Summary
啮齿动物视网膜长期以来被认为是可访问的窗口到大脑。在此技术论文中，我们提供了一个协议，它采用的氧诱导视网膜病变研究，导致血管再生的失败缺血性损伤后的中枢神经系统内的机制的小鼠模型。所描述的系统也可以利用，以探讨策略，视网膜和中枢神经系统内促进功能性血管再生。
Abstract
啮齿动物视网膜也许是最方便的哺乳动物系统中，中枢神经系统（CNS）内神经血管调查的相互作用。它被越来越多地认识到，一些神经变性疾病如阿尔茨海默氏症，多发性硬化症，与血管妥协肌萎缩性侧索硬化症本元素。此外，失明在儿科和工作年龄人口（早产儿视网膜病变和糖尿病性视网膜病变，分别）的最突出的原因是其特征在于，生理血管再生长的血管退化和故障。本技术文件的目的是提供一个详细的协议来研究中枢神经系统血管再生的视网膜。该方法可以用来阐明导致血管生长的故障缺血性损伤后的分子机制。此外，潜在的治疗方式，以加速和恢复健康的血管丛可以探讨。结果obtaineD使用所描述的方法可以提供的治疗途径，缺血性视网膜病变，如糖尿病或早产儿，可能有利于中枢神经系统的其他血管疾病。
Introduction
整个中枢神经系统发育，神经，免疫细胞和血管建立显着耦合网络，以确保有足够的组织灌注，并允许感官信息1-5传输。血管系统，导致组织氧合不足和代谢受到影响供给和故障日益被视为一个重要因素神经退行性疾病6的发病机制。血管漏失和神经血管单元的大脑内的劣化，例如，与血管性痴呆，脑7的白质血管病变和阿尔茨海默氏病与小动脉和小血管8的狭窄相关联。此外，受损的血管屏障功能被认为有助于多发性硬化症9和肌萎缩性侧索硬化症10。
直接的相关性，以在本协议中所述，致盲的视网膜模型的疾病，如糖 尿病性视网膜病变11和早产儿12的视网膜病变，13的特征是早期血管退化的相位。对神经血管视网膜随后的缺血性应激触发过度和病理血管生成中的第二阶段中可能源于作为一种代偿性反应重新死刑犯氧和能量供应14-16。一个有吸引力的策略来克服缺血性应激是中央到疾病进展是恢复功能性血管网络特别是在神经视网膜（ 图2和3）的局部缺血区。挑起控制血管生成的响应可能会遇到如反直觉对于其中的抗血管生成治疗，如抗的VEGF被认为是适于处理的条件。然而，证据表明这种方法的有效性安装。例如，加强ischem“生理状”血管再生IC视网膜病变已经通过引进内皮前体细胞17，抑制缪勒细胞表达VEGF诱导的其他血管生成因子18，注射髓系祖细胞19，抑制NADPH氧化酶诱导的细胞凋亡20，增加饮食中ω-3多不饱和脂肪酸下调的优雅展现酸摄入21，具有色氨酸tRNA合成酶22的羧基末端片段和VEGF或FGF-2的保护胶质细胞23的直接给药治疗。此外，我们已经表明，调节神经古典的指导线索，如脑信号或导蛋白在缺血性视网膜病变加速视网膜内的良性血管的血管再生，从而减少病理性血管生成24，25。直接的临床意义，几个上述动物研究提供的证据表明，促进血管再生成期间视网膜病的早期缺血阶段可以显著减轻威胁视力的视网膜前新生血管形成19，23，24，26，有可能通过对缺血性负担的减轻。
制定刺激的功能性血管再生治疗策略仍然是血管生物学家一个显著的挑战。在这里，我们描述了一个实验系统，它采用的氧诱导视网膜病变（OIR）小鼠模型，探讨策略，视网膜内调节血管再生。 Smith 等人开发的。于1994年27，这种模式可作为人类增生性视网膜病变的代理，由露出P7鼠标幼仔至75％的O 2，直到P12和随后重新引进幼犬室内环境氧张力（ 图中1）。这一模式松散模仿一个场景：一个早产儿通风与O 2。鼠标幼仔高氧暴露引发视网膜毛细血管和微血管病变，并产生血管闭塞的可重复的区域（VO）通常在评估从O 2的出口在P12，虽然最大VO面积达到48小时（P9）后接触到O 2 28。在小鼠中，股骨头缺血性VO区自发地重新在一周的过程中下面再介绍了室内空气，并最终VO区域被完全重新血管化（ 图2）。重新引入到经受OIR小鼠的室内空气也引发视网膜前新生血管形成（NV）（最多为P17），它通常评估，以确定抗血管生成治疗模式的疗效。在其最纯粹的形式，OIR模型提供了一个高度可重复的，可量化的工具来评估氧 诱导的血管退化，并确定破坏性预视网膜新生血管形成29-31的程度。
30,31被彻底说明。在这里，我们提供了一个简单的一步一步的过程由药物化合物，有意治疗，病毒载体进行调查生理血运重建的调节神经视网膜内或研究的候选基因在转基因或基因敲除小鼠的影响。
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Protocol
伦理声明：所有动物实验坚持以研究协会在视觉与眼科在眼科用动物和视觉研究和动物保健的加拿大委员会（ARVO）语句建立的动物护理指引。
1。氧诱导视网膜病变（OIR）
- 鼠标幼仔为P0出生记录日期。
- 在进入O 2，记录动物的全部重量，以确保有足够的体重范围。注意：对于C57BL / 6小鼠在P17，体重应5和7.5 g的为最大NV 32系列 。为了保持环境的一致性，建议使用同窝对照（转基因小鼠和老鼠接受实验处理）。当评估一个病毒载体的作用，必须考虑病毒的嗜性，并允许有足够的时间对病毒交付的转基因充分表达。迅速表达病毒载体，如第三代慢病毒24，25，33，建议。
- 将鼠标幼仔在P7（C57BL / 6或期望株）和CD1母亲培养成一个氧气室设定为75％的O 2 5天27。环境湿度和温度在整个O 2的曝光保持不变。注：配备的O 2源中央研究设施是理想，限制了繁琐的更换空氧气罐。如果使用转基因或基因敲除小鼠的工作，重要的是确保对照和实验小鼠被来自同一供应商获取到相同的菌株30，29内限制遗传漂移是重要的。
- 在P12，从氧舱去除小鼠和动物返回到环境的O 2。
2，玻璃体腔注射交货化合物的内层视网膜 （瓦时药理复合或重组蛋白的恩评估效果）
- 在P14，麻醉小鼠中的氧气2升/分钟（或选择的动物保护委员会批准的麻醉剂）2％异氟醚。为了验证该麻醉的效果，顺序地捏住尾巴，后脚和耳钳。
- 把鼠标在它的肚子。
- 使用配有一个斜面拉到玻璃针的无菌10微升注射器进行注射1微升的溶液含有在眼睛的后缘被研究的化合物或赋形剂（生理盐水）的最大容积，具有45°的角度避开镜头。注意：该拉玻璃针是使用下拉环氧树脂附着到注射器。
- 用棉签鼠标的眼睛滴一滴润滑剂眼药膏（理想的抗生素）的。
- 返回鼠标回到笼子里培育的母亲。小鼠然后小心地监视，直到再覆盖和完全卧床。
容器灌注和屏障功能（完整性）3。通过荧光素血管造影评估
- 麻醉小鼠中的氧气2升/分钟（或选择的动物保护委员会批准的麻醉剂）2％异氟醚。为了验证该麻醉的效果，顺序地捏住尾巴，后脚和耳钳。注意：该典型地在P17时再生进行评估。还随身携带了分析，在P19和P21，以确定是否血管的完整性被保留一段时间。
- 一旦麻醉，称重鼠标。
- 做中线的腹部切口解剖剪刀。注：解剖仪器应定期检查和激化。
- 切肋骨横向和提高胸腔钳的帮助。注意：这是必要的，以切割为横向，以避免对心脏的损伤。
- 去除perip后从大庆外围心脏组织，钳降主动脉与止血钳。
- 慢慢地用25号针头向左心室注入荧光素 - 葡聚糖。注意：如果血管屏障功能进行了研究，70 kDa的荧光葡聚糖被采用，因为它会泄漏出的船只，当容器完整性受到损害。如果研究者希望投血管，2 MDA荧光葡聚糖被使用。关键的步骤：1）为了确保均匀的重新分区，离心机荧光葡聚糖和注入上清液，2）为了防止血管收缩，注入温热荧光葡聚糖溶液，3）它的循环时间不应该过量的4分钟。
- 注射操作剪刀后斩首老鼠2分钟。
4，眼球摘除和眼球固定
注：在评估血管再生率，首先收集在视网膜P12和另外在P14和P17。增加采样时间点的数目S代表更精确地确定24血运重建率。
- 倾斜的鼠标头部，并将其放置在其一侧。
- 去除皮肤和眼睑用解剖剪刀覆盖眼球。
- 将弯钳眼睛下方轻轻向上拉，直到视神经被切断。
- 把鼠标的头部到其另一侧，并执行相同的步骤（步骤4.2和4.3）。
- 以确保固定剂更好的渗透，穿刺中，用30号针头在眼睛的前室中的孔。
- 转移目光含4％多聚甲醛（PFA）管，且固定为1小时，在室温下进行。
- 除去PFA，用冰冷的PBS溶液洗眼睛的4倍。
5，视网膜解剖
- 鼠标放置在眼里含冷PBS的培养皿中，并在立体显微镜下进行视网膜剥离。
- 去除眼睛周围用显微解剖SCI多余的脂肪/组织ssors。
- 切断与显微解剖剪刀角膜。
- 使用两对钳子的，微小的剥离巩膜远离朝向视神经的周边并丢弃。
- 用钳子捏住镜头（角膜下方的白色球）和眼罩提取它。用一对镊子作为支撑的，和对方的抓地力和小心地抬起并取下镜头。
- 用小刷子（大小为0）和镊子分离从视网膜的内侧的玻璃体血管。
- 删除使用产钳连接到视盘玻璃体血管束。
- 解剖转移到视网膜开始之前染色过程含有PBS中，发生在ICE 2 ml离心管中。
6，视网膜血管染色
- 孵育解剖视网膜过夜，在4℃下轻轻摇动以溶液的荧光在PBS耦合凝集素B4（若丹明凝集素或其他），含1mM的CaCl 2
- 在第二天，除去染色溶液和在PBS中于室温下10分钟，洗3次视网膜。
视网膜铺片7的制备
- 转移视网膜，感光器的一面朝下，在显微镜载玻片上，并用外科手术刀来划分视网膜成四个相等大小的象限使得4深等距离径向切口。在切口，振奋视网膜用刷子，这样它不会移动。
- 使用两把刷子浸泡在PBS中，仔细压平象限感光面朝下，沉浸在视网膜中的安装介质，以防止光漂白。然后小心地将盖玻片安装的视网膜表面上不施加压力，并确保气泡不会盖玻片下积聚。</ LI>
8，成像和Vasoobliteration（VO）和新生血管（NV）的定量如前所述31
- 采取整体式视网膜图像的落射荧光显微镜在10倍的放大倍率。
- 在照片编辑软件打开视网膜图像，缝合在一起，并测量视网膜总面积，无血管区。区域可以用像素表示。
- 由像素的总的视网膜区域的数目除以在无血管区域的像素的数量确定VO的程度。
- 除以NV的像素的数量由像素中的总的视网膜区域的描述31的数目确定NV的程度。
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Representative Results
的OIR模型被广泛用于研究氧诱导血管变性和局部缺血引起的病理性新生血管在视网膜中和一直在为眼部疾病27，29，30目前使用的抗血管生成治疗的发展。利用该模型得到的结果可以大致推断缺血性视网膜病变，如增殖性糖尿病视网膜病变和30早产儿视网膜病变。
在这里，我们提出一个替代使用这个模型来研究血管再生。我们将描述一个策略的例子来再生，这是最近由我们实验室公布的缺血性视网膜。在所提出的研究中，我们证明了持久的缺血神经元激活内质网（ER）应激，并通过其效应核糖核酸内切酶IRE1α，经典的神经导向提示netrin诱导-1的裂解基因之一。我们证明在netrin诱导-1的眼内交货，刺激视网膜骨髓细胞修复血管生成的程序，从而OIR 25后，加速神经组织血运重建。此外，我们提供一种使用IRE1α的慢病毒介导的沉默加速血管再生的一个例子。
所描述的实验范式可以进行修改，以探讨探索性治疗的首选。重要的是，玻璃体内注射的时间点的基础上，探讨了化合物的性质决定，必须考虑到其中所研究的治疗作用的机制。例如，研究药理化合物（受体激动剂，拮抗剂等），P14可作为它对应于一个时间点视网膜血管重建加快但速效干预可能有助于加快血运重建（ 图率选定2和图 3a）。当病毒载体是就业，有足够的时间必须分配以允许乘客基因和一个较早的时间点的充分表达，可以选择，以确保转基因或靶基因的全沉默（ 图4）的充分表达。基于慢病毒载体尤其适合在这方面，由于其快速的表达，低炎症反应和易于生产24,25。它也是至关重要的，以一定的靶基因传递到适当的视网膜细胞种群（RGC，内皮细胞，Müller的细胞，等等），因此，所选择的病毒载体的趋向性必须加以考虑。另一方面，使用转基因或基因敲除动物研究的基因在血管再生中的作用提供了不需要进行眼内注射的优点。
图1：鼠标OIR模型小鼠的幼崽和哺乳母亲从P7接触到75％的O 2〜P12 的示意图 。通风的氧舱稳步O 2的交付和血氧饱和度是必需的。在这个初始阶段，视网膜血管闭塞发生。在P12，老鼠被返回到室内空气（21％O 2），直到最大时的病理视网膜前簇绒发生P17。新生血管消退在随后的日子里。探讨血管再生的理想时期是P12和P17之间的窗口。抽样和评估几个时间点血管闭塞的程度是关键，阐明心肌血运重建术的准确率。
图2。视网膜血管再生的下列氧诱导血管oblite时间过程口粮。视网膜flatmounting程序的）图形描绘。一个切口是通过角膜（黑灰色半球）的顶部和巩膜（点缀红色线）制成，并在视网膜被梳理出。该透镜可以经过开口角膜/巩膜或一次巩膜除去，如下图中所示被提取。玻璃体血管，然后取出并进行视网膜血管染色。一旦染色协议完成后，视网膜再切成4等间隔的部分，并安装在显微镜载片容器朝上B）从经受OIR小鼠凝集素染色的flatmount视网膜上。作为血管再生，血管闭塞的区域（这里最大为P12）填充英寸的病理新血管形成是最大的P17，并显示为在植物血凝素染色的OIR视网膜饱和点。通过P19-P21，视网膜已完全再生的血管网络。 （这个数字已经被修改比奈等人。细胞代谢 2013 25）
图3例可注射的治疗，加速视网膜血管再生：netrin诱导- 1。 A）netrin诱导-1是在P14的血管再生的P17评估和程度注入。的剂量依赖性增加，血管再生，观察B）血管完整性可通过灌注具有低分子量的葡聚糖的荧光进行评估。如果船只显示受损的屏障功能，荧光葡聚糖将泄漏的容器中（箭头）以外。 （这个数字已经被修改比奈等人。细胞代谢 2013 25）
图4例基因沉默wi的个慢病毒交付的shRNA对视网膜血管的再生。Lv.shIRE1α评估IRE1α的基因沉默的视网膜神经节细胞，以帮助血管再生的能力，玻璃体内注射慢病毒编码的shIRE1α的注入在P3，以便有足够的时间对基因沉默的时候血管生长和血管闭塞评估。在这个例子中使用的第三代慢病毒含有改性水泡性口炎病毒糖蛋白（VSV-G），工程化以靶向细胞质膜。虽然这些载体有效感染视网膜神经节细胞，表达也可以参考了其他地方的细胞类型。 （ 一 ）此治疗并不会导致氧诱导的血管闭塞于P12的确定明显的变化，标志着在稍后的时间点上测量血管闭塞所有观察到的好处是，由于增加血管的再生。 IRE1α（二）我的抑制作用n这个范式显着提高血管再生资源系统在P17的再生阶段。 （三）评估血管闭塞，如P14的第三个时间点（这个数字已经从比奈等人。细胞代谢 2013 25被修改），需要确定血运重建的准确率。 （这个数字已经被修改海卓亚等。血 2011 24） 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
什么是刺激在缺血性神经组织中新血管的健康成长最有效的方法是什么？它是治疗有效的干预和加速自然发生的血管再生？在神经缺血性疾病，如缺血性视网膜病或中风，血管退化与减少神经元功能35-38相关联。因此，应对早期损伤，疾病的直接/早段期间复原区域微循环可能证明是有益的。在眼部背景下，实验范式是加速缺血性视网膜血管重建减少病理性新生血管形成21-25，34，因此这种方法值得进一步调查。
自推出以来，在20年前，在OIR模型27具有革命性的视网膜血管生成的研究30。在这里，我们提供了一个额外的应用程序为这个模型来研究未来的STRAT几种学习策略，以调节生理性血管再生的缺血性视网膜。一个理想的动物模型应该包括几个标准，如接近人体病理学，高重复性，快速执行和理想，成本低。 OIR小鼠模型满足所有这些标准，并且可以进行，在不到3个星期。
尽管众多上市的好处，缺点包括当前需要牺牲鼠标之前，分析和动物，因此准确的纵向监测尚无法与当前的成像工具。目前，如OCT或荧光血管造影在体内成像技术在很大程度上是不成功的，由于老鼠的眼睛（曲率半径和小尺寸）的固有光学限制，降低成像范围39到不相关的视网膜最中央的区域该模型的早期阶段。
当用于研究血管再生为proposed在这个协议文件，适用于研究血管新生的所有因素也应进行监测。这些措施包括记录动物体重估计小狗的代谢健康，从而极大地影响血管新生32。在高氧室的氧张力的精确控制也很关键。变化中的氧气浓度有直接的影响上vasoobliteration，它可以必然导致关键数据的误解。因此，建议要么实现连续的电子监控室的氧气浓度或至少，在监测氧含量日变化和限制oxycycler门打开，以保持恒定的氧气水平。视网膜的优化处理也需要练习。提取，固定和视网膜的染色必须小心为比较脆弱的视网膜被执行必须被小心处理。此外，为所有实验用转基因动物，殖民地c中的遗传漂变一个变乱结果。在缺乏选择性压力（在小鼠菌落例如），等位基因或遗传漂变是一个随机过程，可导致大的变化，人口超过很短的时间周期。等位基因频率可以改变代代相传，并导致一个子集落40,41的形成。这些突变在很大程度上是不可检测的，它是重要的，以限制由在同一集落同一饲养员对产生的后代的数量。要达到最高的遗传稳定性的最有效方法是刷新“股票”每五个世代，或者继续用相同的背景，购买鼠标回交。
此外，还建议测试对于视网膜变性的突变（RD）和1 8 42，至少一次，以避免混淆，可以归结为过早的光感受器变性的表型启动一个新的行之前。对于转基因动物，这一点至关重要，以确保控制和突变小鼠是从相同的供应商处获得，并且不一定在相同的遗传背景。
随着我们继续阐明血管形成和生长的分子机制，新的方法来加速，缓慢，或引导新生血管引起的。一个模型系统，其中血管的调节可以探讨在体内的病理情况下可以提供一个有价值的工具，以探索未来的治疗范式在中枢神经系统内神经元对抗缺血。适应鼠标OIR模型来研究血管再生提供了这样一个场所，并将继续是一个宝贵的工具，以促进我们的生理和病理血管生成的分子基础的认识。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
PS持有加拿大研究主席在视网膜细胞生物学和爱尔康研究院新研究者奖。这项工作是由健康研究加拿大学院（221478）的资金支持，加拿大糖尿病协会（OG-3-11-3329-PS）的加拿大自然科学和工程研究理事会（418637）和基金会战斗失明加拿大。技术支持也由送货线路德RECHERCHE恩桑特德拉视觉魁北克提供。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57Bl/6 mice (Other strains may be used; angiogenic response varies from one strain to the other) | |||
| CD1 nursing mothers | Vendor of choice | ||
| Operating Scissors straight | World Precision Instruments | 14192 | |
| Dissecting Scissors straight | World Precision Instruments | 14393 | |
| Vannas Eye Scissors | Harvard Apparatus | 72-8483 | |
| Iris Forceps, curved, serrated | World Precision Instruments | 15915 | |
| Brushes 362R size 0 | Dynasty | ||
| Dumont Forceps #3; straight | World Precision Instruments | 500338 | |
| Surgical Blade, size 10 | Bard-Parker | 371110 | |
| Rhodamine Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I | Vector Laboratories, Inc | RL-1102 | |
| Microscope slides | VWR | 16004-368 | |
| Fluoromount G | Electron Microscopy Sciences | 17984-25 | |
| Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Phase and Fluorescence Microscope | Zeiss | ||
| Leica MZ9.5 Stereomicroscope | Leica | ||
| Fluorescein isothicyanate-dextran, 70000 | Sigma-Aldrich | 46945 |
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