Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Assessment of Vascular Regeneration i CNS Bruke musen Retina

doi: 10.3791/51351 Published: June 23, 2014

Summary

Den gnager retina har lenge vært anerkjent som et tilgjengelig vinduet til hjernen. I dette tekniske papir gir vi en protokoll som anvender musemodell av oksygen-indusert retinopati for å studere de mekanismer som fører til svikt av vaskulær regenereringen innenfor sentralnervesystemet etter iskemisk skade. Den beskrevne systemet kan også bli brukt til å utforske strategier for å fremme gjenvekst av funksjonelle blodkar i netthinnen og CNS.

Abstract

Den gnager retina er kanskje den mest tilgjengelige pattedyrsystem hvor undersøke neurovaskulær samspill i sentralnervesystemet (CNS). Det er i økende grad erkjent at flere neurodegenerative sykdommer så som Alzheimers, multippel sklerose og amyotrofisk lateral sklerose stede elementer av vaskulær kompromiss. I tillegg er de mest fremtredende årsakene til blindhet hos barn og yrkesaktiv alder populasjoner (retinopati hos premature og diabetisk retinopati, henholdsvis) preget av vaskulær degenerasjon og svikt i fysiologiske vaskulær gjenvekst. Målet med denne tekniske artikkelen er å gi en detaljert protokoll for å studere CNS vaskulær regenerering i netthinnen. Fremgangsmåten kan anvendes til å belyse molekylære mekanismer som fører til svikt i vaskulær vekst etter iskemisk skade. I tillegg, kan potensielle terapeutiske metoder for å akselerere og gjenopprette sunn vaskulære plexuses bli utforsket. Funn obtained hjelp av den beskrevne metode kan gi terapeutiske muligheter for iskemiske retinopatier, som det av diabetes eller for tidlig fødsel og eventuelt benytte andre vaskulære forstyrrelser i sentralnervesystemet.

Introduction

Gjennom CNS utvikling, nerver, immunceller og blodårer etablere bemerkelsesverdig kombinert nettverk for å sikre tilstrekkelig vevsperfusjon og tillate overføring av sensorisk informasjon 1-5. Fordelingen av vaskulære systemer resulterer i utilstrekkelig vevsoksygenering og kompromittert metabolske tilbud og er i økende grad anerkjent som en viktig bidragsyter til patogenesen av nevrodegenerative sykdommer seks. Vaskulær frafall og forringelse av neurovascular enheten i hjernen, for eksempel, er assosiert med vaskulær demens, vaskulære lesjoner i den hvite substans i hjernen 7 og Alzheimers sykdom med stenose av arterioler og mindre fartøy 8. I tillegg er nedsatt vaskulær barrierefunksjon antatt å bidra multippel sklerose 9 og amyotrofisk lateral sklerose 10..

Av direkte relevans til retinal modellen beskrevet i denne protokollen, blindingsykdommer slik som diabetisk retinopati 11 og prematuritetsretinopati 12, 13 er kjennetegnet ved en tidlig fase av vaskulær degenerasjon. Den påfølgende iskemisk stress på neurovascular retina utløser en andre fase av overdreven og patologiske neovaskularisering som sannsynligvis stammer som kompensasjons respons på re-instate oksygen og energiforsyning 14-16. En attraktiv strategi for å overvinne den iskemiske stress som er sentralt for sykdomsutvikling, er å gjenopprette funksjonelle vaskulære nettverk spesifikt i de iskemiske soner av neuro-retina (figurene 2 og 3). Provoserte en kontrollert angiogent respons kan komme over som bakvendt for en tilstand der anti-angiogenic behandlinger som for eksempel anti-VEGFs anses som tilpasset behandling. Likevel, er bevis for gyldigheten av denne tilnærmingen montering. For eksempel styrke "fysiologisk-aktig" vaskulær gjenvekst i ischemic retinopathies har blitt elegant demonstrert gjennom innføring av endothelial forløper celler 17, hemming av Müller celle-uttrykt VEGF indusert nedregulering av andre angiogenetiske faktorer 18, injeksjon av myeloide stamceller 19, hemming av NADPH oksidase indusert apoptose 20, økende kosttilskudd ω-3 flerumettede fettsyrer syre inntak 21, behandling med et karboksyl-terminalt fragment av tryptofan tRNA syntetase 22, og direkte tilførsel av VEGF eller FGF-2 for beskyttelse av gliaceller 23. Videre har vi vist at moduler klassiske nevronale veiledning signaler som Semaphorins eller Netrins i iskemiske retinopathies akselererer vaskulær regenerering av sunne fartøy innenfor netthinnen og dermed reduserer patologisk angiogenese 24, 25. Av direkte klinisk relevans, flere av de nevnte dyrestudier gir bevis for at fremme vaskulær reutvikling under den tidlige fase av ischemisk retinopatier kan redusere synstruende pre-retinal neovaskularisering 19, 23, 24, 26, sannsynligvis ved å redusere iskemisk byrde.

Devising terapeutiske strategier som stimulerer regenerering av funksjonelle skip er fortsatt en betydelig utfordring for vaskulære biologer. Her beskriver vi en eksperimentell system som benytter mus modell av oksygen-indusert retinopati (OIR) for å utforske strategier for å modulere vaskulær gjenvekst i netthinnen. Utviklet av Smith et al. I 1994 27, fungerer denne modellen som en proxy for menneske proliferative retinopathies og består av å utsette P7 museunger til 75% O 2 til P12 og senere gjeninnføre valpene til omgivelses O 2-spenning (Figur 1). Dette paradigmet løst etterligner et scenario der et prematurt barn er ventilertmed O 2. Eksponeringen av museunger til hyperoksi provoserer degenerasjon av netthinnens blodkar og microvasculature, og gir en reproduserbar område av vaso-utslettelse (VO) vanligvis undersøkes ved avkjørsel fra O 2 ved P12, selv om maksimal VO området er nådd ved 48 hr (P9) etter eksponering for O 2 28. I mus, den avaskulære soner VO spontant regenereres i løpet av uken etter re-innføring i luften i rommet, og til slutt VO soner er fullstendig re-vascularized (figur 2). Re-introduksjon til romluften av mus utsatt for OIR provoserer også pre-retinal neovascularization (NV) (maksimalt på P17) som vanligvis vurderes for å fastslå effekten av anti-angiogenic behandling paradigmer. I sin reneste form, gir OIR modellen en svært reproduserbare og kvantifiserbare verktøy for å vurdere oksygen-indusert vaskulær degenerasjon og fastslå omfanget av destruktiv pre-retinal neovascularization 29-31.

30, 31. Her gir vi en enkel steg-for-trinn prosedyre for å undersøke modulering av fysiologiske revaskularisering innen nevrale netthinnen av farmakologiske stoffer, potensielle legemiddelselskap, virale vektorer eller for å studere betydningen av kandidatgener i genmodifiserte eller knockout mus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etikk uttalelse: Alle dyreforsøk overholder retningslinjene dyr omsorg fastsatt av Association for Research in Visjon og Ophthalmology (Arvo) Erklæring for bruk av dyr i Ophthalmic og Visjon Forskning og Canadian Council of Animal Care.

En. Oksygen Induced retinopati (OIR)

  1. Record fødselsdato museunger som P0.
  2. Registrere alle vekter av dyr ved inngåelse O 2 for å sikre en tilstrekkelig vekt rekkevidde. Merk: For C57BL / 6 mus ved P17, bør kroppsvekt varierer mellom 5 og 7,5 g for maksimal NV 32. For å opprettholde miljø konsistens, er det anbefalt å bruke littermates som kontroll (for genetisk modifiserte mus og mus som mottar eksperimentelle behandlinger). Ved vurdering av effektene av en viral vektor, må man vurdere tropisme av viruset og gi tilstrekkelig tid for fulle uttrykk for viralt levert transgener. Raskt uttrykke viralvektorer som for eksempel 3 rd genererings lentiviruses 24, 25, 33 anbefales.
  3. Plasser museunger på P7 (C57BL / 6 eller ønsket belastning) og en CD1 fremme mor til et oksygenkammer satt til 75% O 2 for 5 dager 27. Miljø luftfuktighet og temperatur ble holdt konstant gjennom O 2 eksponering. Merk: Forskning fasiliteter utstyrt med en sentral kilde til O 2 er ideelle og begrense tungvint utskifting av tomt O 2 tanker. Hvis du arbeider med transgene eller knockout mus, er det viktig å sikre at kontroll-og eksperiment mus er ervervet fra den samme leverandøren for å begrense genetiske driver innenfor de samme påkjenningene 30, 29.
  4. Ved P12, fjerner mus fra oksygenkammeret og returnere dyr til omgivelses O 2.

2. Intravitreal injeksjon for levering av forbindelser til Indre Retina (Whno vurdere effekter av en Farmakologisk Compound eller rekombinant protein)

  1. På P14, bedøve mus med 2% isofluran i oksygen 2 L / min (eller dyrevern komité-godkjent bedøvelse av valget). For å verifisere effektiviteten av anestesi, sekvensielt klemme halen, bakre fot og øre med tang.
  2. Plasser musen på buken.
  3. Ved hjelp av et sterilt 10 mL sprøyte utstyrt med en avfaset trukket glassålen, utføre en injeksjon av et maksimalt volum av 1 ul oppløsning inneholdende forbindelsen som undersøkes eller vehikkel (fysiologisk saltoppløsning) i bakre limbus i øyet, med en 45 ° vinkel unngå linsen. Merk: Det trekkes glassålen er festet til sprøyten ved hjelp av en dråpe av epoksy-harpiks.
  4. Påfør en dråpe glidemiddel ophthalmic salve (helst med antibiotika) med en bomullspinne til musen øye.
  5. Returner musen tilbake til buret med fremme mor. Mus er så nøye overvåkes inntil redekket og fullt oppegående.

Tre. Vurdering av fartøyet Perfusjons og barrierefunksjon (Integrity) ved fluoresceinangiografi

  1. Anesthetize mus med 2% isofluran i oksygen 2 L / min (eller dyrevern komité-godkjent bedøvelse av valget). For å verifisere effektiviteten av anestesi, sekvensielt klemme halen, bakre fot og øre med tang. Merk: Dette er vanligvis utføres på P17 når regenerering vurderes. Også bære ut analyse ved P19 og P21 for å bestemme om vaskulær integritet beholdes over tid.
  2. Når bedøvet, veie musen.
  3. Gjør en midtlinjen magen snittet med dissekere saks. Merk: Dissekere instrumenter skal regelmessig kontrolleres og skjerpet.
  4. Skjær ribben sidelengs og heve brystkasse ved hjelp av tang. Merk: Det er nødvendig å skjære i sideretningen som mulig for å unngå skade på hjertet.
  5. Etter å ha fjernet peripHeral vev fra hjertet, klemme synkende aorta med hemostatic tang.
  6. Sakte injisere fluorescein-dekstran til venstre ventrikkel ved å bruke en 25 G nål. Merk: Hvis vaskulær barrierefunksjonen er undersøkt, er 70 kDa fluorescein-dekstran ansatt som det vil lekke ut av fartøyene når fartøy integritet er kompromittert. Hvis undersøkeren ønsker å kaste blodkar, er to MDA fluorescein-dekstran brukt. Kritiske trinn: 1) For å sikre en homogen repartisjonere, sentrifuge fluorescein-dekstran og sprøyter supernatanten, 2) For å forhindre at fartøy innsnevring, injiserer varmet fluorescein-dekstranoppløsning, 3) Opplaget tid bør ikke overskytende 4 min.
  7. Halshogge mus 2 min etter injeksjon med drifts saks.

4. Enukleasjon og øyefiksjon

Merk: Ved vurdering av forekomst av vaskulær regenerasjon, først samle netthinne på P12 og i tillegg på P14 og P17. Øke antallet av samples tidspunktets for mer nøyaktig bestemmelse av priser av revaskularisering 24.

  1. Vipp musehodet og plasser den på høykant.
  2. Fjern skinnet og øyelokk som dekker øyet med dissekere saks.
  3. Plasser buet tang under øyet og dra det forsiktig opp til synsnerven blir kuttet.
  4. Snu musen hode på sitt andre siden og utføre de samme trinnene (trinn 4,2 og 4,3).
  5. For å sikre en bedre gjennomtrengning av bindemiddel, punktere et hull i det fremre kammer av øyet ved hjelp av 30 G nål.
  6. Overfør øynene til et rør inneholdende 4% paraformaldehyd (PFA) og rette i 1 time ved romtemperatur.
  7. Fjern PFA og vask øynene 4 ganger med en oppløsning av iskald PBS.

5. Netthinne Dissection

  1. Plasser muse øyne i en petriskål med kald PBS og utføre disseksjon av netthinne under et stereomikroskop.
  2. Fjern ekstra fett / vevet rundt øyet med mikro-disseksjon scissors.
  3. Klipp av hornhinnen med mikro-disseksjon saks.
  4. Ved hjelp av to par tang, minutt skrelle sclera vekk fra periferien mot synsnerven og kast.
  5. Klem linsen (hvitaktig ball under hornhinnen) med pinsett og trekke det fra øyet cup. Bruk av en pinsett som en støtte, og den andre for å gripe og forsiktig løfte og fjerne linsen.
  6. Løsne hyaloid fartøyer fra innsiden av netthinnen ved hjelp av små børster (størrelse 0) og tang.
  7. Fjern bunter av hyaloid fartøy koblet til optisk plate ved hjelp av tang.
  8. Overføring dissekert netthinne til 2 ml mikrosentrifugerør inneholder PBS og legg på is før du starter fargeprosedyre.

6. Retinal vaskulær Farging

  1. Inkuber dissekert netthinne over natten med forsiktig risting ved 4 ° C i en løsning av fluorescensmerket sammen-isolectin B4 (rhodamin-lektin eller annet) i PBS inneholdende 1 mM CaCl 2
  2. På den følgende dag, fjerner flekker løsningen og vask netthinne 3 x i PBS i 10 min ved romtemperatur.

7. Utarbeidelse av Netthinne Flatmounts

  1. Overfør netthinne, fotoreseptoren-side ned, på et objektglass og lage fire dype like langt radial snitt ved hjelp av en kirurgisk skalpell til å dele netthinnen inn i fire like store kvadranter. I løpet av snittene, spenne netthinnen med en børste slik at det ikke beveger seg.
  2. Ved hjelp av to børster dynket i PBS, forsiktig flate kvadranter fotoreseptoren side-ned og fordype netthinnen i monteringsmedium for å hindre foto-bleking. Deretter forsiktig plassere et dekkglass på overflaten av det monterte hinnen uten påføring av trykk, og å sørge for at luftbobler ikke akkumuleres under dekkglass. </ Li>

8. Imaging og Kvantifisering av Vasoobliteration (VO) og neovaskularisering (NV) som tidligere beskrevet 31

  1. Ta bilder av hele monterte netthinne med et epi-fluorescens-mikroskop med en forstørrelse på 10X.
  2. Åpne retinal bildet i bildebehandlingsprogram, sy sammen og måle total retinal området, og avascular området. Området kan uttrykkes i piksler.
  3. Bestem omfanget av VO ved å dele antall piksler i avascular område med antall piksler i total retinal området.
  4. Bestem omfanget av NV ved å dele antall piksler i NV med antall piksler i total retinal område som beskrevet 31.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den OIR modellen er mye brukt til å studere oksygen-indusert vaskulær degenerasjon og iskemi-induserte patologiske neovaskulariseringen i netthinnen og har vært sentral i utviklingen av tiden ansatt anti-angiogenic behandlinger for øyesykdommer 27, 29, 30. Funn innhentet ved hjelp av denne modellen kan bli løst ekstrapoleres til iskemiske retinopathies som proliferativ diabetisk retinopati og retinopati hos premature 30.

Her presenterer vi en alternativ bruk av denne modellen til å studere vaskulær regenerasjon. Vi vil beskrive et eksempel på en strategi for å regenerere iskemisk netthinnen som nylig ble publisert av vår lab. I den presenterte studien, viser vi at vedvarende neuronal iskemi aktiverer endoplasmatiske retikulum (ER) stress og via en av sine effektor endoribonucleases IRE1α, kløyver mRNA av den klassiske nevronale veiledning cue netrin-en. Vi viserat intraokulære levering av Netrin-en, stimulerer et program av reparative angiogenese i netthinnens myeloide celler og dermed akselererer nevrale vev revaskularisering etter OIR 25. Videre tilbyr vi et eksempel på akselerert vaskulær regenerering bruke lentiviral mediert stanse av IRE1α.

De beskrevne eksperimentelle paradigmer kan endres for å undersøke den utforskende behandling av valget. Viktigere, er tidspunktet for intravitreal injeksjon fastsettes basert på natur utforsket sammensatte og må ta hensyn til den mekanismen som den undersøkte behandlingen fungerer. For eksempel, for å studere et farmakologisk forbindelse (reseptor-agonist,-antagonist, etc.), P14, kan velges som det svarer til et tidspunkt hvor retinal revaskularisering akselererer ennå en hurtigvirkende inngrep kan bidra til å øke hastigheten på revaskulariseringsraten (fig. 2 og 3a). Når virale vektorer eranvendes, nok tid må være tildelt for å tillate full ekspresjon av passasjer-genet og et tidligere tidspunkt, kan velges for å sikre full ekspresjon av transgenet eller fullstendig stanse av målgenet (figur 4). Lentiviral baserte vektorer er spesielt godt egnet i denne sammenheng på grunn av deres raske ekspresjon, lav inflammatorisk respons og enkel produksjon 24, 25. Det er også viktig å være sikker på at målgenet leveres til den aktuelle retinal cellepopulasjon (RGC, endotelceller, Müller Cell, etc.), derav tropisme for det valgte virale vektoren må tas i betraktning. Alternativt studere rollen av et gen i vaskulær regenerering bruke transgene eller knockout dyr har den fordelen av ikke trenger å utføre intraokulære injeksjoner.

Figur 1 Figur 1. Skjematisk fremstilling av musen OIR modell. Muse valper og ammende mødre er utsatt for 75% O 2 fra P7 til P12. En ventilert oksygenkammer med jevn O 2 levering og oksimeter er nødvendig. I løpet av denne første perioden, oppstår retinal vaso-utslettelse. På P12, er mus returnert til romluft (21% O 2) til P17 når maksimal patologisk pre-retinal tufte oppstår. Neovaskulariseringen forsvinner i løpet av de neste dagene. Den ideelle periode for å undersøke vaskulær gjenfødelse er vinduet mellom P12 og P17. Prøvetaking og vurdering av flere tidspunkter for omfanget av vaso-utslettelse er nøkkelen til å belyse nøyaktige priser av revaskularisering.

Fig. 2
Figur 2. Tid løpet av retinal revaskularisering etter oksygen-indusert vaso-obliterasjon. A) Grafisk fremstilling av en retinal flatmounting prosedyre. Et snitt er gjort gjennom toppen av hornhinnen (svart-grå kuppel) og sclera (stiplet rød linje) og netthinnen blir ertet ut. Linsen kan utvinnes enten etter åpning av cornea / sklera, eller en gang i sclera blir fjernet som vist på tegningen. Hyaloid fartøy blir deretter fjernet og farging av netthinnens fartøy utført. Når fargingen protokollen er ferdig, blir netthinnen deretter skåret i fire jevnt fordelte seksjoner, og som er montert på et objektglass fartøy-side-oppstilling. B) Lektin-farget flatmount netthinne fra mus utsatt for OIR. Som fartøy regenerere, området av vaso-utslettelse (her maximal på P12) fyller i. Patologisk neovaskulariseringen er maksimal på P17 og vises som mettede flekker i lektin farget OIR netthinne. Ved P19-P21, har netthinne fullt regenerert sine vaskulære nettverk. (Dette tallet har blitt forandret fra Binet et al. Cell Metabolism 2013 25)

<p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "always"> Figur 3
. Figur 3 Eksempel på en injeksjon behandling som akselererer retinal vaskulær regenerering: Netrin-en. A) Netrin-1 injiseres ved P14 og omfanget av vaskulær gjenvekst vurdert til P17. En doseavhengig økning i vaskulær regenerering er observert. B) vaskulær integritet kan vurderes ved perfusjon med lav molekylvekt fluorescerende dekstran. Dersom fartøyene viser nedsatt barrierefunksjon, vil den fluorescerende Dextran lekke utenfor fartøyet (piler). (Dette tallet har blitt forandret fra Binet et al. Cell Metabolism 2013 25)

Figur 4
Figur 4. Eksempel på genet stanse with lentiviral levert shRNAs for retinal vaskulær regenerering:. Lv.shIRE1α å vurdere muligheten av genet stanse av IRE1α i retinal ganglion nevroner å hjelpe vaskulær regenerasjon, ble en intravitreal injeksjon av et lentivirus koding for en shIRE1α injisert på P3 for å gi tilstrekkelig tid for genet stanse når vaskulær vekst og vaso-utslettelse vurderes. Den 3. generasjon lentivirus ansatt i dette eksempelet inneholder en modifisert vesikulær stomatitt virus glykoprotein (VSV-G), konstruert for å målrette plasmamembraner. Selv om disse vektorene effektivt å infisere retinale ganglionceller, kan uttrykket også bemerkes i andre lokale celletyper. (A) Denne behandlingen ikke førte til merkbare svingninger i oksygen-indusert vaso-utslettelse som bestemmes på P12, som betyr at alle observerte fordeler på vaso-utslettelse målt på senere tidspunkter skyldes økt vaskulær regenerasjon. (B) Hemming av IRE1α in dette paradigmet dramatisk forbedret vaskulær regenerering i gjenvekst fase av OIR på P17. (Dette tallet har blitt forandret fra Binet et al. Cell Metabolism 2013 25) (C) Vurdere en tredje gang punkt vaso-utslettelse som P14, er nødvendig for å fastslå nøyaktige priser av revaskularisering. (Dette tallet har blitt forandret fra Joyal et al. Blood 2011 24) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hva er den mest effektive måten å stimulere veksten av nye friske fartøy i iskemisk nervevev? Er det terapeutisk gyldig å forstyrre og akselerere naturlig forekommende vaskulær gjenvekst? I nevro-iskemisk patologier som iskemiske retinopathies eller hjerneslag, er vaskulær degenerasjon assosiert med redusert nervecellefunksjon 35-38. Derav å motvirke tidlig skade, gjeninnføre regionalt mikrosirkulasjonen i umiddelbar / tidlig segment av sykdom kan være gunstig. I en okulær sammenheng, eksperimentelle paradigmer som fremskynder revaskularisering av iskemisk netthinnen reduserer patologisk neovaskularisering 21-25, 34 og dermed denne tilnærmingen fortjener videre undersøkelser.

Siden introduksjonen for 20 år siden, har OIR modell 27 revolusjon retinal angiogenese forskning 30. Her gir vi en ekstra søknad for denne modellen til å studere potensielle stratringsstrategiene å modulere fysiologisk vaskulær regenerering i iskemisk netthinnen. En ideell dyremodell bør omfatte flere kriterier som nærhet til menneskelig patho-fysiologi, høy reproduserbarhet, rask gjennomføring og ideelt sett, lave kostnader. Musen modell av OIR oppfyller alle disse kriteriene, og kan gjennomføres ut i mindre enn tre uker.

Til tross for de mange børsnoterte fordeler, ulemper inkluderer dagens behov for å ofre musen før analyser og dermed nøyaktig langsgående overvåking av et dyr er ikke mulig ennå med aktuelle bildebehandlingsverktøy. For tiden, in vivo avbildningsteknikker slik som oktober eller fluoresceinangiografi er stort sett mislykket på grunn av den iboende optiske begrensning av muse øyet (krumningsradius og liten størrelse) som reduserer avbildnings dekning 39 til de sentrale områder av retina som ikke er relevante for de tidlige stadier av modellen.

Når ansatt for å studere vaskulær regenerering som proposed i denne protokollen papir, bør alle hensyn som gjelder for å studere neovaskulariseringen også overvåkes. Disse inkluderer opptak dyr vekt for å beregne metabolsk helse av valpen, som sterkt påvirker angiogenese 32. Nøyaktig kontroll av oksygenspenning i hyperoksisk kammeret er også kritisk. Variasjon i oksygenkonsentrasjonen har en direkte innvirkning på vasoobliteration, som uunngåelig kan føre til kritiske data feiltolkning. Det anbefales derfor å enten implementere kontinuerlig elektronisk overvåking av kammeroksygenkonsentrasjon eller i det minste, overvåke daglige endringer i oksygennivået og begrense oxycycler døråpningen for å opprettholde konstant oksygennivå. Optimal behandling av netthinne tar også praksis. Utvinning, montering og farging av netthinnen må utføres med forsiktighet ettersom den relativt skjøre netthinnen må delikat håndteres. I tillegg, som for alle forsøk med genetisk modifiserte dyr, den genetisk drift av en koloni cen forvirre resultater. I fravær av et selektivt kraft (i en musekolonien for eksempel), er alleliske eller genetisk drift en tilfeldig prosess som kan føre til store endringer i populasjonen i løpet av en kort tidsperiode. Allelfrekvensene kan endre seg fra generasjon til generasjon, og resultere i dannelse av en sub-koloni 40, 41. Disse mutasjonene er stort sett umulig å oppdage, og det er derfor viktig å begrense antall generasjoner produsert av de samme oppdretter parene i samme koloni. Den mest effektive måten å oppnå den høyeste genetiske stabilitet er å oppdatere "aksjer" hvert femte generasjoner eller fortsette å tilbakekryssing med en kjøpt mus med identisk bakgrunn.

Det er også anbefalt å teste for retinal degenerasjon mutasjoner (rd) 1 og 8 42, minst en gang før du starter en ny linje for å unngå confounding fenotyper som kan henføres til for tidlig fotoreseptor degenerasjon. For transgene dyr,er det viktig å sikre at både kontroll-og mutant-mus ble oppnådd fra den samme produsent og er nødvendigvis på den samme genetiske bakgrunn.

Som vi fortsette å belyse de molekylære mekanismene blodkar dannelse og vekst av, nærmer romanen å akselerere, treg, eller styre begynnende blodårer er oppstått. Et modellsystem hvori modulering av vaskularisering kan bli undersøkt in vivo i en patologisk sammenheng kan gi et verdifullt verktøy for å oppdage potensielle terapeutiske paradigmer å motvirke neuronal iskemi i CNS. Tilpasning av mus OIR modell for å studere vaskulær regenerering gir en slik arena, og vil fortsette å være et verdifullt verktøy for å videreutvikle vår forståelse av det molekylære grunnlaget for fysiologiske og patologiske angiogenese.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

PS har en Canada Research Chair i Netthinne Cell Biology og Alcon Research Institute New Investigator Award. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra den kanadiske Institutes of Health Research (221478), den kanadiske Diabetes Association (OG-3-11-3329-PS), naturvitenskap og Engineering Research Council of Canada (418637) og Stiftelsen Fighting Blindness Canada. Støtte ble også gitt av Réseau de Recherche en Santé de la Vision du Québec.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57Bl/6 mice (Other strains may be used; angiogenic response varies from one strain to the other)
CD1 nursing mothers Vendor of choice
Operating Scissors straight World Precision Instruments 14192
Dissecting Scissors straight World Precision Instruments 14393
Vannas Eye Scissors Harvard Apparatus 72-8483
Iris Forceps, curved, serrated World Precision Instruments 15915
Brushes 362R size 0 Dynasty
Dumont Forceps #3; straight World Precision Instruments 500338
Surgical Blade, size 10 Bard-Parker 371110
Rhodamine Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I Vector Laboratories, Inc RL-1102
Microscope slides VWR 16004-368
Fluoromount G Electron Microscopy Sciences 17984-25
Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Phase and Fluorescence Microscope Zeiss
Leica MZ9.5 Stereomicroscope Leica
Fluorescein isothicyanate-dextran, 70000 Sigma-Aldrich 46945

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carmeliet, P., Tessier-Lavigne, M. Common mechanisms of nerve and blood vessel wiring. Nature. 436, 193-200 (2005).
  2. Eichmann, A., Thomas, J. L. Molecular Parallels between Neural and Vascular Development. Cold Spring Harb Perspect Med. 3, (2012).
  3. Larrivee, B., Freitas, C., Suchting, S., Brunet, I., Eichmann, A. Guidance of vascular development: lessons from the nervous system. Circ Res. 104, 428-441 (2009).
  4. Stefater Iii, J. A., et al. Regulation of angiogenesis by a non-canonical Wnt-Flt1 pathway in myeloid cells. Nature. 474, 511-515 (2011).
  5. Checchin, D., Sennlaub, F., Levavasseur, E., Leduc, M., Chemtob, S. Potential role of microglia in retinal blood vessel formation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 3595-3602 (2006).
  6. Quaegebeur, A., Lange, C., Carmeliet, P. The neurovascular link in health and disease: molecular mechanisms and therapeutic implications. Neuron. 71, 406-424 (2011).
  7. Yamamoto, Y., Craggs, L., Baumann, M., Kalimo, H., Kalaria, R. N. Review: molecular genetics and pathology of hereditary small vessel diseases of the brain. Neuropathol Appl Neurobiol. 37, 94-113 (2011).
  8. Brun, A., Englund, E. A white matter disorder in dementia of the Alzheimer type: a pathoanatomical study. Ann Neurol. 19, 253-262 (1986).
  9. Prat, A., et al. Migration of multiple sclerosis lymphocytes through brain endothelium. Arch Neurol. 59, 391-397 (2002).
  10. Rule, R. R., Schuff, N., Miller, R. G., Weiner, M. W. Gray matter perfusion correlates with disease severity in ALS. Neurology. 74, 821-827 (2010).
  11. Antonetti, D. A., Klein, R., Gardner, T. W. Diabetic retinopathy. N Engl J Med. 366, 1227-1239 (2012).
  12. Hartnett, M. E., Penn, J. S. Mechanisms and management of retinopathy of prematurity. N Engl J Med. 367, 2515-2526 (2012).
  13. Sapieha, P., et al. Retinopathy of prematurity: understanding ischemic retinal vasculopathies at an extreme of life. J Clin Invest. 120, 3022-3032 (2010).
  14. Chen, J., Smith, L. Retinopathy of prematurity. Angiogenesis. 10, 133-140 (2007).
  15. Cheung, N. Diabetic retinopathy and systemic vascular complications. Progress in Retinal and Eye Research. 27, 161-176 (2008).
  16. Smith, L. E. Through the eyes of a child: understanding retinopathy through ROP the Friedenwald lecture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 5177-5182 (2008).
  17. Caballero, S., et al. Ischemic vascular damage can be repaired by healthy, but not diabetic, endothelial progenitor cells. Diabetes. 56, 960-967 (2007).
  18. Wang, H., et al. VEGF-mediated STAT3 activation inhibits retinal vascularization by down-regulating local erythropoietin expression. Am J Pathol. 180, 1243-1253 (2012).
  19. Ritter, M. R., et al. Myeloid progenitors differentiate into microglia and promote vascular repair in a model of ischemic retinopathy. J Clin Invest. 116, 3266-3276 (2006).
  20. Saito, Y., Geisen, P., Uppal, A., Hartnett, M. E. Inhibition of NAD(P)H oxidase reduces apoptosis and avascular retina in an animal model of retinopathy of prematurity. Mol Vis. 13, 840-853 (2007).
  21. Connor, K. M., et al. Increased dietary intake of omega-3-polyunsaturated fatty acids reduces pathological retinal angiogenesis. Nat Med. 13, 868-873 (2007).
  22. Banin, E., et al. T2-TrpRS inhibits preretinal neovascularization and enhances physiological vascular regrowth in OIR as assessed by a new method of quantification. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 2125-2134 (2006).
  23. Dorrell, M. I., et al. Maintaining retinal astrocytes normalizes revascularization and prevents vascular pathology associated with oxygen-induced retinopathy. Glia. 58, 43-54 (2010).
  24. Joyal, J. -S., et al. Ischemic neurons prevent vascular regeneration of neural tissue by secreting semaphorin 3A. Blood. 117, 6024-6035 (2011).
  25. Binet, F., et al. Neuronal ER Stress Impedes Myeloid-Cell-Induced Vascular Regeneration through IRE1alpha Degradation of Netrin-1. Cell Metab. 17, 353-371 (2013).
  26. Fukushima, Y., et al. Sema3E-PlexinD1 signaling selectively suppresses disoriented angiogenesis in ischemic retinopathy in mice. J Clin Invest. 121, 1974-1985 (2011).
  27. Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Invest Ophthalmol Vis Sci. 35, 101-111 (1994).
  28. Lange, C., et al. Kinetics of retinal vaso-obliteration and neovascularisation in the oxygen-induced retinopathy (OIR) mouse model. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 247, 1205-1211 (2009).
  29. Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4, 1565-1573 (2009).
  30. Stahl, A., et al. The mouse retina as an angiogenesis model. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 2813-2826 (2010).
  31. Stahl, A., et al. Computer-aided quantification of retinal neovascularization. Angiogenesis. 12, 297-301 (2009).
  32. Stahl, A., et al. Postnatal Weight Gain Modifies Severity and Functional Outcome of Oxygen-Induced Proliferative Retinopathy. Am J Pathol. 177, 2715-2723 (2010).
  33. Cerani, A., et al. Neuron-Derived Semaphorin 3A is an Early Inducer of Vascular Permeability in Diabetic Retinopathy via Neuropilin-1. Cell Metabolism. 18, 505-518 (2013).
  34. Sapieha, P. Eyeing central neurons in vascular growth and reparative angiogenesis. Blood. 120, 2182-2194 (2012).
  35. Dorfman, A., Dembinska, O., Chemtob, S., Lachapelle, P. Early manifestations of postnatal hyperoxia on the retinal structure and function of the neonatal rat. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 458-466 (2008).
  36. Dorfman, A. L., Joly, S., Hardy, P., Chemtob, S., Lachapelle, P. The effect of oxygen and light on the structure and function of the neonatal rat retina. Doc Ophthalmol. 118, 37-54 (2009).
  37. Chopp, M., Zhang, Z. G., Jiang, Q. Neurogenesis, angiogenesis, and MRI indices of functional recovery from stroke. Stroke. 38, 827-831 (2007).
  38. Li, L., et al. Angiogenesis and improved cerebral blood flow in the ischemic boundary area detected by MRI after administration of sildenafil to rats with embolic stroke. Brain Res. 1132, 185-192 (2007).
  39. Robinson, R., Barathi, V. A., Chaurasia, S. S., Wong, T. Y., Kern, T. S. Update on animal models of diabetic retinopathy: from molecular approaches to mice and higher mammals. Dis Model Mech. 5, 444-456 (2012).
  40. Chia, R., Achilli, F., Festing, M. F., Fisher, E. M. The origins and uses of mouse outbred stocks. Nat Genet. 37, 1181-1186 (2005).
  41. Jenuth, J. P., Peterson, A. C., Shoubridge, E. A. Tissue-specific selection for different mtDNA genotypes in heteroplasmic mice. Nat Genet. 16, 93-95 (1997).
  42. Mattapallil, M. J., et al. The Rd8 mutation of the Crb1 gene is present in vendor lines of C57BL/6N mice and embryonic stem cells, and confounds ocular induced mutant phenotypes. Investigative ophthalmolog., & visual science. 53, 2921-2927 (2012).
Assessment of Vascular Regeneration i CNS Bruke musen Retina
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Miloudi, K., Dejda, A., Binet, F., Lapalme, E., Cerani, A., Sapieha, P. Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (88), e51351, doi:10.3791/51351 (2014).More

Miloudi, K., Dejda, A., Binet, F., Lapalme, E., Cerani, A., Sapieha, P. Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (88), e51351, doi:10.3791/51351 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter