Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Glykopeptider Capture för cellytan Proteomics

Published: May 9, 2014 doi: 10.3791/51349

Summary

Cellyteproteiner är biologiskt viktiga och ofta glykosylerade. Vi presenterar här en glykopeptid-capture metod för att lösa, berika och deglycosylate dessa proteiner för facile LC-MS-baserad proteomik analyser.

Abstract

Cellyteproteiner, inklusive extracellulära matrisproteiner, delta i alla större cellulära processer och funktioner, till exempel tillväxt, differentiering och proliferation. En omfattande karakterisering av dessa proteiner ger rik information till biomarkörer, cell-typ identifiering, och drog-mål val, samt hjälpa till att förbättra vår förståelse av cellbiologi och fysiologi. Ytproteiner emellertid utgöra betydande analytiska utmaningar på grund av deras inneboende låga överflöd, hög hydrofobicitet, och tunga posttranslationella modifieringar. Med utnyttjande av den förhärskande glykosylering på ytproteiner, introducerar vi här en hög genomströmning glykopeptid-capture strategi som integrerar fördelarna med flera befintliga N-glycoproteomics medel. Vår metod kan berika glykopeptiderna härrör från ytproteiner och ta bort deras glykaner för facile proteomik som använder LC-MS. Det beslutade N-glycoproteome omfattar information av protein identitet och kvantitet samt deras platser för glykosylering. Metoden har tillämpats på en rad studier inom områden som cancer, stamceller, och läkemedelstoxicitet. Begränsningen i metoden ligger i den låga förekomsten av yt-membranproteiner, så att en relativt stor mängd prover krävs för denna analys jämfört med studier inriktade på cytosoliska proteiner.

Introduction

Cellyteproteiner interagera med den extracellulära miljön och vidarebefordra signaler från utsidan till insidan av en cell. Således är dessa proteiner, innefattande extracellulära matrisproteiner, spela kritiska roller i alla aspekter av cellbiologi och fysiologi i intervallet från proliferation, tillväxt, migration, differentiering mot åldring och så vidare. Ytproteiner fungera genom interaktion med andra celler, proteiner och små molekyler 1-3. Molekylär karakterisering av cellytan proteiner är av stort intresse inte bara för biologer utan även för läkemedelsföretag, eftersom mer än 60% av läkemedel är riktade till cell-ytproteiner 4.

Tandem-masspektrometri (MS), med dess överlägsna känslighet, noggrannhet och genomströmning för identifiering av proteiner och peptider, har varit ett kraftfullt verktyg för globala proteomikstudier 5,6. Ändå ytproteiner utgöra betydande utmaningar för MS-baserad proteomik, somflesta ytproteiner finns i små mängder och med tunga modifikationer. De membranöverbryggande regionerna av ytproteiner göra dem hydrofoba; detta är särskilt fallet för flerstransmembranproteiner. Det är sålunda svårt att lösa membranproteiner i vattenhaltiga lösningar utan hjälp av en detergent; Men användningen av tvättmedel trycker allmänhet prestanda HPLC och MS 1,7,8 i proteinidentifiering. Därför har membranproteiner varit dåligt kännetecknas av direkta LC-MS-baserade proteomik.

Glykosylering är en av de viktigaste och mest överflödande posttranslationella modifieringar som sker i cellyteproteiner 9. Den enorma komplexitet och heterogenitet glykaner hämmar peptider "MS-signalen 10. Ändå har flera proteomik metoder används denna unika modifikation att berika ytproteiner och att ta bort sockerdelar från proteiner före LC-MS-analys. Dessa metods inkluderar lektin-baserade affinitet capture 11 och hydrazid-eller borsyra-baserade kemiska capture 12 samt hydrofila kromatografiska separationer 8,13. Avlägsnandet av glykaner förvandlar membranproteiner till vanliga proteiner och drastiskt förenklar MS karakterisering. Eftersom glykosylering sker även i utsöndrade proteiner som har hög löslighet i motsats till membranproteiner, är många glycoproteomic metoder optimerade för lösliga proteiner, och tenderar att ha lägre glykopeptid selektivitet och känslighet när utplaceras till membranproteiner 8,14. Andra metoder finns också för att berika, särskilt cellytan proteiner, till exempel de som använder ultracentrifugering 15 och märkningsstrategier 16. En detaljerad jämförelse mellan vår metod och andra befintliga metoder för karakterisering av membranproteiner fördes nyligen 17, och resultaten visade att vår metod kan utföra lika bra, om intebättre än alla de jämförda membran proteomik metoder, men med högre enkelhet.

För att hjälpa forskare använder denna metod, vi detalj här en allmän protokoll. Metoden integrerar flera fördelar med befintliga glycoproteomics strategier och är utformade specifikt för membranglykoproteiner, men metoden fungerar lika bra för utsöndrade proteiner. Egenskaperna hos denna metod är: 1) en fullständig solubilisering av membranproteiner, 2) en anrikning av glykopeptider istället av glykoproteiner för att eliminera den potentiella steriska hinder vid användning av ett fast infångnings substrat, 3) användningen av hydrazid kemi för att bilda kovalenta bindningar mellan glykopeptider och den infångande substrat, så att de bundna glykopeptider kan tolerera stringenta tvättar för hög glycoselectivity, och 4) förmåga att genomföra hela infångningsförfarande i ett rör för reducerad förlust provet och förkortade förfarande varaktighet. Efter genomförandet av denna metod för att studera en variabelhället av biologiska prover, inklusive celler och vävnader, observerade vi en hög selektivitet (> 90%) till glykoproteiner 8,17,18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Harvest Membran

  1. Lägg hypoton buffert (10 mM Tris-HCl, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, pH 8,0) med proteasinhibitorcocktail på en cellpellet (~ 10 8 celler) och inkubera under 15-30 minuter på is. Lyse cellerna genom att leda provet genom kanyler (5-10 pass) eller homogenisera provet med en Dounce homogenisator (15-30 slag). Använd en hemocytometer och trypanblått färgning för att kontrollera effektiviteten i lys.
  2. Erhåll den mikrosomala fraktionen av en differentialcentrifugering av lysatet vid 3000 gx 15 min och sedan vid 100000 gx 2 hr. Det första centrifugering erhåller en pellet, som är den nukleära fraktionen och den efterföljande centrifugering av supernatanten genererar en andra pellet, som är den mikrosomala fraktionen som innehåller plasmamembranet liksom membranbundna organeller 8. Den slutliga överstående vätskan är den cytosoliska fraktionen. Lagra de mikrosomala fraktioner i -80 ° C frys för ytterligare analysär såsom anges nedan.

2. Lös, Denaturera och Digest membranproteiner

  1. Upplös den mikrosomala fraktionen i denatureringsbuffert (40 mM Tris, 10 mM EDTA, 10 mM TCEP, 0,5% Rapigest, pH 8) och därefter inkubera lösningen vid 100 ° C under 10 min.
  2. Kyl den upphettade lösningen till rumstemperatur, tillsätt ultrahög renhet urea pulver in i lösningen till 8 M slutlig koncentration och inkubera provet vid 37 ° C under 30 min.
  3. Lägg jodacetamid stamlösning till provet till 15 mM slutlig koncentration och inkubera lösningen i mörker under 30 minuter vid rumstemperatur för att alkylera de fria tiolerna i provet. Lägg DTT stamlösning till provet till 10 mM slutlig koncentration och inkubera lösningen i ytterligare 10 minuter vid rumstemperatur för att släcka det alltför jodacetamid.
  4. Späd ut den erhållna lösningen 10x med 40 mM Tris-buffert vid pH 8, och därefter lägga till trypsin till provet vid ett 1:20 förhållande av trypsin till totalt protein. Bibehåll uppslutningsreaktionen i en 37 ° C ugn över natten för att säkerställa att reaktionen är avslutad.
  5. Terminate uppslutningen genom surgöring av provlösningen till pH 1 med HCl, ett tillstånd som också bryter ner tvättmedel, dvs Rapigest. Försämra Rapigest vid 37 ° C under 1 timme och avlägsna den utvecklade fällning genom centrifugering.
  6. Rengör supernatanten som innehåller exempel peptider med en patron C-18 fast fas extraktion (SPE) och torka den erhållna provet genom speedvac.
  7. Utför en SDS-PAGE-analys av prover före och efter trypsindigerering att bekräfta digere effektivitet.

3. Glykopeptid Capture

  1. Lös de rengjorda peptider i kopplingsbuffert (100 mM natriumacetat, pH 5,5). Lägg natriumperjodat i peptidlösningen vid en 10 mM slutlig koncentration för 30 minuter i mörker, vid rumstemperatur. Detta kommer att oxidera cis-diolgrupper i glykaner till aldehyder, Vilket gör att de glykanerna till paret till hartset genom hydrazid kemi. Släck driven perjodat av natriumsulfit vid en 20 mM slutlig koncentration och pH 5 under 10 min vid rumstemperatur.
  2. Introducera hydrazid-derivatiserade hartset in peptidlösningen i ett förhållande av 01:04 (harts till lösning) för att koppla glykopeptider till hartset. Inkubera reaktionen vid 37 ° C under 1-2 dagar med end-to-end-rotation för fullständig koppling.
  3. Avlägsna de obundna peptidema genom tvättning av hartset två gånger med 1 ml av var och en av följande: Dl-vatten, 1,5 M NaCl, metanol och 80% acetonitril. Slutligen tvätta hartset 3x med 1 ml av 100 mM NH 4 HCO 3 vid pH 8 för att byta ut bufferten för systemet till 100 mM NH4 HCO3.
    1. Samla supernatanten och tvättar för analys av obundna peptider (tillval).
  4. Släpp N-glykopeptider från hartset genom PNGas F i en inkubation över natt vid 37 ° C med enn end-to-end-rotation. Samla de frigjorda peptiderna genom centrifugering och en 80% acetonitril tvätt. Torka den erhållna lösningen i speedvac för LC-MS-analys.

4. Ytterligare Fractionation (tillval)

För att ytterligare förenkla prov komplexitet, fraktionera de erhållna N-glykopeptider. Till exempel, lös upp den torkade peptider i 10 mM ammoniak formiat, pH 3 med 20% acetonitril och använda starka katjonbytare (SCX) kromatografi för fraktionering av peptider. Torka den erhållna elueringsmedel och därefter analysera de erhållna peptidfraktioner genom omvänd fas LC-MS 8,17,18.

5. Rengöring av Släppt N-glykopeptider (tillval)

Om oron stiger för potentiell förorening av peptiderna, lös upp den torkade peptider till 0,1% myrsyra och använda en MCX SPE-kolonn för att ytterligare rengöra peptider före omvänd fas LC-MS-analys.

Under selektiv klyvning av N-glykopeptider off hartset, PNGas F omvandlar den N-glykan länkade asparagin till en asparaginsyra. Därför finns det en 0,9840 Da massförskjutning av de frigjorda N-glykopeptider. För att korrekt identifiera dessa peptider behöver läggas sökparametrarna tillsammans med vanliga modifieringar såsom carbamidomethylation av cystein och oxidation av metionin denna modifiering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En representativ flödesdiagram över den experimentella proceduren sammanfattas i figur 1. Märkningen och ytterligare fraktioneringssteg är valfritt och detaljer beskrivs i en nyligen publicerad 18. Ett annat alternativ är att analysera de omodifierade peptider, som inte reagerar med hartset. Fördelama med att analysera de omodifierade peptiderna är den potentiella identifiering av icke-glykosylerade peptider och proteiner, såsom claudins i tight junctions; en ytterligare fördel är mer exakt kvantifiering. Baserat på dessa fördelar, vi kallas denna metod g lycocapture-a ssisted-g lobal q vantitativa p roteomics (gagQP), och detaljerade analysen i ett senare publikationer 18.

En typisk glykopeptid spektrum tas efter anrikningsmetoden visas i Figur 2. I den erhållna glykopeptid, var den N-glykan avlägsnades och glykan lösa asparagin (N) wsom omvandlas till en asparaginsyra (D) genom PNGas F; Därför kan spektrumet lätt sökt hjälp av någon proteomik sökmotor mot vanliga proteinsekvensdatabaser.

Den fångstmetod kan utvärderas genom kommersiellt tillgängliga modell glykoproteiner innan dess tillämpning med komplexa och värdefulla biologiska prover. Några ofta använda modell glykoproteiner innefattar avidin (kyckling), ovalbumin (kyckling), invertas (jäst), α-1-antitrypsin (människa), konalbumin (kyckling), och ribonukleas B (nötkreatur) (alla kan erhållas från Sigma). De vanligaste identifierade glykopeptider från dessa proteiner finns i en tidigare publikation 8. En skräddarsydd proteinsekvens FASTA databas som är lämplig för automatisk sökning av LC-MS-resultat som genereras från dessa modellproteiner kan laddas ner från medföljande länk (http://www.sfu.ca/chemistry/groups/bingyun_sun/tools.html ), vilket inkluderar de ovan listade modellproteiner, liksom ett varv ersed jäst-sekvensdatabaser, vanliga föroreningar och PNGas F.

Ett typiskt LC-MS-resultat av de infångade N-glykopeptider visas i fig 3, i vilken mer än 100-glykoproteiner kan identifieras från en enda LC-MS-körning av en cell mikrosomal fraktion. Selektiviteten anrikning till både glykoproteiner och glykopeptider är i allmänhet mer än 90%. En lyckad analys kan ha en anriknings selektiviteten 95%. Använda en SCX-kolonn och steggradient att ytterligare fraktionera proverna före LC-MS-analyser kommer vanligtvis fördubbla antalet glykoprotein identifikationer 17. Ibland, när mängden av de erhållna glykopeptider är låg, kan observeras oren ackumulerat från flaskorna i det slutliga urvalet. Dessa föroreningar kan avlägsnas genom den metod som anges i steg 5.

. Jpg "src =" / files/ftp_upload/51349/51349fig1.jpg "width =" 350 "/>
Figur 1. Flödesschema för den experimentella proceduren. Rektanglar krävs åtgärder och diamanter är valfria steg.

Figur 2
Figur 2. Kollision dissociation (CID) spektrum av AEPIL N ISNAGPWSR från Bagerijäst efter glykopeptiden-fångstmetod. Den strukna asparagin (N) omvandlas till asparaginsyra (D) som markeras med rött i peptidsekvensen i figuren .

Figur 3
Figur 3. 2D plot av LC-MS till följd av den N-glycopeptides erhållna från mus embryonala stamceller (E14.Tg2a). Prickarna är upptäckta peptiderna, och färgen på pricken representerar identifierings förtroende erhållits statistiskt (dvs. peptid sannolikhet).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här presenterar vi ett glykopeptid-capture strategi för profilering cell-ytproteiner. Förfarandet kan tillämpas för att studera utsöndrade proteiner, såsom de i blod, såväl som i andra kroppsvätskor eller i cellodlingsmedia.

Framgången med den metod förlitar sig på fullständig digerering av prover; därför är en SDS-PAGE-karakterisering av matsmältning effektivitet nödvändig, särskilt för förstagångs analys av ett prov. En fullständig nedbrytning kan vara en utmaning för membranproteiner, och kan endast vara möjlig efter noggrann upplösning av membranfraktionen. Solubiliseringen processen börjar när detergenten införes och slutar efter inkuberingen av karbamid. Därför, om grumlighet presenteras i provet före tillsättningen av urea, men försvinner efter karbamid inkubation, är solubiliseringen tillräcklig. Om membranfraktionen är svåra att lösa upp, öka mängden tvättmedel som används. För membranrika vävnadsproversåsom hjärn-och fettvävnad, kan 5% Rapigest utnyttjas. Ibland kan nederbörden visas under spädning av prover före trypsin matsmältningen, vilket är mer frekvent för mänskliga serumprover. Orsaken till denna nederbörd är främst den minskade koncentrationer av urea-och rengöringsmedel. Denna nederbörden kommer i allmänhet avlägsnas genom trypsin under matsmältningen och är inte ett bekymmer. Men när nederbörds former, är det viktigt att rotera provflaskan under digereringssteget för att säkerställa en bra blandning. PH för glycocapture steg är viktigt eftersom de primära aminerna i peptider, såsom de från N-terminaler och lysiner, kommer att reagera med de nybildade aldehyder efter perjodatoxidation. Således är det viktigt att protonera dessa aminer genom att justera pH för den infångade lösningen till under 6,0 genom att använda acetat-buffert, för att hindra dem från att störa infångning.

Med hjälp av ett förhållande av harts för att fånga lösningen enrunt 1:03 till 1:04 säkerställer tillräcklig blandning under insamlingssteget. Minst 50 l av plast är nödvändig baserat på vår erfarenhet; mindre mängder kommer att göra den efterföljande serie av tvättningar svåra att utföra och kommer att införa sträng provförlust på grund av förlusten av harts. Vi har erhållit goda resultat med användning av 100 till 300 | il av harts för 0,5-2 mg totalt protein. Däremot kan förhållandet mellan mängden protein och harts vara provberoende, vi rekommenderar att du optimerar detta villkor för dina specifika prov och applikationer.

Hydraziden kemi fångar båda O-och N-kopplade glykopeptider på substratet; på grund av avsaknaden av ett effektivt enzym för att frigöra alla O-kopplade glykopeptider, bara använde vi PNGas F för N-glykopeptidantibiotika studier 8,12. Möjligheten att studera O-typen av glykopeptider kan kräva upptäckten eller bioteknik lämpliga hydrolaser.

Denna metod kan pausas på flera pskosnören inklusive: 1) efter att ha erhållit den membranfraktion, 2) efter trypsin-digestion och rening av peptidema, och 3) efter utlösning av N-glykopeptider. Ytterligare förfaranden kan införas under dessa intervaller. Till exempel kan de spjälkade peptiderna differentiellt märkta genom N-isotags såsom anges i fig. 1, för kvantitativ analys. Med hjälp av en metod som kallas gagQP, i vilken de omodifierade peptiderna analyseras parallellt med de glykopeptider, kan noggrannheten för kvantifiering förbättras avsevärt såsom vi visat i en nyare publikation 18.

Glykopeptid capture självt effektivt kan minska provets komplexitet, och det är i allmänhet inte nödvändigt att ytterligare fraktionera de anrikade N-glykopeptider. Undantag gäller för situationer där proverna är rikligt men med stora koncentrationsdynamik, och proteiner av intresse är i låga överflöd, till exempel i upptäckten av blod proteinbiomarkers ellerför en fullständig undersökning av cellytan proteiner. Under dessa omständigheter ytterligare fraktionering kan genomföras för de fängslade N-glykopeptider för att ge en bättre bearbetning av glycoproteome. Som botten av glycoproteome är nått genom fraktionering, kommer att identifiera icke-glykopeptider som införts av ospecifik bindning öka. Alltså en minskning med glykopeptider och glykoprotein selektivitet (till ~ 85%) kommer vanligtvis observeras efter ytterligare fraktionering av N-glykopeptider 17. Därför forskare måste väga för-och nackdelar när man utformar den mest lämpliga förfarandet.

För forskare som aldrig använt en N-glykopeptid-capture-metoden, är det bäst att praktisera metoden med några rent N-glykoprotein (er) med kända glykosyleringsställen som tidigare 8 listade. Denna metod är robust och selektiviteten till N-glykopeptider är hög. En nackdel med denna metod ligger i den inneboende låga överflödet av suransikte N-glykoproteiner; för en omfattande karakterisering av provet, är större mängd allmänhet krävs än för cytosoliska proteomik. Men om odlade celler kan expanderas in vitro eller vävnaderna av intresse finns i överflöd, är denna nackdel försumbar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Denna forskning har fått stöd av startfonden av Simon Fraser University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DTT Sigma 646563
TCEP Sigma 646547
Iodoacetamide Sigma A3221
Rapigest SF Waters 186001860
Sodium periodate Sigma 311448
PNGase F New England Biolabs P0704S
Affi-Gel Hz hydrazide gel Bio-Rad 153-6047
Trypsin Worthington Biomedical LS02115
Sep-Pak C-18 cartridge Waters WAT054955
Oasis MCX cartridge Waters 186000252
Protease inhibitor coctail Sigma P8340
Urea Amersco 568
Sodium sulphite Caledon 8360-1
Invertase Sigma I0408
α-1 trypsin Sigma F2006
Ribonulease B Sigma R7884
Avidin Sigma A9275
Ovalbumin Sigma A5503
Conalbumin Sigma C0755

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cho, W., Stahelin, R. V. Membrane-protein interactions in cell signaling and membrane trafficking. Annual review of biophysics and biomolecular structure. 34, 119-151 (2005).
  2. Tadevosyan, A., Vaniotis, G., Allen, B. G., Hebert, T. E., Nattel, S. G. protein-coupled receptor signalling in the cardiac nuclear membrane: evidence and possible roles in physiological and pathophysiological function. The Journal of physiology. 590, 1313-1330 (2012).
  3. White, S. H. Biophysical dissection of membrane proteins. Nature. 459, 344-346 (2009).
  4. Heijne, G. Membrane-protein topology. Nature reviews Molecular cell biology. 7, 909-918 (2006).
  5. Cox, J., Mann, M. Quantitative high-resolution proteomics for data-driven systems biology. Annual review of biochemistry. 80, 273-299 (2011).
  6. Lamond, A. I., et al. Advancing cell biology through proteomics in space and time (PROSPECTS). Mol Cell Proteomics. 11, (2012).
  7. Savas, J. N., Stein, B. D., Wu, C. C., Yates 3rd, J. R. Mass spectrometry accelerates membrane protein analysis. Trends in biochemical sciences. 36, 388-396 (2011).
  8. Sun, B., et al. Shotgun glycopeptide capture approach coupled with mass spectrometry for comprehensive glycoproteomics. Mol Cell Proteomics. 6, 141-149 (2007).
  9. Lowe, J. B. Glycosylation, immunity, and autoimmunity. Cell. 104, 809-812 (2001).
  10. Dodds, E. D. Gas-phase dissociation of glycosylated peptide ions. Mass spectrometry reviews. 31, 666-682 (2012).
  11. Kaji, H., et al. Lectin affinity capture, isotope-coded tagging and mass spectrometry to identify N-linked glycoproteins. Nat Biotechnol. 21, 667-672 (2003).
  12. Zhang, H., Li, X. J., Martin, D. B., Aebersold, R. Identification and quantification of N-linked glycoproteins using hydrazide chemistry, stable isotope labeling and mass spectrometry. Nat Biotechnol. 21, 660-666 (2003).
  13. Hagglund, P., Bunkenborg, J., Elortza, F., Jensen, O. N., Roepstorff, P. A new strategy for identification of N-glycosylated proteins and unambiguous assignment of their glycosylation sites using HILIC enrichment and partial deglycosylation. J Proteome Res. 3, 556-566 (2004).
  14. Bond, M. R., Kohler, J. J. Chemical methods for glycoprotein discovery. Current opinion in chemical biology. 11, 52-58 (2007).
  15. Pasini, E. M., et al. In-depth analysis of the membrane and cytosolic proteome of red blood cells. Blood. 108, 791-801 (2006).
  16. Wollscheid, B., et al. Mass-spectrometric identification and relative quantification of N-linked cell surface glycoproteins. Nat Biotechnol. 27, 378-386 (2009).
  17. Sun, B., et al. N-Glycoproteome of E14.Tg2a mouse embryonic stem cells. PLoS ONE. 8, (2013).
  18. Sun, B., et al. Glycocapture-assisted global quantitative proteomics (gagQP) reveals multiorgan responses in serum toxicoproteome. J Proteome Res. 12, 2034-2044 (2013).

Tags

Molecular Biology membranprotein N-kopplat glykoprotein post-translationell modifiering masspektrometri HPLC hydrazid kemi N-glycoproteomics glykopeptid infångnings
Glykopeptider Capture för cellytan Proteomics
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, M. C. G., Sun, B. GlycopeptideMore

Lee, M. C. G., Sun, B. Glycopeptide Capture for Cell Surface Proteomics. J. Vis. Exp. (87), e51349, doi:10.3791/51349 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter