Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

تقييم الأوعية الدموية التجديد في الجهاز العصبي المركزي عن طريق الماوس الشبكية

doi: 10.3791/51351 Published: June 23, 2014

Summary

منذ فترة طويلة معترف بها شبكية العين القوارض باعتبارها نافذة للوصول إلى الدماغ. في هذه الورقة التقنية التي نقدمها البروتوكول الذي يستخدم نموذج الفأر من اعتلال الشبكية الناجم عن الأكسجين لدراسة الآليات التي تؤدي إلى فشل تجديد الأوعية الدموية داخل الجهاز العصبي المركزي بعد الإصابة الدماغية. ويمكن أيضا وصف النظام تسخيرها لاستكشاف استراتيجيات لتعزيز إعادة نمو الأوعية الدموية وظيفية داخل شبكية العين والجهاز العصبي المركزي.

Abstract

شبكية العين القوارض وربما كان النظام في متناول معظم الثدييات التي للتحقيق التفاعل وعائية عصبية في الجهاز العصبي المركزي (CNS). يتزايد الاعتراف بأن العديد من الأمراض العصبية مثل مرض الزهايمر والتصلب المتعدد، وعناصر التصلب الوحشي الضموري الحالية للتسوية الأوعية الدموية. بالإضافة إلى ذلك، تتميز أبرز أسباب العمى في السكان في سن العمل للأطفال و(اعتلال الشبكية الخداج واعتلال الشبكية السكري، على التوالي) من خلال تنكس الأوعية الدموية وفشل الفسيولوجية إعادة نمو الأوعية الدموية. الهدف من هذه الورقة التقنية هو توفير بروتوكول مفصلة لدراسة الجهاز العصبي المركزي الأوعية الدموية في شبكية العين التجديد. طريقة يمكن استخدامها لتوضيح الآليات الجزيئية التي تؤدي إلى فشل نمو الأوعية الدموية بعد الإصابة الدماغية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استكشاف طرائق العلاجية المحتملة لتسريع واستعادة الضفائر الأوعية الدموية صحية. النتائج obtaineد باستخدام النهج المبين قد توفر السبل العلاجية لretinopathies الدماغية مثل مرض السكري أو أن الخداج وربما تستفيد اضطرابات الأوعية الدموية الأخرى في الجهاز العصبي المركزي.

Introduction

خلال مراحل تطوره العصبي المركزي والأعصاب والخلايا المناعية والأوعية الدموية بشكل ملحوظ إلى جانب إنشاء شبكات لضمان نضح الأنسجة كافية وتسمح نقل المعلومات الحسية 1-5. يتم التعرف على نتائج انهيار النظم الأوعية الدموية في الأنسجة الأوكسجين غير كافية والعرض الأيضي للخطر وبشكل متزايد باعتبارها مساهما هاما في التسبب في أمراض الاعصاب 6. التسرب الأوعية الدموية وتدهور وحدة وعائية عصبية في الدماغ، على سبيل المثال، يرتبط الخرف الوعائي، والآفات الوعائية من المادة البيضاء في الدماغ 7 ومرض الزهايمر مع تضيق في الشرايين والأوعية الصغيرة 8. بالإضافة إلى ذلك، يعتقد اختلال وظيفة الحاجز الوعائي للمساهمة التصلب المتعدد 9 وتصلب الأنسجة العضلية الجانبية 10.

صلة مباشرة لنموذج الشبكية الموصوفة في هذا البروتوكول، والمسببة للعمىأمراض مثل اعتلال الشبكية السكري واعتلال الشبكية 11 من 12 الخداج، وتتميز من خلال 13 مرحلة من أوائل تنكس الأوعية الدموية. الإجهاد الدماغية التي تلت ذلك على شبكية العين وعائية عصبية يتسبب في المرحلة الثانية من اتساع الأوعية الدموية المفرطة والمرضية التي من المرجح ينشأ كرد فعل التعويضية للأوكسجين بإعادة العمل وإمدادات الطاقة 14-16. استراتيجية جذابة للتغلب على الإجهاد الدماغية التي أمر أساسي لتطور المرض هو استعادة شبكات الأوعية الدموية الوظيفية بشكل خاص في المناطق الدماغية من العصبية الشبكية (الشكلين 2 و 3). تثير استجابة عائية تسيطر قد تأتي عبر وغير بديهية للحالة يكون فيها العلاجات المضادة للعائية مثل مكافحة VEGFs تعتبر العلاجات تكييفها. حتى الآن، والدليل على صحة هذا النهج هو في تصاعد مستمر. على سبيل المثال، وتعزيز "الفسيولوجية مثل" إعادة نمو الأوعية الدموية في ischemوقد تجلى retinopathies جيم بأناقة من خلال إدخال الخلايا البطانية السلائف 17، وتثبيط VEGF-مولر أعرب خلية downregulation الناجم عن عوامل أخرى عائية 18، حقن الأسلاف النخاعي 19، وتثبيط NADPH أوكسيديز يسببها موت الخلايا المبرمج 20، وزيادة الغذائية ω-3 الدهنية غير المشبعة تناول حمض 21، والمعاملة مع شظية-الكربوكسيل الطرفية من التربتوفان الحمض الريبي النووي النقال مخلقة 22، والإدارة المباشرة للVEGF أو FGF-2 لحماية الخلايا الدبقية 23. علاوة على ذلك، لقد أثبتنا أن تحوير الكلاسيكية العظة التوجيه العصبية مثل Semaphorins أو Netrins في retinopathies الدماغية الوعائية يسرع تجديد الأوعية صحية داخل شبكية العين والأوعية الدموية يقلل المرضية 24 و 25 بالتالي. من الأهمية السريرية المباشرة، فإن العديد من الدراسات على الحيوانات المذكورة أعلاه توفر أدلة على أن تعزيز إعادة الأوعية الدمويةالجيل خلال المرحلة الأولى من retinopathies الدماغية يمكن أن تقلل إلى حد كبير التي تهدد البصر اتساع الأوعية الدموية في شبكية العين قبل 19، 23، 24، 26، من المحتمل من خلال الحد من عبء الدماغية.

وضع الاستراتيجيات العلاجية التي تحفز تجديد السفن وظيفية لا يزال يشكل تحديا كبيرا للعلماء البيولوجيا الوعائية. نحن هنا تصف نظام التجريبية التي توظف نموذج الفأر من اعتلال الشبكية الناجم عن الأكسجين (OIR) لاستكشاف استراتيجيات لإعادة نمو الأوعية الدموية تعدل داخل شبكية العين. التي وضعتها سميث وآخرون في عام 1994 27، ويقدم هذا النموذج كبديل لretinopathies التكاثري الإنسان ويتكون من تعريض الجراء P7 الماوس إلى 75٪ O 2 حتى P12 ثم إعادة إدخال الجراء إلى الغرفة المحيطة O 2 التوتر (الشكل 1). هذا النموذج يحاكي سيناريو فضفاضة حيث التهوية الرضع والخدج مع O 2. تعرض الجراء الماوس لفرط التأكسج يثير تنكس الشبكية والأوعية الدموية الدقيقة الشعيرات الدموية، وتعطي المجال استنساخه من الوعاء-الطمس (VO) المقررة عادة عند الخروج من O 2 في P12، على الرغم من أن يتم التوصل منطقة VO القصوى في 48 ساعة (P9) بعد التعرض لO 2 28. في الماوس، ومناطق VO اوعائي تجديد بصورة تلقائية على مدار الأسبوع التالي لإعادة إدخال هواء الغرفة والمناطق في نهاية المطاف VO يتم الانتهاء من إعادة أوعية دموية (الشكل 2). إعادة مقدمة لهواء الغرفة من الفئران تعرض لOIR أيضا يثير اتساع الأوعية الدموية في شبكية العين قبل (NV) (القصوى في P17) أن يتم تقييم عادة لتحديد مدى فعالية العلاج المضاد للنماذج عائية. في أنقى صورها، ويقدم نموذج OIR أداة تكرار للغاية وقابلة للقياس لتقييم الأوكسجين الناجم عن تنكس الأوعية الدموية وتحديد مدى اتساع الأوعية الدموية المدمرة قبل الشبكية 29-31.

ق ق = "jove_content"> مختلف نماذج العلاج الاستكشافية التي تعدل الجهاز العصبي المركزي الأوعية الدموية التجديد يمكن التحقيق باستخدام نموذج OIR بما في ذلك استخدام المركبات الدوائية، والعلاج الجيني، حذف الجينات وأكثر من ذلك. الميل لنهج معين للتأثير على إعادة نمو الأوعية الدموية ويتم تقييم تدريجي في الإطار بين P12 (VO القصوى بعد الخروج من فرط التأكسج) وP17 (NV القصوى). تقييم نتائج العلاج على NV المرضية يمكن بسرعة وبسهولة تحديد بالتوازي ولقد وصفت بدقة من قبل ستال وزملاؤه 30، 31. هنا نقدم خطوة بخطوة إجراء بسيط للتحقيق في التشكيل من عودة التوعي الفسيولوجية داخل الشبكية العصبية بواسطة مركبات الدوائية، المداواة المحتملين، ناقلات فيروسية أو لدراسة تأثير الجينات المعدلة وراثيا أو مرشح في خروج المغلوب الفئران.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

بيان الأخلاق: جميع التجارب على الحيوانات تلتزم المبادئ التوجيهية رعاية الحيوان التي وضعتها جمعية للبحوث في مجال طب العيون والرؤية (ARVO) بيان لاستخدام الحيوانات في العيون والبحوث الرؤية والمجلس الكندي للرعاية الحيوان.

1. الأكسجين المستحثة اعتلال الشبكية (OIR)

  1. تاريخ سجل ولادة الجراء الماوس كما P0.
  2. تسجيل جميع أوزان الحيوانات عند الدخول إلى O 2 لضمان وجود نطاق الوزن الكافي. ملاحظة: للحصول على C57BL / 6 الفئران في P17، يجب وزن الجسم تتراوح بين 5 و 7.5 غرام للNV القصوى 32. من أجل الحفاظ على الاتساق البيئي، فمن المستحسن استخدام تتزاحم عن السيطرة (على الفئران المعدلة وراثيا، وكذلك الفئران تلقي علاجات تجريبية). عند تقييم الآثار المترتبة على ناقلات فيروسية، لا بد من النظر tropism من الفيروسات وإتاحة الوقت الكافي للتعبير كاملة من الجينات المحورة تسليم فيروسي. معربا بسرعة الفيروسيةناقلات مثل الجيل الثالث 3 lentiviruses 24، 25، 33 ويوصى.
  3. الجراء مكان الماوس في P7 (C57BL / 6 أو المطلوب سلالة) وCD1 تعزيز الأم الى غرفة الأوكسجين وضعت في 75٪ O 2 لمدة 5 أيام 27. عقدت الرطوبة البيئية ودرجة حرارة ثابتة طوال O 2 التعرض. ملاحظة: مرافق أبحاث مجهزة مصدر مركزي للO 2 هي مثالية والحد من استبدال مرهقة يا فارغ 2 الدبابات. إذا كان يعمل مع المعدلة وراثيا أو خروج المغلوب الفئران، فمن المهم لضمان أن يتم الحصول على السيطرة والفئران التجريبية من نفس المورد للحد من الانجرافات الوراثية داخل نفس سلالات 30، 29.
  4. في P12، وإزالة الفئران من غرفة الأوكسجين والعودة إلى الحيوانات المحيطة بناء O 2.

2. حقن Intravitreal لتسليم المركبات إلى شبكية العين الداخلية (واطآثار أون تقييم من مجمع الدوائية أو البروتين المؤتلف)

  1. في P14، تخدير الفئران مع 2٪ isoflurane والأوكسجين في 2 لتر / دقيقة (أو حماية الحيوان وافقت عليها لجنة الاختيار مخدر). من أجل التحقق من فعالية التخدير، قرصة بالتتابع الذيل، القدم الخلفية والأذن مع ملقط.
  2. ضع الماوس على بطنه.
  3. باستخدام العقيمة 10 ميكرولتر حقنة مزودة إبرة مشطوف سحبت من الزجاج، نفذ حقنة من حجم القصوى من 1 ميكرولتر من محلول يحتوي على مركب يجري التحقيق أو مركبة (المالحة الفسيولوجية) في حوف الخلفي من العين، مع 45 درجة زاوية تجنب العدسة. ملاحظة: يتم إرفاق سحبت الزجاج الإبرة إلى حقنة باستخدام قطرة من الايبوكسي الراتنج.
  4. تطبيق قطرة من مرهم للعين زيوت التشحيم (مثالي مع المضادات الحيوية) مع مسحة إلى العين الفأر.
  5. عودة الماوس إلى القفص مع تعزيز الأم. ثم يتم رصدها بعناية الفئران حتى إعادةغطت والإسعافية بالكامل.

3. تقييم الإرواء السفينة والجدار وظيفة (النزاهة) من خلال تصوير الأوعية الدموية فلوريسئين

  1. تخدير الفئران مع 2٪ isoflurane والأوكسجين في 2 لتر / دقيقة (أو حماية الحيوان وافقت عليها لجنة الاختيار مخدر). من أجل التحقق من فعالية التخدير، قرصة بالتتابع الذيل، القدم الخلفية والأذن مع ملقط. ملاحظة: عادة ما يتم تنفيذ ذلك في P17 عندما يتم تقييم التجدد. أيضا، إجراء التحليل في P19 وP21 لتحديد ما إذا كان الحفاظ على سلامة الأوعية الدموية على مر الزمن.
  2. مرة واحدة تخدير، تزن الماوس.
  3. جعل شق البطن خط الوسط مع مقص تشريح. ملاحظة: يجب أن يتم التحقق بانتظام أدوات تشريح وشحذ.
  4. خفض أضلاعه أفقيا ورفع القفص الصدري بمساعدة ملقط. ملاحظة: من الضروري لخفض كما أفقيا وقت ممكن لتجنب الضرر إلى القلب.
  5. بعد إزالة peripهيرال الأنسجة من القلب، المشبك الشريان الأورطي النازل مع ملقط مرقئ.
  6. حقن ببطء فلوريسئين ديكستران إلى البطين الأيسر باستخدام إبرة G 25. ملاحظة: إذا تم التحقيق في وظيفة الحاجز الأوعية الدموية، ويعمل 70 كيلو دالتون ديكستران فلوريسئين-لأنها سوف يتسرب من السفن عندما يتم المساس سلامة السفينة. إذا كان المحقق يريد أن يلقي الأوعية الدموية، ويستخدم 2 MDA-فلوريسئين ديكستران. الخطوات الحاسمة: 1) لضمان إعادة تقسيم متجانسة، الطرد المركزي فلوريسئين-ديكستران وحقن طاف، 2) من أجل منع انقباض الأوعية، وضخ تحسنت حل فلوريسئين ديكستران، ينبغي 3) وقتها التداول لا تتجاوز 4 دقائق.
  7. قطع رأس الفئران 2 دقيقة بعد الحقن مع مقص التشغيل.

4. سمل العيون وتثبيت

ملاحظة: عند تقييم معدلات تجديد الأوعية الدموية، وجمع الأولى في شبكية العين P12 وبالإضافة إلى ذلك في P14 وP17. زيادة عدد عينات نقطة زمنيةو لتحديد أكثر دقة لمعدلات عودة التوعي 24.

  1. إمالة الرأس الماوس ووضعه على جانبها.
  2. إزالة الجلد والجفون تغطي العين باستخدام مقص تشريح.
  3. وضع ملقط المنحني تحت العين واسحبه برفق حتى يتم قطع العصب البصري.
  4. بدوره رئيس الماوس، على الجانب الآخر، وتؤدي نفس الخطوات (الخطوات 4.2 و 4.3).
  5. لضمان انتشار أفضل من تثبيتي، ثقب حفرة في الغرفة الأمامية للعين باستخدام إبرة G 30.
  6. نقل العينين إلى أنبوب يحتوي على 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) وإصلاح لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  7. إزالة PFA وتغسل العينين 4 مرات بمحلول PBS الجليد الباردة.

5. تشريح الشبكية

  1. وضع عيون الماوس في طبق بتري تحتوي على برنامج تلفزيوني الباردة وأداء تشريح شبكية العين تحت stereomicroscope.
  2. إزالة الدهون الزائدة / الأنسجة المحيطة بالعين مع تشريح الدقيقة الخيال العلميssors.
  3. قطع القرنية مع مقص تشريح الدقيقة.
  4. باستخدام اثنين من أزواج من ملقط، قشر بدقة الصلبة بعيدا عن محيط نحو العصب البصري وتجاهل.
  5. قرصة عدسة (الكرة بيضاء تحت القرنية) مع ملقط واستخراجها من كأس العين. استخدام زوج واحد من الملقط كوسيلة لدعم، والآخر لقبضة ورفع بعناية وإزالة العدسة.
  6. فصل الأوعية الزجاجية من الجانب الداخلي من شبكية العين باستخدام فرشاة صغيرة (حجم 0) وملقط.
  7. إزالة حزم من الأوعية الزجاجية متصلة القرص البصري باستخدام ملقط.
  8. نقل تشريح شبكية العين إلى 2 مل أنابيب microcentrifuge تحتوي PBS ومكان على الجليد قبل بدء الإجراء تلطيخ.

6. الشبكية الوعائية تلطيخ

  1. احتضان شبكية العين تشريح ليلة وضحاها مع طيف تهتز في 4 درجات مئوية في حل من جانب fluorescently-isolectin B4 (رودامين-كتين أو غيرها) في برنامج تلفزيوني يحتوي على 1 مم CaCl 2
  2. في اليوم التالي، وإزالة حل تلطيخ وغسل 3X شبكية العين في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

7. إعداد الشبكية Flatmounts

  1. نقل شبكية العين، من جانب مبصرة أسفل، على شريحة المجهر وجعل أربعة شقوق عميقة شعاعي على مسافة واحدة باستخدام مشرط جراحي لتقسيم شبكية العين إلى أربعة أجزاء متساوية الحجم. خلال شقوق، يستعدوا شبكية العين مع فرشاة بحيث لا يتحرك.
  2. باستخدام اثنين من فرش غارقة في برنامج تلفزيوني، تتسطح بعناية الأرباع مبصرة الجانب إلى أسفل وتزج شبكية العين في تصاعد المتوسطة لمنع الصور تبيض. ثم ضع بعناية ساترة على سطح الشبكية التي شنت دون تطبيق الضغط والتأكد من أن فقاعات الهواء لا تتراكم تحت الغطاء زلة. </ لى>

8. التصوير والكمي لVasoobliteration (VO)، واتساع الأوعية الدموية (NV) كما هو موضح سابقا 31

  1. التقاط صور لشبكية العين كلها محمولة مع برنامج التحصين الموسع ومضان المجهر في التكبير من 10X.
  2. فتح الصورة الشبكية في برامج تحرير الصور، غرزة معا وقياس إجمالي المساحة في شبكية العين، والمنطقة اوعائي. ويمكن التعبير عن المنطقة بالبكسل.
  3. تحديد مدى VO بقسمة عدد البكسل في منطقة اوعائي من قبل عدد من وحدات البكسل في مجموع منطقة الشبكية.
  4. تحديد مدى NV بقسمة عدد وحدات البكسل من NV من قبل عدد من وحدات البكسل في مجموع منطقة شبكية العين كما هو موضح 31.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويستخدم نموذج OIR على نطاق واسع لدراسة الأوعية الدموية الأكسجين الناجم عن تنكس والناجم عن نقص التروية اتساع الأوعية الدموية المرضية في شبكية العين وقامت بدور فعال في تطوير يعملون حاليا العلاجات المضادة للعائية لأمراض العين 27، 29، 30. النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام هذا النموذج يمكن استقراء فضفاضة لretinopathies الدماغية مثل اعتلال الشبكية السكري التكاثري واعتلال الشبكية الخداج 30.

نحن هنا يقدم البديل استخدام هذا النموذج لدراسة تجديد الأوعية الدموية. سنقوم بشرح مثال على استراتيجية لتجديد الشبكية الدماغية التي نشرت مؤخرا من قبل المختبر. في الدراسة التي قدمت، علينا أن نظهر أن نقص تروية العصبية مستمرة ينشط الشبكة الإندوبلازمية (ER) الإجهاد وعبر واحد من endoribonucleases المستجيب لها IRE1α، يشق مرنا من الكلاسيكية جديلة التوجيه العصبية netrin-1. نعرضأن البينية العين تسليم Netrin-1، ويحفز برنامج تعويضية في الأوعية الدموية في شبكية العين خلايا الدم النخاعي، وبالتالي يسرع عودة التوعي الأنسجة العصبية بعد OIR 25. وعلاوة على ذلك، ونحن نقدم مثالا على تسارع تجديد الأوعية الدموية باستخدام lentiviral بوساطة إسكات IRE1α.

النماذج التجريبية وصفها يمكن تعديلها التحقيق في معاملة الاستكشافية في الاختيار. الأهم من ذلك، يتم تحديد نقطة زمنية الحقن intravitreal استنادا إلى طبيعة المجمع استكشاف ويجب أن تأخذ في الاعتبار الآلية التي يعمل العلاج التحقيق. على سبيل المثال، لدراسة مركب الدوائية (مستقبلات ناهض، خصم، الخ)، ويمكن اختيار P14 كما يتوافق مع نقطة زمنية حيث عودة التوعي الشبكية يتسارع بعد التدخل السريع المفعول قد تساعد في تسريع معدل عودة التوعي (أرقام 2 و a3). عندما النواقل الفيروسية هيالعاملين، يجب أن يتم تخصيص ما يكفي من الوقت للسماح للتعبير كاملة من الجينات الركاب ونقطة وقت سابق قد يتم اختيارها لضمان التعبير الكامل للالتحوير أو إسكات كاملة من الجينات المستهدفة (الشكل 4). هي مناسبة ناقلات lentiviral تستند بشكل خاص في هذا الصدد بسبب التعبير السريع، والاستجابة الالتهابية المنخفضة وسهولة الإنتاج 24 و 25. ومن الضروري أيضا التأكد من أن يتم تسليم هذا الجين المستهدف للسكان خلايا شبكية المناسب (RGC، الخلية البطانية، مولر الخليوي، الخ)، وبالتالي يجب النظر في tropism من ناقلات فيروسية المحدد. بدلا من ذلك، ودراسة دور الجينات في تجديد الأوعية الدموية باستخدام المعدلة وراثيا أو خروج المغلوب الحيوانات يوفر ميزة عدم الحاجة إلى إجراء الحقن داخل العين.

الشكل 1 الشكل 1. تصوير تخطيطي لنموذج OIR الماوس يتعرض لها. الجراء ماوس والأمهات المرضعات إلى 75٪ O 2 من P7 إلى P12. مطلوب غرفة الأكسجين التهوية مع ثابت O 2 التسليم ومقياس التأكسج. خلال هذه الفترة الأولية، يحدث في الشبكية الوعاء-الطمس. في P12، يتم إرجاع الفئران لهواء الغرفة (21٪ O 2) حتى عندما يحدث P17 القصوى المرضية تلمم قبل الشبكية. اتساع الأوعية الدموية يتراجع خلال الأيام التالية. الفترة المثالية لتحقيق تجديد الأوعية الدموية هو الإطار بين P12 وP17. أخذ العينات وتقييم العديد من النقاط الزمنية لمدى الوعاء-الطمس هو المفتاح لتوضيح دقيق لمعدلات عودة التوعي.

الرقم 2
الشكل 2. وقت أثناء عودة التوعي الشبكية التالية التي يسببها الأكسجين الوعاء-obliteالتموينية. A) تصوير جرافيك إجراء flatmounting الشبكية. يتم إجراء شق خلال الجزء العلوي من القرنية (قبة الأسود والرمادي) والصلبة (خطوط حمراء منقطة) ومازحت شبكية العين خارج. العدسة يمكن استخراجها إما بعد فتح القرنية / الصلبة أو مرة واحدة تتم إزالة الصلبة كما هو مبين في الرسم البياني. ثم يتم إزالة الأوعية الزجاجية وتلطيخ الأوعية الشبكية التي يؤدونها. بعد الانتهاء بروتوكول تلطيخ، ثم يتم قطع الشبكية إلى 4 أقسام متباعدة بالتساوي وتوضع على شريحة المجهر السفينة من جانب المتابعة. B) كتين الملون شبكية العين flatmount من الفئران تعرض لOIR. كما السفن تجديد، مجال الوعاء-الطمس (هنا القصوى في P12) يملأ فيها اتساع الأوعية الدموية المرضية هي القصوى في P17 ويظهر على شكل بقع ملطخة كتين المشبعة في شبكية العين OIR. بواسطة P19-P21، وشبكية العين مجدد بالكامل شبكاتهم الأوعية الدموية. (تم تعديل هذا الرقم من بينيه وآخرون. استقلاب الخلية 2013 25)

<ع الطبقة = "jove_content" FO: المحافظة على together.within صفحة = "دائما"> الرقم 3
. الشكل 3 مثال على العلاج عن طريق الحقن أن يسرع تجديد الأوعية الدموية في شبكية العين: Netrin-1. أ) يتم حقن Netrin-1 في P14 ومدى إعادة نمو الأوعية الدموية في تقييم P17. ويلاحظ وجود زيادة في الجرعة التي تعتمد على تجديد الأوعية الدموية. يمكن تقييم سلامة B) عن طريق الأوعية الدموية نضح مع انخفاض الوزن الجزيئي ديكستران الفلورسنت. إذا تبين السفن ظيفة حاجز للخطر، فإن ديكستران الفلورسنت تسرب خارج السفينة (السهام). (تم تعديل هذا الرقم من بينيه وآخرون. استقلاب الخلية 2013 25)

الرقم 4
الشكل 4. مثال لإسكات الجينات وايتسليم lentiviral عشر shRNAs لتجديد الأوعية الدموية في شبكية العين: Lv.shIRE1α لتقييم قدرة إسكات الجينات في الخلايا العصبية من IRE1α العقدة الشبكية لمساعدة تجديد الأوعية الدموية، تم حقن حقنة intravitreal من الترميز الفيروسة البطيئة لshIRE1α في P3 لإتاحة الوقت الكافي لإسكات الجينات عندما يتم تقييم نمو الأوعية الدموية والوعاء-الطمس. والفيروسة البطيئة الجيل الثالث 3 الذين يعملون في هذا المثال يحتوي على بروتين سكري فيروس التهاب الفم الحويصلي تعديل (VSV-G)، هندسيا لاستهداف الأغشية البلازما. على الرغم من أن هذه النواقل تصيب خلايا الشبكية العقدة على نحو فعال، ويمكن أيضا أن يلاحظ التعبير في أنواع الخلايا الأخرى المحلية. (A) وهذا العلاج لا يؤدي إلى تغيرات ملحوظة في الأكسجين الناجم عن الوعاء-طمس كما هو محدد في P12، مما يدل على أن جميع الفوائد لوحظ على الوعاء-طمس قياسها في نقاط وقت لاحق وذلك بسبب زيادة تجديد الأوعية الدموية. (B) تثبيط IRE1α طن هذا النموذج المحسن بشكل كبير الأوعية الدموية التجديد في مرحلة إعادة نمو OIR في P17. (تم تعديل هذا الرقم من بينيه وآخرون. استقلاب الخلية 2013 25) (C) تقييم نقطة مرة الثالثة من الوعاء-طمس مثل P14، وذلك لتحديد معدلات دقيقة للعودة التوعي. (تم تعديل هذا الرقم من جويال آخرون الدم 2011 24) الرجاء الضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ما هي الطريقة الأكثر فعالية لتحفيز نمو الأوعية صحية جديدة في النسيج العصبي الدماغية؟ هل يصح علاجيا لتتداخل مع وتسريع إعادة نمو الأوعية الدموية التي تحدث بشكل طبيعي؟ في الأمراض العصبية الدماغية مثل retinopathies الدماغية أو السكتة الدماغية، ويرتبط تنكس الأوعية الدموية مع انخفاض وظيفة الخلايا العصبية 35-38. وبالتالي لمواجهة الإصابة في وقت مبكر، إعادة الإقليمية الدورة الدموية الصغرى خلال الجزء فوري / مبكرة من المرض قد تكون مفيدة. في سياق بصري، النماذج التجريبية التي تعجل عودة التوعي من الشبكية الدماغية تقليل اتساع الأوعية الدموية المرضية 21-25، 34 وبالتالي هذا النهج مزايا إجراء مزيد من التحقيق.

منذ إطلاقها قبل 20 عاما، و27 نموذج OIR قد أحدثت ثورة الأوعية الدموية في شبكية العين البحوث 30. هنا نقدم تطبيق إضافية لهذا النموذج لدراسة STRAT المحتملينegies لتعديل الفسيولوجية الأوعية الدموية في شبكية العين تجديد الدماغية. وينبغي أن يشمل نموذج حيواني مثالية عدة معايير مثل القرب من الإنسان المرضية، علم وظائف الأعضاء، استنساخ عالية، والتنفيذ السريع وبشكل مثالي، وتكلفة منخفضة. نموذج الفأر من OIR يلبي كل هذه المعايير، ويمكن-نفذت في أقل من 3 أسابيع.

على الرغم من العديد من الفوائد المذكورة، وتشمل عيوب الحاجة الحالية للتضحية الماوس قبل التحليلات والرصد طولية بالتالي دقيقة حيوان ليس من الممكن بعد مع أدوات التصوير الحالية. حاليا، في الجسم الحي تقنيات التصوير مثل تصوير الأوعية فلوريسئين أكتوبر أو غير ناجحة إلى حد كبير نظرا لمحدودية البصرية المتأصلة في العين الماوس (دائرة نصف قطرها انحناء وحجم صغير) مما يقلل من التغطية التصوير 39 إلى أكثر المناطق المركزية من الشبكية والتي ليست ذات صلة المراحل الأولى من النموذج.

عندما تستخدم لدراسة تجديد الأوعية الدموية كما عroposed في هذه الورقة البروتوكول، ينبغي أيضا أن تراقب جميع الاعتبارات التي تنطبق على دراسة اتساع الأوعية الدموية. وتشمل هذه تسجيل وزن الحيوان لتقدير صحة التمثيل الغذائي من الجرو، والتي تؤثر بشكل كبير الأوعية الدموية 32. مراقبة دقيقة للتوتر الأوكسجين في الغرفة مفرط التأكسج أمر بالغ الأهمية أيضا. الاختلاف في تركيز الأكسجين له تأثير مباشر على vasoobliteration، التي يمكن أن تؤدي حتما إلى سوء تفسير البيانات الهامة. لذا فمن المستحسن إما تنفيذ المراقبة الإلكترونية المستمرة لتركيز الأكسجين الغرفة أو في الأقل، ورصد التغيرات اليومية في مستويات الأكسجين والحد من فتح الباب oxycycler للحفاظ على مستويات الأوكسجين المستمر. تجهيز الأمثل لشبكية العين كما يأخذ الممارسة. استخراج و التركيب و يجب أن يتم تنفيذ تلطيخ من شبكية العين مع الرعاية كما الشبكية هشة نسبيا ويجب التعامل معها بحذر. بالإضافة إلى ذلك، كما لجميع التجريب مع الحيوانات المعدلة وراثيا، والانجراف الوراثي للمستعمرة جوالنتائج نخلط. في غياب قوة انتقائية (في مستعمرة الماوس على سبيل المثال)، وأليلية أو الانجراف الوراثي هو عملية العشوائية التي يمكن أن تؤدي إلى تغييرات كبيرة في عدد السكان خلال فترة قصيرة من الزمن. يمكن تغيير الترددات أليل من جيل الى جيل، ويؤدي إلى تشكيل مستعمرة الفرعية 40 و 41. هذه الطفرات لا يمكن اكتشافها إلى حد كبير وبالتالي فمن المهم للحد من عدد من الأجيال التي تنتجها أزواج المربي نفسه في نفس المستعمرة. الطريقة الأكثر فعالية لبلوغ أعلى الاستقرار الجيني هو لتحديث "المخزونات" كل خمسة أجيال أو الشروع في backcrossing مع ماوس شراؤها من خلفية مماثلة.

ويوصى أيضا لاختبار الطفرات تنكس الشبكية (الثالثة) 1 و 8 42، مرة واحدة على الأقل قبل بدء سطر جديد من أجل تجنب الخلط الظواهر التي يمكن أن تعزى إلى سابق لأوانه تنكس مبصرة. للحيوانات معدلة وراثيا،فمن الأهمية بمكان لضمان أن كلا من التحكم وفئرانا معدلة وراثيا يتم الحصول عليها من نفس المورد وبالضرورة على نفس الخلفية الوراثية.

ونحن نواصل توضيح الآليات الجزيئية لتشكيل الأوعية الدموية والنمو، ونهج جديدة لتسريع وبطيئة، أو توجيه الأوعية الدموية الوليدة والناشئة. والنظام النموذجي الذي التشكيل من الأوعية الدموية يمكن استكشافها في الجسم الحي في سياق المرضية قد توفر أداة قيمة لاستكشاف نماذج علاجية مستقبلية لمواجهة نقص تروية الخلايا العصبية داخل الجهاز العصبي المركزي. تكييف نموذج OIR الماوس لدراسة تجديد الأوعية الدموية يوفر مثل هذا المكان وسوف تستمر في أن تكون أداة قيمة لزيادة فهمنا من الأساس الجزيئي لتكوين الأوعية الدموية الفسيولوجية والمرضية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

PS حاصل على كرسي أبحاث كندا في الشبكية بيولوجيا الخلية وجائزة معهد بحوث ألكون باحث جديد. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الكندية لأبحاث الصحة (221478)، والجمعية الكندية للسكري (OG-3-11-3329-PS)، والعلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا (418637) والعمى مؤسسة القتال كندا. وقدم الدعم أيضا من قبل RESEAU للبحوث في مجال سانتي دي لا الرؤية كيبيك.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57Bl/6 mice (Other strains may be used; angiogenic response varies from one strain to the other)
CD1 nursing mothers Vendor of choice
Operating Scissors straight World Precision Instruments 14192
Dissecting Scissors straight World Precision Instruments 14393
Vannas Eye Scissors Harvard Apparatus 72-8483
Iris Forceps, curved, serrated World Precision Instruments 15915
Brushes 362R size 0 Dynasty
Dumont Forceps #3; straight World Precision Instruments 500338
Surgical Blade, size 10 Bard-Parker 371110
Rhodamine Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I Vector Laboratories, Inc RL-1102
Microscope slides VWR 16004-368
Fluoromount G Electron Microscopy Sciences 17984-25
Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Phase and Fluorescence Microscope Zeiss
Leica MZ9.5 Stereomicroscope Leica
Fluorescein isothicyanate-dextran, 70000 Sigma-Aldrich 46945

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carmeliet, P., Tessier-Lavigne, M. Common mechanisms of nerve and blood vessel wiring. Nature. 436, 193-200 (2005).
  2. Eichmann, A., Thomas, J. L. Molecular Parallels between Neural and Vascular Development. Cold Spring Harb Perspect Med. 3, (2012).
  3. Larrivee, B., Freitas, C., Suchting, S., Brunet, I., Eichmann, A. Guidance of vascular development: lessons from the nervous system. Circ Res. 104, 428-441 (2009).
  4. Stefater Iii, J. A., et al. Regulation of angiogenesis by a non-canonical Wnt-Flt1 pathway in myeloid cells. Nature. 474, 511-515 (2011).
  5. Checchin, D., Sennlaub, F., Levavasseur, E., Leduc, M., Chemtob, S. Potential role of microglia in retinal blood vessel formation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 3595-3602 (2006).
  6. Quaegebeur, A., Lange, C., Carmeliet, P. The neurovascular link in health and disease: molecular mechanisms and therapeutic implications. Neuron. 71, 406-424 (2011).
  7. Yamamoto, Y., Craggs, L., Baumann, M., Kalimo, H., Kalaria, R. N. Review: molecular genetics and pathology of hereditary small vessel diseases of the brain. Neuropathol Appl Neurobiol. 37, 94-113 (2011).
  8. Brun, A., Englund, E. A white matter disorder in dementia of the Alzheimer type: a pathoanatomical study. Ann Neurol. 19, 253-262 (1986).
  9. Prat, A., et al. Migration of multiple sclerosis lymphocytes through brain endothelium. Arch Neurol. 59, 391-397 (2002).
  10. Rule, R. R., Schuff, N., Miller, R. G., Weiner, M. W. Gray matter perfusion correlates with disease severity in ALS. Neurology. 74, 821-827 (2010).
  11. Antonetti, D. A., Klein, R., Gardner, T. W. Diabetic retinopathy. N Engl J Med. 366, 1227-1239 (2012).
  12. Hartnett, M. E., Penn, J. S. Mechanisms and management of retinopathy of prematurity. N Engl J Med. 367, 2515-2526 (2012).
  13. Sapieha, P., et al. Retinopathy of prematurity: understanding ischemic retinal vasculopathies at an extreme of life. J Clin Invest. 120, 3022-3032 (2010).
  14. Chen, J., Smith, L. Retinopathy of prematurity. Angiogenesis. 10, 133-140 (2007).
  15. Cheung, N. Diabetic retinopathy and systemic vascular complications. Progress in Retinal and Eye Research. 27, 161-176 (2008).
  16. Smith, L. E. Through the eyes of a child: understanding retinopathy through ROP the Friedenwald lecture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 5177-5182 (2008).
  17. Caballero, S., et al. Ischemic vascular damage can be repaired by healthy, but not diabetic, endothelial progenitor cells. Diabetes. 56, 960-967 (2007).
  18. Wang, H., et al. VEGF-mediated STAT3 activation inhibits retinal vascularization by down-regulating local erythropoietin expression. Am J Pathol. 180, 1243-1253 (2012).
  19. Ritter, M. R., et al. Myeloid progenitors differentiate into microglia and promote vascular repair in a model of ischemic retinopathy. J Clin Invest. 116, 3266-3276 (2006).
  20. Saito, Y., Geisen, P., Uppal, A., Hartnett, M. E. Inhibition of NAD(P)H oxidase reduces apoptosis and avascular retina in an animal model of retinopathy of prematurity. Mol Vis. 13, 840-853 (2007).
  21. Connor, K. M., et al. Increased dietary intake of omega-3-polyunsaturated fatty acids reduces pathological retinal angiogenesis. Nat Med. 13, 868-873 (2007).
  22. Banin, E., et al. T2-TrpRS inhibits preretinal neovascularization and enhances physiological vascular regrowth in OIR as assessed by a new method of quantification. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 2125-2134 (2006).
  23. Dorrell, M. I., et al. Maintaining retinal astrocytes normalizes revascularization and prevents vascular pathology associated with oxygen-induced retinopathy. Glia. 58, 43-54 (2010).
  24. Joyal, J. -S., et al. Ischemic neurons prevent vascular regeneration of neural tissue by secreting semaphorin 3A. Blood. 117, 6024-6035 (2011).
  25. Binet, F., et al. Neuronal ER Stress Impedes Myeloid-Cell-Induced Vascular Regeneration through IRE1alpha Degradation of Netrin-1. Cell Metab. 17, 353-371 (2013).
  26. Fukushima, Y., et al. Sema3E-PlexinD1 signaling selectively suppresses disoriented angiogenesis in ischemic retinopathy in mice. J Clin Invest. 121, 1974-1985 (2011).
  27. Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Invest Ophthalmol Vis Sci. 35, 101-111 (1994).
  28. Lange, C., et al. Kinetics of retinal vaso-obliteration and neovascularisation in the oxygen-induced retinopathy (OIR) mouse model. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 247, 1205-1211 (2009).
  29. Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4, 1565-1573 (2009).
  30. Stahl, A., et al. The mouse retina as an angiogenesis model. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 2813-2826 (2010).
  31. Stahl, A., et al. Computer-aided quantification of retinal neovascularization. Angiogenesis. 12, 297-301 (2009).
  32. Stahl, A., et al. Postnatal Weight Gain Modifies Severity and Functional Outcome of Oxygen-Induced Proliferative Retinopathy. Am J Pathol. 177, 2715-2723 (2010).
  33. Cerani, A., et al. Neuron-Derived Semaphorin 3A is an Early Inducer of Vascular Permeability in Diabetic Retinopathy via Neuropilin-1. Cell Metabolism. 18, 505-518 (2013).
  34. Sapieha, P. Eyeing central neurons in vascular growth and reparative angiogenesis. Blood. 120, 2182-2194 (2012).
  35. Dorfman, A., Dembinska, O., Chemtob, S., Lachapelle, P. Early manifestations of postnatal hyperoxia on the retinal structure and function of the neonatal rat. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 458-466 (2008).
  36. Dorfman, A. L., Joly, S., Hardy, P., Chemtob, S., Lachapelle, P. The effect of oxygen and light on the structure and function of the neonatal rat retina. Doc Ophthalmol. 118, 37-54 (2009).
  37. Chopp, M., Zhang, Z. G., Jiang, Q. Neurogenesis, angiogenesis, and MRI indices of functional recovery from stroke. Stroke. 38, 827-831 (2007).
  38. Li, L., et al. Angiogenesis and improved cerebral blood flow in the ischemic boundary area detected by MRI after administration of sildenafil to rats with embolic stroke. Brain Res. 1132, 185-192 (2007).
  39. Robinson, R., Barathi, V. A., Chaurasia, S. S., Wong, T. Y., Kern, T. S. Update on animal models of diabetic retinopathy: from molecular approaches to mice and higher mammals. Dis Model Mech. 5, 444-456 (2012).
  40. Chia, R., Achilli, F., Festing, M. F., Fisher, E. M. The origins and uses of mouse outbred stocks. Nat Genet. 37, 1181-1186 (2005).
  41. Jenuth, J. P., Peterson, A. C., Shoubridge, E. A. Tissue-specific selection for different mtDNA genotypes in heteroplasmic mice. Nat Genet. 16, 93-95 (1997).
  42. Mattapallil, M. J., et al. The Rd8 mutation of the Crb1 gene is present in vendor lines of C57BL/6N mice and embryonic stem cells, and confounds ocular induced mutant phenotypes. Investigative ophthalmolog., & visual science. 53, 2921-2927 (2012).
تقييم الأوعية الدموية التجديد في الجهاز العصبي المركزي عن طريق الماوس الشبكية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Miloudi, K., Dejda, A., Binet, F., Lapalme, E., Cerani, A., Sapieha, P. Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (88), e51351, doi:10.3791/51351 (2014).More

Miloudi, K., Dejda, A., Binet, F., Lapalme, E., Cerani, A., Sapieha, P. Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (88), e51351, doi:10.3791/51351 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter