления периодатом. Таким образом, важно для протонирования этих аминов, регулируя рН раствора до захвата ниже 6,0 использованием ацетатного буфера, чтобы предотвратить их от вмешательства в захвате.
Использование соотношение количества смолы, чтобы захватить решение акруглый 1:3 до 1:04 обеспечивает достаточную перемешивание во время стадии захвата. Минимум 50 мкл смолы необходимо исходя из нашего опыта; меньшем количестве будет оказывать последующую серию промываний трудных для выполнения и представит серьезные потери образца из-за потери смолы. Мы получили хорошие результаты с использованием 100-300 мкл смолы в течение 0,5-2 мг общего белка. Однако соотношение между количеством белка и смолы может быть образец зависит, мы рекомендуем вам оптимизировать это условие для ваших конкретных образцов и приложений.
Химический гидразид фиксирует обе О-и N-связанных гликопептиды на подложке; в связи с отсутствием эффективного фермента, чтобы освободить все гликопептиды О-связанных, мы только использовали PNGase F для N-гликопептидных исследований 8,12. Возможность изучения уплотнительное тип гликопептидами может потребовать открытие или биоинженерия соответствующих гидролаз.
Этот метод может быть приостановлена в нескольких рШнурки в том числе: 1) после получения мембранной фракции, 2) после трипсина пищеварения и очистки пептидов, и 3) после освобождения из N-гликопептидами. Дополнительные процедуры могут быть введены в эти промежутки времени. Например, переваренные пептиды могут быть дифференциально помечены N-isotags, как указано на рисунке 1, для количественного анализа. Использование метода, называемого gagQP, в котором немодифицированные пептиды проанализированы параллельно с гликопептидов, точность количественного может быть значительно улучшена, как мы показали в недавней публикации 18.
Сам захват Гликопептиды может эффективно снизить сложность образца, и это, как правило, нет необходимости для дальнейшего фракционирования обогащенные N-гликопептиды. Исключения распространяются на ситуации, когда образцы имеются в изобилии, но с существенными динамики концентрации, и белки, представляющие интерес, в низкой численности, таких как в открытии белка в крови биомаркеров илидля полного обзора белков клеточной поверхности. В этих условиях дальнейшее фракционирование может быть реализован для захваченных N-гликопептидами, чтобы обеспечить лучшее проникновение glycoproteome. Как в нижней части glycoproteome в настоящее время решаются посредством фракционирования, выявление не-гликопептидами введенных неспецифическое связывание будет увеличиваться. Таким образом, снижение гликопептида и гликопротеин селективность (до ~ 85%), как правило, наблюдается после дальнейшего фракционирования N-гликопептидов 17. Таким образом, исследователи должны взвесить все за и против при проектировании наиболее подходящий процедуру.
Для исследователей, которые никогда не использовали метод N-гликопептид захвата, то лучше практиковать метод с несколькими чистого N-гликопротеина (ы), имеющих известные сайтов гликозилирования, которые перечислены ранее 8. Этот способ является надежной и селективность по отношению к N-гликопептидов высока. Недостаток этого метода заключается в присущей низкой численности сюрлица N-гликопротеинов; для всестороннего характеристики образца, более высокое количество, как правило, требуется, чем у цитозольных протеомики. Однако, если культивируемые клетки могут быть расширены в пробирке или ткани из интереса в изобилии, этот недостаток можно пренебречь.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано запуска фонда Университета Саймона Фрейзера.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DTT | Sigma | 646563 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Iodoacetamide | Sigma | A3221 | |
| Rapigest SF | Waters | 186001860 | |
| Sodium periodate | Sigma | 311448 | |
| PNGase F | New England Biolabs | P0704S | |
| Affi-Gel Hz hydrazide gel | Bio-Rad | 153-6047 | |
| Trypsin | Worthington Biomedical | LS02115 | |
| Sep-Pak C-18 cartridge | Waters | WAT054955 | |
| Oasis MCX cartridge | Waters | 186000252 | |
| Protease inhibitor coctail | Sigma | P8340 | |
| Urea | Amersco | 568 | |
| Sodium sulphite | Caledon | 8360-1 | |
| Invertase | Sigma | I0408 | |
| α-1 trypsin | Sigma | F2006 | |
| Ribonulease B | Sigma | R7884 | |
| Avidin | Sigma | A9275 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503 | |
| Conalbumin | Sigma | C0755 |
References
- Cho, W., Stahelin, R. V. Membrane-protein interactions in cell signaling and membrane trafficking. Annual review of biophysics and biomolecular structure. 34, 119-151 (2005).
- Tadevosyan, A., Vaniotis, G., Allen, B. G., Hebert, T. E., Nattel, S. G. protein-coupled receptor signalling in the cardiac nuclear membrane: evidence and possible roles in physiological and pathophysiological function. The Journal of physiology. 590, 1313-1330 (2012).
- White, S. H. Biophysical dissection of membrane proteins. Nature. 459, 344-346 (2009).
- Heijne, G. Membrane-protein topology. Nature reviews Molecular cell biology. 7, 909-918 (2006).
- Cox, J., Mann, M. Quantitative high-resolution proteomics for data-driven systems biology. Annual review of biochemistry. 80, 273-299 (2011).
- Lamond, A. I., et al. Advancing cell biology through proteomics in space and time (PROSPECTS). Mol Cell Proteomics. 11, (2012).
- Savas, J. N., Stein, B. D., Wu, C. C., Yates 3rd, J. R. Mass spectrometry accelerates membrane protein analysis. Trends in biochemical sciences. 36, 388-396 (2011).
- Sun, B., et al. Shotgun glycopeptide capture approach coupled with mass spectrometry for comprehensive glycoproteomics. Mol Cell Proteomics. 6, 141-149 (2007).
- Lowe, J. B. Glycosylation, immunity, and autoimmunity. Cell. 104, 809-812 (2001).
- Dodds, E. D. Gas-phase dissociation of glycosylated peptide ions. Mass spectrometry reviews. 31, 666-682 (2012).
- Kaji, H., et al. Lectin affinity capture, isotope-coded tagging and mass spectrometry to identify N-linked glycoproteins. Nat Biotechnol. 21, 667-672 (2003).
- Zhang, H., Li, X. J., Martin, D. B., Aebersold, R. Identification and quantification of N-linked glycoproteins using hydrazide chemistry, stable isotope labeling and mass spectrometry. Nat Biotechnol. 21, 660-666 (2003).
- Hagglund, P., Bunkenborg, J., Elortza, F., Jensen, O. N., Roepstorff, P. A new strategy for identification of N-glycosylated proteins and unambiguous assignment of their glycosylation sites using HILIC enrichment and partial deglycosylation. J Proteome Res. 3, 556-566 (2004).
- Bond, M. R., Kohler, J. J. Chemical methods for glycoprotein discovery. Current opinion in chemical biology. 11, 52-58 (2007).
- Pasini, E. M., et al. In-depth analysis of the membrane and cytosolic proteome of red blood cells. Blood. 108, 791-801 (2006).
- Wollscheid, B., et al. Mass-spectrometric identification and relative quantification of N-linked cell surface glycoproteins. Nat Biotechnol. 27, 378-386 (2009).
- Sun, B., et al. N-Glycoproteome of E14.Tg2a mouse embryonic stem cells. PLoS ONE. 8, (2013).
- Sun, B., et al. Glycocapture-assisted global quantitative proteomics (gagQP) reveals multiorgan responses in serum toxicoproteome. J Proteome Res. 12, 2034-2044 (2013).
