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Neuroscience

마우스 망막을 사용하여 중추 신경계의 혈관 재생의 평가

doi: 10.3791/51351 Published: June 23, 2014

Summary

쥐의 망막은 오랫동안 뇌에 접근 창으로 인정을 받고있다. 이 기술 문서에서 우리는 허혈성 손상 후 중추 신경계 내에서 혈관 재생의 실패로 이어질 메커니즘을 연구하는 산소에 의한 망막 병증의 마우스 모델을 사용하는 프로토콜을 제공합니다. 기술 시스템은 망막과 중추 신경계 내에서 기능 혈관의 재성장을 촉진하는 전략을 탐구하는 무력화 할 수 있습니다.

Abstract

설치류 망막 아마도 중추 신경계 (CNS) 신경 혈관 내 상호 작용을 조사 할 수있는 가장 접근 포유류 시스템이다. 그것은 점점 인식되고 그 알츠하이머, 다발성 경화증, 혈관 손상의 근 위축성 측삭 경화증 본 요소 등 여러 가지 신경 퇴행성 질환. 또한, 소아 및 가능 연령 인구 (각각 미숙아 및 당뇨 망막 병증,)에서 실명의 가장 눈에 띄는 원인은 생리적 혈관 재성장의 혈관 변성과 실패에 의해 특징입니다. 이 기술 문서의 목적은 망막에 CNS의 혈관 재생을 연구하기 위해 상세한 프로토콜을 제공하는 것입니다. 방법은 허혈 손상 후에 혈관 성장의 실패로 이어질 분자 메커니즘을 규명하기 위해 사용될 수있다. 또한, 잠재적 인 치료 양식 건강한 혈관 plexuses을 가속화하고 복원하는 탐험 할 수있다. 연구 결과는 obtaineD 설명한 방법을 사용하여 당뇨병이나 미숙아 것과 허혈성 망막 병증에 대한 치료 적 수단을 제공 할 가능성이 CNS의 다른 혈관 질환에 유익있다.

Introduction

CNS의 발달, 신경, 면역 세포 및 혈관에 걸쳐 적절한 조직 관류를 보장하고 감각 정보 1-5의 송신을 허용하도록 현저 결합 네트워크를 확립한다. 부족한 조직의 산소 및 손상 대사 공급하고있는 혈관 시스템의 결과의 분석은 점점 더 신경 퇴행성 질환 (6)의 발병 기전에 중요한 기여로 인식되고 있습니다. 혈관 강하 및 뇌 내의 신경 혈관 기기의 열화는, 예를 들어, 혈관성 치매, 뇌 7의 흰색 물질의 혈관 병변과 동맥 및 소형 선박 8 협착 알츠하이머 질환과 관련이 있습니다. 또, 손상된 혈관 장벽 기능은 다발성 경화증 (9) 및 근 위축성 측삭 경화증 (10)을 올릴 것으로 생각된다.

눈부신,이 프로토콜에 설명 된 망막 모델에 직접 관련이당뇨병 성 망막 병증 (11)과 미숙아 망막 병증 (12)과 같은 질병은 13 초 혈관 변성의 위상을 특징으로한다. 신경 혈관 망막에 계속되는 허혈성 스트레스 가능성이 다시 임명하다 산소와 에너지 공급 14 ~ 16에 대한 보상 반응으로 발생한 과도하고 병적 인 혈관 신생의 두 번째 단계를 트리거합니다. 질병의 진행에 중심 허혈성 스트레스를 극복하는 매력적인 전략은 특별히 신경 망막 (그림 2와 3)의 허혈 영역에서 기능 혈관 네트워크를 복원하는 것입니다. 제어 혈관 반응을 자극하는 직관적 안티 - VEGFs 같은 항 혈관 신생 치료가 적합한 치료로 간주되는 조건으로 건너 올 수 있습니다. 그러나,이 방법의 유효성에 대한 증거가 설치된다. 예를 들어, ischem에서 "생리와 같은"혈관 재성장을 강화IC의 망막 병증은 우아 내피 전구 세포 (17),식이 ω-3 고도 불포화 지방산을 증가 다른 혈관 신생 인자 (18), 골수 전구 세포 (19)의 주입, NADPH 산화 효소에 의한 세포 사멸 (20)의 억제의 뮐러 세포 발현 된 VEGF에 의한 하향 조절 억제의 도입을 통해 입증되었습니다 산 입구 (21), 트립토판의 tRNA 합성 효소 (22)의 카르 복실 말단 단편, 그리고 glial 세포 (23)의 보호를위한 VEGF 또는 FGF-2의 직접적인 관리와 치료. 또한, 우리는 허혈성 망막 병증 이러한 Semaphorins 또는 Netrins 같은 고전의 연결을 유도 신호를 변조하는 망막 내에서 건강한 혈관의 혈관 재생을 촉진하고 결과적으로 병적 인 혈관 신생 (24, 25)를 감소 시킨다는 것을 증명하고있다. 직접 임상 관련성의, 전술 한 동물 연구의 몇 가지 증거를 제공하는 혈관 재 추진망막증의 조기 허혈성 단계 동안 생성 가능성이 상당히 허혈성 부담의 감소를 통해, 시력을 위협 사전 망막 신생 혈관 (19), (23, 24), (26)을 감소시킬 수있다.

기능 혈관의 재생을 자극하는 치료 전략을 고안하는 것은 혈관 생물학을위한 중요한 과제로 남아. 여기에서 우리는 망막 내 혈​​관의 재성장을 조절하는 전략을 탐구하는 산소에 의한 망막 병증 (OIR)의 마우스 모델을 사용하는 실험 시스템을 설명합니다. 스미스 등에 의해 개발 1994. (27),이 모델은 인간의 증식 망막 병증에 대한 프록시 역할을하며 실내 순환 O 2 장력 (그림에 P12까지 75 %의 O 2 P7 마우스 새끼를 노출 이후에 새끼를 다시 도입 구성 1). 이 패러다임은 느슨하게 미숙아는 통풍이 시나리오를 모방O 2. 고농도 산소에 마우스 새끼의 노출은 망막 모세 혈관 및 미세 혈관의 변성을 유발하고, 최대 VO 영역이 후 48 시간 (P9)에 도달하지만, 일반적으로, P12에서 O 2 종료에 따라 평가 혈관 폐색의 재현 영역 (VO)를 산출 O 2 28에 노출. 마우스에서 무 혈관의 VO 영역은 자발적으로 실내 공기에 다시 소개 다음 주에 걸쳐 재생 결국 VO 지역은 완전히 (그림 2) 다시 혈관이 있습니다. OIR을 실시 생쥐의 실내 공기에 재 도입은 일반적으로 항 혈관 신생 치료 패러다임의 효능을 결정하기 위해 평가된다 사전 망막 혈관 신생 (NV) (P17에서 최대)을 불러 일으킨다. 그것의 순수한 형태, OIR 모델은 산소 - 유도 된 혈관 변성을 평가하고 파괴 사전 망막 신생 혈관 29-31의 범위를 결정하기 위해 높은 재현성 및 정량화 도구를 제공한다.

30, 31에 의해 설명되었다. 여기에서 우리는 약물 화합물, 미래의 치료제, 바이러스 성 벡터에 의해 신경 망막 내에서 생리적 재관류 술의 변조를 조사하거나 유전자 변형 또는 녹아웃 마우스에서 후보 유전자의 영향을 연구하기 위해 간단한 단계별 절차를 제공합니다.

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Protocol

윤리 문 : 모든 동물 실험은 비전과 안과 안과에서 동물의 사용 및 비전 연구 및 동물 관리의 캐나다 협의회 (ARVO) 문에 연구를위한 협회에 의해 설립 된 동물 보호 지침을 준수합니다.

1. 산소 유도 망막 병증 (OIR)

  1. 기록 P0로 마우스 새끼의 생년월일.
  2. 적절한 체중 범위를 보장하기 위해 O 2에 진입에 동물의 모든 무게를 기록한다. 참고 : P17의 C57BL / 6 마우스의 경우, 체중은 최대 NV 32 5 7.5 g 사이의 범위해야합니다. 환경의 일관성을 유지하기 위해서는, (유전자 변형 마우스뿐만 아니라 마우스는 실험적인 치료를받는) 제어로 한배 새끼를 사용하는 것이 추천된다. 바이러스 성 벡터의 효과를 평가할 때, 하나는 바이러스의 굴곡 운동을 고려하고 바이러스 성 전달 형질 전환 유전자의 완전한 표현을위한 충분한 시간을 허용해야합니다. 급속하게 표현하는 바이러스이러한 제 3 세대 lentiviruses 24, 25 등의 벡터는, 33를 권장합니다.
  3. P7 (C57BL / 6 원하는 주)과 오일 (27)에 대해 75 %의 O 2로 설정 산소 챔버에 어머니를 육성 CD1에서 개최 마우스 새끼. 환경 습도와 온도는 O 2 노출에 걸쳐 일정하게 유지되었다. 참고 : O 2의 중앙 소스를 갖추고 연구 시설에 이상적입니다 및 빈 O 2 탱크의 번거로운 교체를 제한 할 수 있습니다. 유전자 변형 또는 녹아웃 마우스로 작업하는 경우, 그 제어 및 실험 쥐가 동일한 균주 30, 29 내 유전 감도를 제한하기 위해 동일한 업체로부터 획득되어 있는지 확인하는 것이 중요합니다.
  4. P12에서, 산소 챔버로부터 마우스를 제거하고 O 2 대기 온도 동물을 반환.

내부 망막에 화합물의 배달 2. 유리체 강내 주입 (WH약물 화합물 또는 재조합 단백질의 EN 평가하는 효과)

  1. P14에서, 산소 2 L / 분 (또는 선택의 동물 보호위원회의 승인을 마취)의 2 % 이소 플루 란 (isoflurane)와 마우스를 마취. 마취의 효과를 확인하기 위해, 순차적 집게로 꼬리 뒷발 및 귀 핀치.
  2. 배꼽에 마우스를 놓습니다.
  3. 모따 인출 유리 바늘 장착 멸균 10 μL 주사기를 사용하여, 45 °로, 눈의 후방 윤부에서 조사되는 화합물 또는 비히클 (생리 식염수)을 함유하는 용액으로 1 μL의 최대 볼륨의 주입을 수행 렌즈를 피하는 각도. 주 : 뽑아 유리 바늘 에폭시 수지의 방울을 사용 주사기에 부착된다.
  4. 마우스의 눈에 면봉으로 윤활유 안과 연고 (이상적으로 항생제)의 드롭을 적용합니다.
  5. 어머니가 육성으로 다시 케이지에 마우스를 반환합니다. 마우스는 조심스럽게 재까지 모니터링덮여 완전히 외래.

형광 안저 촬영에 의한 선박 관류 및 장벽 기능 (무결성) 3. 평가

  1. 산소 2 L / 분 (또는 선택의 동물 보호위원회의 승인을 마취)의 2 % 이소 플루 란 (isoflurane)와 마우스를 마취. 마취의 효과를 확인하기 위해, 순차적 집게로 꼬리 뒷발 및 귀 핀치. 참고 : 재생이 평가되는 경우는 일반적으로 P17에서 수행된다. 또한 테이크 아웃 분석 P19과 P21에 혈관 무결성이 시간이 지남에 보존되어 있는지 확인합니다.
  2. 일단 마취, 마우스의 무게를.
  3. 해부 가위로 정중선 복부 절개를합니다. 주 : 해부 악기를 정기적으로 점검하고 선명해야한다.
  4. 옆으로 갈비뼈를 잘라 집게의 도움으로 흉곽을 올립니다. 주 : 심장 손상을 피하기 위하여 측방으로 가능한 한 삭감하는 것이 필요하다.
  5. perip 제거한 후마음에서 heral 조직은, 지혈 겸자로 하행 대동맥 클램프.
  6. 천천히 25 G 바늘을 사용하여 좌심실에 플루오 레세 인 덱스 트란을 주입. 참고 : 혈관 장벽 기능을 조사하는 경우, 70 kDa의 플루 - 덱스 트란이 혈관의 무결성이 손상 될 때이 혈관 밖으로 누출되므로 사용된다. 조사가 혈관을 캐스팅하고자하는 경우, 2 MDA의 형광 - 덱스 트란이 사용됩니다. 중요한 단계 : 1) 균질 다시 파티션, 원심 분리기 플루오 레세 인 덱스 트란을 보장하고, 상층 액을 주입, 2) 혈관 수축을 방지하기 위해, 따뜻하게 플루오 레세 인 덱스 트란 용액을 주입하기 위해, 3) 그 순환 시간해야 초과하지 4 분.
  7. 운영 가위 주사 후 쥐에게 2 분 목을 벨.

4. 핵의 제거 및 눈 고정

참고 : 혈관 재생의 비율을 평가하는 경우, 첫 번째 P12에 추가적으로 P14과 P17에 망막을 수집. 샘플링 된 시점의 수를 늘재관류 24의 비율의보다 정확한 측정을위한의.

  1. 마우스 머리를 기울이고 옆에 놓습니다.
  2. 피부와 해부 가위를 사용하여 눈을 덮고있는 눈꺼풀을 제거합니다.
  3. 눈 아래의 곡선 포셉을 놓고 부드럽게 시신경이 절단 될 때까지를 당기십시오.
  4. 그것의 다른면에 마우스의 머리를 켜고 동일한 단계를 (4.2 및 4.3 단계) 수행합니다.
  5. 정착액의 잘 침투를 보장하기 위해 30 G 바늘을 이용하여 안구의 전방에 구멍을 천공.
  6. 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 포함하는 튜브에 눈을 옮기고, 실온에서 1 시간 동안 고정한다.
  7. PFA를 제거하고 얼음처럼 차가운 PBS 용액으로 눈을 4 번 씻는다.

5. 망막 해부

  1. 차가운 PBS를 포함하는 배양 접시에 마우스 눈을 놓고 실체 현미경을 이용하여 망막의 해부를 수행합니다.
  2. 마이크로 해부 SCI​​와 눈 주위의 여분의 지방 / 조직을 제거ssors.
  3. 마이크로 해부 가위로 각막을 잘라.
  4. 포셉 두 쌍을 사용하여 미세하게 떨어져 시신경을 향해 주변의 공막을 벗겨 버린다.
  5. 집게로 렌즈 (각막 아래에 흰 공을) 조이고 아이 컵에서 압축을 풉니 다. 한 지원과 같은 집게의 쌍, 그립에 다른 사람을 사용하여 조심스럽게 렌즈를 제기하고 제거합니다.
  6. 작은 브러쉬 (크기 0)와 집게를 사용하여 망막의 안쪽에서 hyaloid 혈관을 분리합니다.
  7. 집게를 사용하여 시신경 유두에 연결 hyaloid 선박의 번들을 제거합니다.
  8. 전송 전에 염색 절차를 시작하기에 얼음에 PBS와 장소를 포함하는 2 ㎖의 마이크로 원심 튜브에 망막을 해부.

6. 망막 혈관 염색

  1. 밤새 부드러운의 찬란 PBS의 커플 isolectin의 B4 (로다 민 - 렉틴 등)이 1 ㎜ 염화칼슘을 함유 한 용액에 4 ° C에서 진탕 해부 망막을 품어
  2. 다음 날, 염색 액을 제거하고, 실온에서 10 분 동안 PBS에서 3X 망막 씻는다.

망막 Flatmounts 7. 준비

  1. 현미경 슬라이드에, 광수 쪽 아래로 망막을 전송하고 네 개의 동일한 크기의 사분면으로 망막을 분할하는 수술 메스를 사용하여 네 개의 깊은 등거리 방사상 절개를합니다. 이 이동하지 않도록 절개 동안 붓으로 망막 붙잡아.
  2. PBS에 담가 두 브러쉬를 사용하여 조심스럽게 사분면의 광 수용체 측이 아래로 평평하게 사진 표백을 방지하기 위해 장착 매체에서 망막을 몰두. 조심스럽게 압력을 적용하고 공기 기포는 커버 슬립에 따라 누적되지 않도록하지 않고 장착 망막의 표면에 커버 슬립을 배치. </ 리>

8. 이전 31 설명 된 이미징 및 Vasoobliteration (VO) 및 혈관 신생 (NV)의 정량화로

  1. 10 배의 배율로 에피 형광 현미경으로 전체 마운트 망막의 이미지를 가져 가라.
  2. 사진 편집 소프트웨어의 망막 이미지를 열고, 함께 스티치와 전체 망막 영역 및 무 혈관 영역을 측정합니다. 위치는 픽셀 단위로 표현 될 수있다.
  3. 전체 망막 영역의 화소 수에 의해 무 혈관 영역에서 픽셀 수를 분할하여 VO의 정도를 결정한다.
  4. 기재 (31)로서 전체 망막 영역의 화소 수로 NV의 픽셀 수를 분할함으로써 NV의 범위를 결정.

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Representative Results

OIR 모델은 널리 망막에 산소에 의한 혈관의 변성과 허혈에 의한 병적 인 혈관 신생을 연구하는 데 사용되며, 안구 질환 27, 29, 30에 대한 현재 사용중인 항 혈관 신생 치료의 개발에 도움이되었습니다. 이 모델을 사용하여 얻은 연구 결과는 느슨하게 증식 성 당뇨 망막 병증 및 미숙아 (30)의 망막 병증 등의 허혈성 망막 병증으로 추정 할 수있다.

여기에 우리가 혈관 재생을 연구하는이 모델의 대체 사용을 제시한다. 우리는 최근에 우리의 실험실에 의해 출판 된 허혈성 망막을 재생하는 전략의 예를 설명한다. 제시된 연구에서, 우리는 지속적으로 신경 허혈은 소포체 (ER) 스트레스와 이펙터 endoribonucleases IRE1α, 고전의 연결 지침 큐 네트 린 1의 클리브의 mRNA 중 하나를 통해를 활성화 것을 보여줍니다. 우리는 보여네트 린 1의 안구 내 배달, 망막 골수 세포의 수복 혈관의 프로그램을 자극하고, 따라서 OIR 25 일 이후 신경 조직의 혈관 재 형성을 가속화합니다. 또한, 우리는 IRE1α의 렌티 바이러스 매개 침묵을 사용하여 가속 혈관 재생의 예를 제공합니다.

설명 실험 패러다임 선택의 답사의 치료를 조사하기 위해 수정할 수 있습니다. 중요한 사실은, 강내 주사의 시점을 탐구 화합물의 특성에 따라 결정되며, 고려 조사 처리가 작용하는 메커니즘을 수행한다. 이 급속 작용 개입 재관류 (도의 속도를 가속화시킬 수있는 망막 혈관 재 아직 가속 시점에 대응하는 예를 들어, 약학 화합물 (수용체 작용제, 길항제 등)를 연구하기 위해, P14이 선택 될 수있다 2, 3A). 바이러스 성 벡터는 경우채용 충분한 시간이 승객 유전자 및 이전 시점의 완전한 표현을 허용하도록 할당되어야한다 유전자 또는 표적 유전자의 전체 침묵 (도 4)의 완전한 표현을 보장하기 위해 선택 될 수있다. 렌티 바이러스 기반의 벡터는 특히 인해 급속한 표현, 낮은 염증 반응 및 생산 (24, 25)의 용이성이 점에서 적합합니다. 그것은 표적 유전자가 적절한 망막 세포 인구 (RGC, 내피 세포, 뮐러 세포 등)에 전달되며, 따라서 선택한 바이러스 벡터의 굴곡 운동이 고려되어야 함을 특정하는 것도 중요합니다. 또한, 유전자 변형 또는 녹아웃 동물을 사용하여 혈관 재생에있는 유전자의 역할을 공부하는 안구 내 주사를 수행하기 위해 필요로하지 않는 장점을 제공합니다.

그림 1 그림 1.. 마우스 새끼와 수유부는 P12로 P7에서 75 %의 O 2에 노출 된 마우스 OIR 모델의 개략도. 꾸준한 O 2 납품 및 산소 농도와 환기 산소 챔버가 필요합니다. 이 초기 기간 동안, 망막 혈관 폐색이 발생합니다. P12에서, 마우스는 최대 병리학 사전 망막 터프가 발생 P17까지 실내 공기 (21 % O 2)로 돌아갑니다. 신생 혈관은 다음과 같은 일 동안 후퇴. 혈관 재생을 조사하는 이상적인 기간은 P12과 P17 사이의 창입니다. 혈관 폐색의 정도에 대한 몇 가지 시점을 샘플링하고 평가하는 것은 재관류 술의 정확한 비율을 해명하는 열쇠입니다.

그림 2
그림 2. 산소에 의한 혈관 oblite 다음과 같은 망막 혈관 재 형성의 시간 코스배급. 망막 flatmounting 절차 A)를 그래픽으로 보여줍니다. 절개는 각막 (검은 회색 돔)의 상단과 공막 (빨간 점선 라인)을 통해 이루어지고, 망막 밖으로 조롱. 렌즈는 각막 / 공막을 개봉 한 후, 또는 공막은 도면에 도시 된 바와 같이 제거되면도 추출 할 수있다. Hyaloid 혈관 다음 제거하고 수행 망막 혈관의 염색됩니다. 염색 프로토콜이 완료되면, 망막은 다음 4 동일한 간격 섹션으로 잘라 현미경 슬라이드 선박 측입니다. B) OIR을 실시 마우스의 렉틴 염색 flatmount 망막에 장착된다. 혈관 재생으로, (여기에 P12의 최대) 혈관 폐색의 면적은 병적 인 혈관 신생은 P17에서 최대이며 렉틴 스테인드 OIR의 망막에있는 포화 반점으로 나타납니다 인치 채 웁니다. P19-P21으로 망막이 완전히 자신의 혈관 네트워크를 재생했다. (이 그림은 비네 등. 세포 대사 2013 25에서 수정되었습니다)

<P 클래스 = "jove_content"FO : 유지 - together.within 페이지를 = "항상"> 그림 3
네트 린 1. 망막 혈관 재생을 촉진 주사 치료의 그림 3 예. A), 네트 린 (1)는 P17에서 평가 혈관 재성장 P14과 범위에 주입된다. 혈관 재생에서 용량 의존적 증가가 관찰된다. B) 혈관 무결성 저 분자량 형광 덱스 트란과 함께 관류에 의해 평가 될 수있다. 혈관이 손상된 장벽 기능을 표시하는 경우, 형광 덱스 트란은 선박 (화살표) 외부에 누출됩니다. (이 그림은 비네 등. 세포 대사 2013 25에서 수정되었습니다)

그림 4
유전자 침묵 위스콘신의 그림 4. 예일 망막 혈관 재생을 위해 shRNAs 렌티 바이러스 - 전달 :. Lv.shIRE1α 혈관 재생을 돕기 위해 망막 신경절 신경 세포 IRE1α의 유전자 침묵의 능력을 평가하기 위해, shIRE1α의 렌티 바이러스 코딩의 유리체 강내 주사는 충분한 시간을 허용하도록 P3에 주입 혈관의 성장과 혈관 폐색이 평가 될 때 유전자 침묵하십시오. 이 예에서 사용 된 제 3 세대 렌티 바이러스가 세포막을 대상으로 설계 수정 포성 구내염 바이러스 당 단백질 (VSV-G)를 포함하고 있습니다. 이 벡터가 효율적으로 망막 신경절 세포를 감염 있지만, 표현은 다른 지방 세포 유형도를 알 수있다. (A)이 치료는 나중에 지점에서 측정 된 혈관 폐색의 모든 관찰 혜택이 증가 혈관 재생에 의한 것을 의미, P12에서 결정된 바와 같이 산소에 의한 혈관 폐색에 눈에 띄는 변화로 연결되지 않았다. IRE1α의 (B) 억제 나N이 패러다임이 극적으로 P17의 OIR의 재성장 단계에서 혈관 재생을 강화했다. 같은 P14와 같은 혈관 폐색의 세 번째 점을 평가 (C) (이 그림은 비네 등. 세포 대사 2013 25에서 수정 된), 재관류 술의 정확한 가격을 결정하기 위해 필요합니다. (이 그림은 Joyal 등. 혈액 2011 24에서 수정 된) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

허혈성 신경 조직의 새로운 건강한 혈관의 성장을 촉진하는 가장 효과적인 방법은 무엇입니까? 그것은 방해하고 혈관 재성장을 자연적으로 발생하는 가속 치료 유효합니까? 허혈성 망막 병증이나 뇌졸중과 같은 신경 허혈성 병변에서 혈관 변성 감소 된 신경 세포의 기능을 35 ~ 38과 연결되어 있습니다. 따라서 질병의 초기 / 즉시 세그먼트 동안 지역의 미세 순환을 복직, 초기 부상에 대응하기 위해하는 것은 도움이 증명할 수 있습니다. 안구 맥락에서, 허혈성 망막의 혈관 재 형성을 촉진 실험 패러다임은 병적 인 혈관 신생 21-25, 34 따라서이 방법의 장점 추가 조사를 줄일 수 있습니다.

20 년 전에 도입 이후, OIR 모델 (27)은 망막 혈관 신생 연구 30를 혁명하고 있습니다. 여기에서 우리는 미래의 스트랫을 연구하는이 모델에 대한 추가 응용 프로그램을 제공허혈성 망막에있는 생리적 인 혈관의 재생을 조절하는 egies. 이상적인 동물 모델은 인간의 병리 생리학에 근접, 높은 재현성, 이상적으로 신속하게 실행하고, 낮은 비용과 같은 몇 가지 기준을 포함​​해야한다. OIR의 마우스 모델은 모두 이러한 기준을 충족하고 수행 아웃 할 수있는보다 3 주.

수많은 명시된 혜택에도 불구하고, 단점은 이전의 분석에 마우스를 희생하는 현재의 필요를 포함하고 그러므로 동물의 정확한 종 모니터링은 현재 이미징 도구를 아직 할 수 없습니다. 현재, 이러한 10월 또는 형광 안저 촬영 등의 생체 내 이미징 기술로 인해 관련이없는 망막의 가장 중심 지역에 화상 범위 39 감소 마우스 눈 (곡률 반경 및 작은 크기)의 고유 광학 제한에 크게 실패하는 모델의 초기 단계.

P로 혈관 재생을 연구하기 위해 사용하는 경우이 프로토콜 종이에 roposed, 신생 혈관을 공부에 적용되는 고려 사항도 모니터링해야합니다. 이들은 주로 혈관 신생 (32)에 영향을 미치는 강아지의 신진 대사 상태를 추정하는 기록 동물의 체중이 (가) 있습니다. 과 산소 챔버의 산소 분압의 정확한 제어도 중요하다. 산소 농도의 변화는 필연적으로 중요한 데이터를 잘못 해석으로 이어질 수 vasoobliteration에 직접적인 영향을 가지고 있습니다. 그것은 따라서 챔버의 산소 농도를 지속적으로 전자 모니터링을 구현하거나 적어도에서, 산소 수준에 매일 변화를 모니터링하고 일정한 산소 수준을 유지하기 위해 oxycycler 문 개방을 제한하거나하는 것이 좋습니다. 망막의 최적 처리도 연습이 필요합니다. 추출, 설치 및 망막의 염색이 상대적으로 약해 망막주의하여 실행해야합니다 섬세하게 처리해야합니다. 또한, 유전자 변형 동물, 식민지 C의 유전 적 부동 (genetic drift) 모든 실험에 대한로혼동 결과. (예를 들어 마우스에서 콜로니) 선택적 힘의 부재하에, 또는 대립 유전자 드리프트 시간의 짧은 기간 동안 인구의 큰 변화로 이어질 수있는 임의의 공정이다. 대립 유전자 주파수는 세대에서 세대로 변경하고 하위 집단 (40), (41)의 형성을 초래할 수 있습니다. 이러한 돌연변이는 큰폭으로 탐지하고 동일한 콜로니에서 동일한 증식 쌍에 의해 생성 세대의 수를 제한하는 것이 중요하다. 가장 높은 유전 적 안정성을 달성하기위한 가장 효율적인 방법은 매 5 세대 "주식"을 새로 고치거나 동일한 배경의 구입 마우스로 역 교배로 진행하는 것입니다.

또한 망막 변성 돌연변이 (RD) 1 8 42 번 이상을 테스트하는 것이 좋습니다 조기 시세포 변성에 기인 할 수있다 표현형을 혼동하지 않도록하기 위해 새로운 라인을 시작하기 전에. 형질 전환 동물의 경우,그것은 제어 및 돌연변이 생쥐가 모두 동일한 공급 업체에서 얻은 같은 유전 적 배경에 필요합니다되는 것을 보장하기 위해 매우 중요합니다.

우리는 혈관 형성과 성장의 분자 메커니즘을 해명하기 위해 지속적으로, 소설은, 가속 속도가 느린, 또는 신생 혈관이 발생하고 조종에 접근한다. 혈관의 조절이 병적 인 상황에서 생체 내에서 탐색 할 수있는 모델 시스템은 중추 신경계 내에서 신경 세포의 허혈에 대응하기 위해 미래 치료의 패러다임을 탐구 할 수있는 유용한 도구를 제공 할 수 있습니다. 혈관 재생을 연구하는 마우스 OIR 모델을 적응하는 등의 장소를 제공하고, 생리 학적 및 병리학 적 혈관 신생의 분자 기초에 대한 우리의 이해를 증진 할 수있는 유용한 도구가 될 것입니다.

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Disclosures

저자가 공개하는 게 없다.

Acknowledgments

PS는 망막 세포 생물학에있는 캐나다 연구 의자와 알콘 연구소의 새로운 탐정 상을 보유하고있다. 이 작품은 건강 연구의 캐나다 연구소 (221478)에서 교부금에 의해 지원되었다, 캐나다 당뇨병 협회 (OG​​ -3 - 11-3329 - PS), 캐나다 자연 과학 및 공학 연구위원회 (418637)와 재단 파이팅 실명 캐나다. 지원은 RESEAU 드 공들인 엉 상테 드 라 비전 뒤 퀘벡에 의해 제공되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57Bl/6 mice (Other strains may be used; angiogenic response varies from one strain to the other)
CD1 nursing mothers Vendor of choice
Operating Scissors straight World Precision Instruments 14192
Dissecting Scissors straight World Precision Instruments 14393
Vannas Eye Scissors Harvard Apparatus 72-8483
Iris Forceps, curved, serrated World Precision Instruments 15915
Brushes 362R size 0 Dynasty
Dumont Forceps #3; straight World Precision Instruments 500338
Surgical Blade, size 10 Bard-Parker 371110
Rhodamine Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I Vector Laboratories, Inc RL-1102
Microscope slides VWR 16004-368
Fluoromount G Electron Microscopy Sciences 17984-25
Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Phase and Fluorescence Microscope Zeiss
Leica MZ9.5 Stereomicroscope Leica
Fluorescein isothicyanate-dextran, 70000 Sigma-Aldrich 46945

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마우스 망막을 사용하여 중추 신경계의 혈관 재생의 평가
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Miloudi, K., Dejda, A., Binet, F., Lapalme, E., Cerani, A., Sapieha, P. Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (88), e51351, doi:10.3791/51351 (2014).More

Miloudi, K., Dejda, A., Binet, F., Lapalme, E., Cerani, A., Sapieha, P. Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (88), e51351, doi:10.3791/51351 (2014).

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