Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Оценка сосудистой регенерации в ЦНС Использование мыши Retina

doi: 10.3791/51351 Published: June 23, 2014

Summary

Сетчатка грызун уже давно признана в качестве доступного окна в мозг. В этом техническом документе мы предоставляем протокол, который использует модель мыши кислорода, вызванной ретинопатии для изучения механизмов, которые приводят к выходу из строя сосудистой регенерации в центральной нервной системе после ишемического повреждения. Описанная система также может быть использована для изучения стратегий для продвижения отрастания функциональных кровеносных сосудов в сетчатке и ЦНС.

Abstract

Сетчатка грызунов, пожалуй, самый доступный система млекопитающих, в которой для расследования сосудисто-нервный взаимодействие в центральной нервной системе (ЦНС). Он все чаще признается, что несколько нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, рассеянный склероз и боковой амиотрофический склероз, присутствующих элементов сосудистой компромисса. Кроме того, самые выдающиеся причины слепоты в педиатрических и работающего населения возрастных (ретинопатии недоношенных и диабетической ретинопатии, соответственно) характеризуются сосудистой дегенерации и разрушения физиологической сосудистой отрастания. Целью данного технического документа заключается в предоставлении подробный протокол для изучения ЦНС регенерацию сосудов в сетчатке. Метод может быть использован для выяснения молекулярные механизмы, которые приводят к выходу из строя роста сосудов после ишемического повреждения. Кроме того, потенциальные терапевтические методы для ускорения и восстановления здоровых сосудистых сплетений могут быть изучены. Выводы obtaineг, используя описанный подход может обеспечить терапевтические возможности для ишемических ретинопатии, такие как, что диабета или недоношенных и, возможно, выиграют других сосудистых расстройств ЦНС.

Introduction

На протяжении развития ЦНС, нервов, иммунных клеток и кровеносных сосудов создать удивительно сочетании сетей для обеспечения адекватной перфузии тканей и позволяют передачу сенсорной информации 1-5. Разбивка сосудистых систем приводит к недостаточной оксигенации тканей и скомпрометированной питания метаболического и получает все большее признание в качестве важного вклад в патогенезе нейродегенеративных заболеваний 6. Сосудистая отсева и ухудшение сосудисто-нервного блока в мозге, например, связана с сосудистой деменцией, сосудистых поражений белого вещества головного мозга 7 и болезни Альцгеймера со стенозом артериол и мелких сосудов 8. Кроме того, нарушение сосудистой функции барьера, как полагают, способствуют рассеянный склероз 9 и боковой амиотрофический склероз 10.

Непосредственное значение для сетчатки модели, описанной в данном протоколе, ослепляязаболеваний, таких как диабетическая ретинопатия и 11 ретинопатии недоношенных 12, 13, характеризуются фазе ранней сосудистой дегенерации. Последовавшая за этим ишемическая нагрузка на сосудисто-нервного сетчатки вызывает второй этап чрезмерной и патологической неоваскуляризации, что скорее всего возникает как компенсаторная реакция вновь установить кислорода и энергоснабжение 14-16. Привлекательная стратегия для преодоления ишемический стресс, который занимает центральное место в прогрессирования заболевания является восстановление функциональных сосудистых сетей в частности, в ишемических зон нейро-сетчатки (рис. 2 и 3). Провоцирование контролируемую ангиогенную ответ может встретить, как нелогичным для состояния, в котором антиангиогенные лечения, такие как анти-VEGFs рассматриваются как адаптированных процедур. Тем не менее, доказательства справедливости этого подхода является монтаж. Например, повышение "физиолого-как" сосудистый отрастания в ischemIC ретинопатии было элегантно продемонстрирована путем введения эндотелиальных клеток-предшественников 17, ингибирование Müller клеток выражали VEGF, индуцированного подавлением других ангиогенных факторов 18, инъекции миелоидных предшественников, 19 ингибированию NADPH-оксидазы индуцированного апоптоза 20, увеличение диетического ω-3 полиненасыщенных жирных кислоты потребление 21, лечение с карбоксильной-концевого фрагмента триптофана тРНК синтетазы 22 и непосредственным управлением VEGF или FGF-2 для защиты глиальных клеток 23. Более того, мы показали, что модуляции классические нейронные сигналы наведения, такие как Semaphorins или Netrins в ишемических ретинопатии ускоряет сосудистую регенерацию здоровых сосудов в сетчатке и, следовательно, снижает патологическое развитие кровеносных сосудов 24, 25. Непосредственное клиническое значение, некоторые из вышеупомянутых исследованиях на животных свидетельствуют, что содействие сосудистой репоколение во время ранней стадии ишемической ретинопатии может значительно уменьшить смотровое угрожающих предварительно неоваскуляризации сетчатки 19, 23, 24, 26, скорее всего, за счет сокращения ишемической нагрузки.

Разработка терапевтических стратегий, которые стимулируют регенерацию функциональных сосудов остается сложной задачей для сосудистых биологов. Здесь мы опишем экспериментальную систему, которая использует модель мыши кислорода, вызванной ретинопатии (OIR) для изучения стратегий для модуляции сосудистой отрастания в сетчатке. Разработано Смит и др.. В 1994 27, эта модель служит в качестве прокси для пролиферативные ретинопатии человека и состоит из не подвергая щенков P7 мыши до 75% О 2 до Р12, а затем повторного введения щенков до комнатной температуры окружающей O 2-напряжение (рис. 1). Эта парадигма свободно имитирует сценарий, где недоношенный ребенок вентилируетсяс O 2. Разоблачение щенков мыши гипероксии провоцирует дегенерацию сетчатки капилляров и микрососудов, и дает воспроизводимый площадь вазо-облитерации (VO), как правило, начисленных на выходе из O 2 на P12, хотя максимальная площадь В.О. достигается через 48 часов (P9) после воздействие O 2 28. У мышей, ВО зоны бессосудистые спонтанно регенерировать в течение недели, следующей повторного введения в комнатном воздухе и в конечном итоге В.О. зоны полностью заново васкуляризации (рис. 2). Повторное введение в комнатном воздухе мышей, подвергнутых OIR также провоцирует предварительно неоваскуляризации сетчатки (NV) (максимальное в P17), что, как правило, оцениваться с точки зрения эффективности антиангиогенных парадигм лечения. В чистом виде, модель OIR обеспечивает высокую воспроизводимость и количественному инструмент для оценки сосудистой дегенерации кислорода, вызванной и определить степень разрушительного предварительно неоваскуляризации сетчатки 29-31.

30, 31. Здесь мы предлагаем простой шаг за шагом процедуры для расследования модуляцию физиологической реваскуляризации в нервной сетчатки фармакологическими соединений, перспективных терапевтических, вирусных векторов или для изучения влияния генов-кандидатов в трансгенных или мышей с.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Заявление Этика: Все эксперименты на животных придерживается руководящих принципов по уходу за животными, установленные Ассоциации для Исследования в зрения и офтальмологии (ARVO) Заявление для использовании животных в офтальмологической и видение исследований и Канадского совета уходу за животными.

1. Кислород Индуцированные ретинопатия (OIR)

  1. Дата закрытия реестра рождения детенышей мыши, как P0.
  2. Запишите все массы животных после вступления в O 2 для обеспечения адекватного диапазон веса. Примечание: C57BL / 6 мышей в P17, масса тела должна быть в пределах от 5 до 7,5 г в течение максимального NV 32. Для того чтобы сохранить окружающую консистенции, рекомендуется использовать в качестве однопометными управления (для генетически модифицированных мышей, а также у мышей, получавших экспериментальные процедуры). При оценке последствий вирусного вектора, необходимо учитывать тропизм вируса и обеспечить достаточное время для полного выражения вирусно-доставленных трансгенов. Быстро выражая вируснаявекторы, такие как 3-го поколения лентивирусов 24, 25, 33, рекомендуется.
  3. Щенки Место мыши на Р7 (C57BL / 6 или желательно штамм) и CD1, способствующей мать в кислородной камере, установленной на 75% О 2 в течение 5 дней 27. Экологическая влажности и температуры на протяжении O 2 воздействия оставались постоянными. Примечание: Экспериментальные установки, оснащенные центральным источником O 2 идеально подходят и ограничить громоздкий замену пустой O 2 танков. При работе с трансгенными или нокаутных мышей, важно, чтобы обеспечить контроль и подопытных мышей получены из того же поставщика, чтобы ограничить генетические дрейф в тех же штаммов 30, 29.
  4. В Р12, удалить мышей от кислородной камере и вернуться животных до комнатной O 2.

2. Инъекция для доставки соединений к Внутренней Retina (Втчан оценки воздействия фармакологического соединения или рекомбинантного белка)

  1. В P14, обезболить мышей с 2% изофлуран в кислородной 2 л / мин (или защиты животных комитета утвержденных анестетика выбора). Для того чтобы проверить эффективность анестезии, последовательно зажать хвост, заднюю ножку и ухо пинцетом.
  2. Наведите мышь на брюхе.
  3. С помощью стерильного 10 мкл шприца, снабженного скошенной растянутой стеклянной иглы, выполнять инъекцию максимального объема 1 мкл раствора, содержащего соединение, находящееся под следствием или носитель (физиологический солевой раствор) на заднем лимба глаза, с 45 ° Угол избегая объектив. Примечание: вытащил стекло-игла прикрепляется к шприцу с использованием каплю эпоксидной смолы.
  4. Нанесите каплю смазки глазной мази (в идеале с антибиотиком) с тампоном в глаза мыши.
  5. Вернуться мышь обратно в клетку с укрепления мать. Мыши не то тщательно контролироваться до повторногопокрыты и полностью амбулаторно.

3. Оценка судов перфузии и барьерной функции (Integrity) на флуоресцентной ангиографии

  1. Обезболить мышей с 2% изофлуран в кислородной 2 л / мин (или защиты животных комитета утвержденных анестетика выбора). Для того чтобы проверить эффективность анестезии, последовательно зажать хвост, заднюю ножку и ухо пинцетом. Примечание: Как правило, это осуществляется на P17, когда регенерация оценивается. Также вынос анализ на P19 и P21, чтобы определить, сосудистой целостности сохраняется с течением времени.
  2. После того, как под наркозом, весят мышь.
  3. Сделайте срединный разрез живота с рассекающих ножницами. Примечание: Режущий инструменты должны регулярно проверяться и заточены.
  4. Вырезать ребра с боков и поднять грудную клетку с помощью щипцов. Примечание: Необходимо сократить как с боков, как это возможно, чтобы избежать повреждения сердца.
  5. После удаления peripHeral ткани от сердца, зажим нисходящей аорты с гемостаза щипцы.
  6. Медленно вводить флуоресцеин-декстрана в левый желудочек с помощью 25 G иглу. Примечание: Если функция сосудистой барьер исследуется, 70 кДа флуоресцеина-декстран применяется, как это будет вытекать из сосудов, когда целостность судна находится под угрозой. Если следователь хочет бросить кровеносные сосуды, 2 МДа флуоресцеина-декстран используется. Критические шаги: 1) обеспечить однородную передел, центрифуги флуоресцеин-декстрана и инъекционные супернатант, 2) в целях предотвращения судно сужение, инъекционные подогретое флуоресцеина-декстран решение, 3) Его время тираж не должен избыток 4 мин.
  7. Обезглавьте мышам 2 мин после инъекции с операционными ножницами.

4. Энуклеация и глаз Фиксация

Примечание: При оценке темпов сосудистой регенерации, сначала собрать сетчатки на Р12 и дополнительно на P14 и P17. Увеличение числа отобранных момент временис для более точного определения темпов реваскуляризации 24.

  1. Наклоните голову мыши и разместить его на свою сторону.
  2. Удалить кожу и веки, покрывающую глаз, используя рассекает ножницы.
  3. Наведите пинцетов под глазом и аккуратно потяните его вверх, пока зрительный нерв разорваны.
  4. Поверните голову мыши на другой бок и выполните те же шаги (шаги 4.2 и 4.3).
  5. Для обеспечения лучшего проникновения фиксатора, проколоть дырку в передней камере глаза, используя 30 г иглы.
  6. Передача глаза в пробирку, содержащую 4% параформальдегида (PFA) и зафиксировать в течение 1 часа при комнатной температуре.
  7. Удалить PFA и мыть глаза 4 раза раствором охлажденного льдом PBS.

5. Сетчатки Рассечение

  1. Наведите глаза мыши в чашку Петри, содержащую холодный PBS и выполнять рассечение сетчатки под стереомикроскопом.
  2. Удалить лишний жир / ткани, окружающие глаз с микро-рассечение научноssors.
  3. Отрежьте роговицы с микро-рассечение ножницами.
  4. Использование двух пар щипцов, поминутно очистить склеры от периферии к зрительного нерва и выбросить.
  5. Pinch объектив (беловатый шар под роговицы) пинцетом и извлечь его из чашки глаз. Используйте одну пару щипцов в качестве поддержки, а другой для захвата и осторожно поднимите и снимите объектив.
  6. Снять гиалоидной сосуды от внутренней стороне сетчатки с помощью небольших щеток (размер 0) и щипцы.
  7. Удалить пучки гиалоидной сосудов, соединенных с диска зрительного нерва с помощью щипцов.
  8. Передача расчлененный сетчатки до 2 мл микроцентрифужных пробирки, содержащие PBS и место на льду до начала процедуры окрашивания.

6. Сосудов сетчатки Окрашивание

  1. Инкубировать рассеченные сетчатки в течение ночи при осторожном встряхивании при 4 ° С в растворе флуоресцентно-isolectin сочетании B4 (родамин-лектин или другой) в PBS, содержащем 1 мМ CaCl 2
  2. На следующий день, удалить красящего раствора и мыть сетчатки 3x в PBS в течение 10 мин при комнатной температуре.

7. Подготовка сетчатки Flatmounts

  1. Трансфер сетчатки, фоторецепторов стороной вниз, на предметное стекло микроскопа и сделать четыре глубокие равноудаленные радиальные разрезы с помощью хирургического скальпеля разделить сетчатку на четыре одинаковых по размеру квадранта. В разрезов, готовиться сетчатку с помощью кисти так, чтобы он не движется.
  2. С помощью двух щеток, пропитанные PBS, тщательно выровнять квадранта фоторецепторов стороной вниз и опустите в сетчатку при монтаже среды для предотвращения фото-отбеливание. Затем осторожно поместить покровное на поверхности смонтированном сетчатки не нажимая и убедившись, что пузырьки воздуха не накапливаются под покровным. </ Li>

8. Изображений и Количественное Vasoobliteration (VO) и неоваскуляризации (Невада), как описано выше 31

  1. Возьмите образы целых монтажа сетчатки с эпи-флуоресцентного микроскопа при увеличении в 10 раз.
  2. Откройте изображение сетчатки в фото программное обеспечение для редактирования, сшить вместе и измерения общего сетчатки уголок и асептического область. Область может быть выражена в пикселях.
  3. Определить степень VO путем деления числа пикселей в лишенной сосудов зоне на количество пикселей в общей области сетчатки.
  4. Определить степень NV путем деления количества пикселей NV на количество пикселей в общей области сетчатки, как описано 31.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

OIR модель широко используется для изучения кислорода, вызванной дегенерации сосудов и ишемии, вызванной патологическое образование новых сосудов в сетчатке и сыграл важную роль в развитии в настоящее время работают антиангиогенных лечения глазных болезней 27, 29, 30. Выводы, полученные с использованием этой модели можно свободно экстраполировать на ишемических ретинопатии, таких как пролиферативной диабетической ретинопатии и ретинопатии недоношенных 30.

Здесь мы представляем альтернативное использование этой модели для изучения сосудистой регенерации. Мы опишем пример стратегии для регенерации ишемический сетчатку, который был недавно опубликованную нашей лаборатории. В представленном исследовании мы показали, что устойчивый нейронов ишемия активирует эндоплазматической сети (ER) стресс и через одного из своих эффекторных endoribonucleases IRE1α, расщепляет мРНК классического нейронов руководство кий Netrin-1. Мы покажем,что внутриглазное поставка Netrin-1, стимулирует программу репаративной ангиогенеза в сетчатке миелоидных клеток и таким образом ускоряет нервной ткани реваскуляризации после OIR 25. Кроме того, мы предоставляем пример ускоренного регенерации сосудов с использованием лентивирусов опосредованного молчание IRE1α.

Описанные экспериментальные парадигмы могут быть изменены, чтобы исследовать эксплоративной методом выбора. Важно отметить, что время точка инъекции в стекловидное тело, определяется на основе характера исследуемого соединения и должны принимать во внимание механизм, посредством которого исследовали лечение действует. Например, для изучения фармакологической соединение (агонист рецептора, антагонист и т.п.), P14 могут быть выбраны, как это соответствует временной точке, где сетчатки реваскуляризация еще ускоряющего быстрого действия вмешательство может ускорить скорость реваскуляризации (рисунки 2 и 3, а). Когда вирусные векторы являютсязанятых, достаточно времени должно быть отведено для обеспечения полной экспрессии гена пассажиров и более ранний момент времени может быть выбран, чтобы обеспечить полное экспрессию трансгена или полное молчание гена-мишени (рис. 4). Лентивирусов векторы на основе особенно хорошо подходят в этом отношении из-за их быстрого экспрессии, низкой воспалительной реакции и легкости производства 24, 25. Очень важно также, чтобы убедиться, что ген-мишень доставляется в соответствующий популяции клеток сетчатки (RGC, эндотелиальных клеток, клеток Müller и др.), следовательно, тропизм выбранного вирусного вектора должны быть рассмотрены. С другой стороны, изучение роли гена в сосудистой регенерации с использованием трансгенных или нокаутом животных дает преимущество не нуждаются для выполнения внутриглазного инъекции.

Рисунок 1 Рисунок 1. Схематическое представление OIR мышиной модели. Щенков мыши и кормящих матерей подвержены 75% О 2 из Р7 на P12. Вентилируемые камеры кислорода с устойчивым O 2 доставки и оксигемометр требуется. Во время этого начального периода, сетчатки сосудисто-стирание происходит. В Р12, мыши не возвращаются воздуха в помещении (21% O 2) до Р17, когда происходит максимальное патологическая предварительно сетчатки тафтинговые. Неоваскуляризация отступает в течение последующих дней. Идеальный период для расследования сосудистую регенерацию это окно между P12 и P17. Отбор проб и оценки несколько точек времени для степени вазо-облитерации является ключом к выяснению точных темпы реваскуляризации.

Рисунок 2
Рисунок 2. Временной ход сетчатки реваскуляризации следующие кислорода, вызванной вазо-obliteРацион. А) Графическое изображение сетчатки процедуры flatmounting. Разрез производится через верхнюю часть роговицы (черно-серый купол) и склеры (пунктир красные линии) и сетчатка дразнили. Линза может быть извлечена либо после открытия роговицы / склеры или после того, как склера удаляется, как показано на схеме. Стекловидного тела сосуды удаляются и окрашивание сосудов сетчатки, выполненных. Как только протокол окрашивания закончен, сетчатка затем разрезать на 4 равноотстоящих секций и установлен на предметное стекло микроскопа судно стороной вверх. B) Лектин-окрашенные flatmount сетчатки мышей, подвергнутых OIR. Как сосуды регенерации, площадь вазо-облитерации (здесь максимальна при P12) заполняет дюйма Патологическая неоваскуляризация максимальна при P17 и выглядит как насыщенных мест в лектинов окрашенных OIR сетчатки. По P19-P21, сетчатки полностью регенерировать свои сосудистых сетей. (Эта цифра была изменена с Бине и др.. Клеточный метаболизм 2013 25)

<р = класса "jove_content" FO: держать-together.within-страницу = "всегда"> Рисунок 3
Рисунок 3. Пример лечения инъекционными, что ускоряет сосудов сетчатки регенерации: Netrin-1. А) Netrin-1 вводится в P14 и степени сосудистой отрастания оценивается в P17. Дозозависимое увеличение в сосудистой регенерации. Целостность B) Сосудистый может быть оценена путем перфузии с низкой молекулярной массой люминесцентных декстран. Если сосуды показать скомпрометирована барьерную функцию, флуоресцентный Декстран будет протекать вне судна (стрелки). (Эта цифра была изменена с Бине и др.. Клеточный метаболизм 2013 25)

Рисунок 4
Рисунок 4. Пример генной глушителей Wiй лентивирусный-доставлен shRNAs для сосудов сетчатки регенерации:. Lv.shIRE1α Чтобы оценить способность гена молчание IRE1α в нейронов сетчатки ганглия, чтобы помочь сосудистую регенерацию, инъекция из лентивирусом кодирующим shIRE1α вводили в P3 чтобы обеспечить достаточное время для молчания генов, когда рост сосудов и сосудисто-уничтожение оценивается. 3-го поколения лентивирус использованный в данном примере содержит модифицированный вирус стоматита везикулярного гликопротеин (ВСВ-G), разработанную для плазменной мишени мембраны. Хотя эти векторы эффективно заразить ганглиозных клеток сетчатки, выражение также можно указать в других местных типов клеток. (A) Эта обработка не приводит к заметным изменениям в кислорода, вызванной вазо-облитерации, как это определено в P12, показывая, что все наблюдаемые преимущества по вазо-облитерации, измеренные на более поздних временных точках обусловлены повышенной сосудистой регенерации. (В) Ингибирование IRE1α ян эта парадигма резко усиливается регенерация сосудов в отрастания фазы OIR на P17. (Эта цифра была изменена с Бине и др.. Клеточного метаболизма 2013 25) (С) Оценка в третий раз точку вазо-облитерации таких как P14, требуется определить точные показатели реваскуляризации. (Эта цифра была изменена с Joyal др.. Крови 2011 24) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Что является наиболее эффективным способом, чтобы стимулировать рост новых здоровых сосудов ишемической нервной ткани? Это терапевтически действует вмешиваться и ускорять естественные сосудистой отрастания? В нейро-ишемическая патологий, таких как ишемических ретинопатии или инсульта, сосудистая дегенерация связана со снижением функции нейронов 35-38. Поэтому для борьбы с раннего травмы, восстановление региональной микроциркуляцию в непосредственной / начале сегмента болезни может оказаться полезным. В глазной контексте экспериментальные парадигмы, которые ускоряют реваскуляризации ишемической сетчатки уменьшить патологическое образование новых сосудов 21-25, 34 и, таким образом этот подход заслуживает дальнейшего изучения.

С момента своего появления 20 лет назад, OIR модель 27 революцию сетчатки исследования ангиогенеза 30. Здесь мы предлагаем дополнительное приложение для этой модели для изучения перспективного Strategies модулировать физиологическую регенерацию сосудов в ишемической сетчатки. Идеальная модель животное должно включать в себя несколько таких критериев, как близость к человеческой патофизиологии, высокой воспроизводимости, быстрого исполнения и в идеале, низкая стоимость. Модель мыши OIR отвечает всем этим критериям и может осуществляться выезда менее чем за 3 недели.

Несмотря на многочисленные перечисленных преимуществ, недостатков включать текущую необходимость пожертвовать мышь до анализов и, следовательно, точный продольный мониторинг животного пока не представляется возможным с нынешними средствами визуализации. В настоящее время в естественных условиях методы визуализации, такие как октябрь или флуоресцентной ангиографии являются в значительной степени неудачны из-за присущей оптического ограничения глаза мыши (радиусом кривизны и небольшого размера), что снижает охват 39 изображений на самых центральных регионах сетчатки, которые не имеют отношение к на ранних стадиях модели.

При использовании в изучать сосудистую регенерацию как рroposed в настоящем Протоколе бумаги, все соображения, которые применяются к изучению новых сосудов следует также контролировать. К ним относятся записи веса животного для оценки метаболизма здоровье щенка, который в значительной степени влияет на ангиогенез 32. Точный контроль напряжения кислорода в гипероксической камеры также имеет важное значение. Изменение концентрации кислорода имеет прямое влияние на vasoobliteration, которая, конечно, может привести к критической неправильного толкования данных. Поэтому рекомендуется либо реализовать непрерывный электронный мониторинг концентрации камера с кислородом или в меньшей мере, контролировать ежедневные изменения в уровнях кислорода и ограничить oxycycler дверной проем, чтобы поддерживать постоянный уровень кислорода. Оптимальная обработка радиолокационных сетчатки также требует практики. Добыча, монтаж и окрашивание сетчатки должна быть выполнена с осторожностью, что и относительно хрупкой сетчатки необходимо деликатно обрабатываются. Кроме того, как и для всех экспериментов с генетически модифицированных животных, генетического дрейфа колонии сА.Н. посрамить результаты. При отсутствии селективного силы (в колонии мыши например), аллельные или генетический дрейф представляет собой случайный процесс, что может привести к большим изменениям в популяции в течение короткого периода времени. Частот аллелей может меняться от поколения к поколению и привести к образованию югу от колонии 40, 41. Эти мутации в значительной степени не обнаруживается, и это, таким образом, важно ограничить количество поколений, полученных теми же парами нейтронах в той же колонии. Наиболее эффективным способом для достижения наивысшего генетической стабильности является, чтобы обновить "запасы" каждые пять поколений или перейти к обратным скрещиванием с купленной мыши одинаковой фоне.

Кроме того, рекомендуется, чтобы проверить на дегенерацию сетчатки мутаций (й) 1 и 8 42, по крайней мере, один раз перед началом новой линии во избежание оправдав фенотипы, которые можно отнести к преждевременному фоторецепторов дегенерации. Для трансгенных животных,жизненно важно, чтобы гарантировать, что и контроль и мутантных мышей получаются из того же поставщика и обязательно на том же генетическом фоне.

Поскольку мы продолжаем выяснить молекулярные механизмы формирования кровеносных сосудов и роста, новые подходы для ускорения, медленно или направить зарождающиеся кровеносные сосуды возникают. Модель система, в которой модуляция васкуляризации могут быть изучены в естественных условиях в патологической контексте может стать ценным инструментом для изучения потенциальных терапевтических парадигм, чтобы противостоять нейронов ишемии в ЦНС. Адаптация OIR модель мыши для изучения сосудистой регенерации обеспечивает такой место и будет продолжать быть ценным инструментом для более глубокого понимания молекулярных основ для физиологического и патологического ангиогенеза.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgments

PS держит Стул Исследования Канады в сетчатке глаза клеточной биологии и Alcon научно-исследовательский институт новому следователю Award. Эта работа была поддержана грантами от Канадского института исследований в области здравоохранения (221478), Канадская ассоциация диабета (ОГ-3-11-3329-PS), естественных наук и инженерным исследованиям Совета Канады (418637) и Фонд Борьба Слепота Канада. Была также оказана поддержка по RESEAU по исследованиям ан Санте де-ла-видения Квебека.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57Bl/6 mice (Other strains may be used; angiogenic response varies from one strain to the other)
CD1 nursing mothers Vendor of choice
Operating Scissors straight World Precision Instruments 14192
Dissecting Scissors straight World Precision Instruments 14393
Vannas Eye Scissors Harvard Apparatus 72-8483
Iris Forceps, curved, serrated World Precision Instruments 15915
Brushes 362R size 0 Dynasty
Dumont Forceps #3; straight World Precision Instruments 500338
Surgical Blade, size 10 Bard-Parker 371110
Rhodamine Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I Vector Laboratories, Inc RL-1102
Microscope slides VWR 16004-368
Fluoromount G Electron Microscopy Sciences 17984-25
Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Phase and Fluorescence Microscope Zeiss
Leica MZ9.5 Stereomicroscope Leica
Fluorescein isothicyanate-dextran, 70000 Sigma-Aldrich 46945

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carmeliet, P., Tessier-Lavigne, M. Common mechanisms of nerve and blood vessel wiring. Nature. 436, 193-200 (2005).
  2. Eichmann, A., Thomas, J. L. Molecular Parallels between Neural and Vascular Development. Cold Spring Harb Perspect Med. 3, (2012).
  3. Larrivee, B., Freitas, C., Suchting, S., Brunet, I., Eichmann, A. Guidance of vascular development: lessons from the nervous system. Circ Res. 104, 428-441 (2009).
  4. Stefater Iii, J. A., et al. Regulation of angiogenesis by a non-canonical Wnt-Flt1 pathway in myeloid cells. Nature. 474, 511-515 (2011).
  5. Checchin, D., Sennlaub, F., Levavasseur, E., Leduc, M., Chemtob, S. Potential role of microglia in retinal blood vessel formation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 3595-3602 (2006).
  6. Quaegebeur, A., Lange, C., Carmeliet, P. The neurovascular link in health and disease: molecular mechanisms and therapeutic implications. Neuron. 71, 406-424 (2011).
  7. Yamamoto, Y., Craggs, L., Baumann, M., Kalimo, H., Kalaria, R. N. Review: molecular genetics and pathology of hereditary small vessel diseases of the brain. Neuropathol Appl Neurobiol. 37, 94-113 (2011).
  8. Brun, A., Englund, E. A white matter disorder in dementia of the Alzheimer type: a pathoanatomical study. Ann Neurol. 19, 253-262 (1986).
  9. Prat, A., et al. Migration of multiple sclerosis lymphocytes through brain endothelium. Arch Neurol. 59, 391-397 (2002).
  10. Rule, R. R., Schuff, N., Miller, R. G., Weiner, M. W. Gray matter perfusion correlates with disease severity in ALS. Neurology. 74, 821-827 (2010).
  11. Antonetti, D. A., Klein, R., Gardner, T. W. Diabetic retinopathy. N Engl J Med. 366, 1227-1239 (2012).
  12. Hartnett, M. E., Penn, J. S. Mechanisms and management of retinopathy of prematurity. N Engl J Med. 367, 2515-2526 (2012).
  13. Sapieha, P., et al. Retinopathy of prematurity: understanding ischemic retinal vasculopathies at an extreme of life. J Clin Invest. 120, 3022-3032 (2010).
  14. Chen, J., Smith, L. Retinopathy of prematurity. Angiogenesis. 10, 133-140 (2007).
  15. Cheung, N. Diabetic retinopathy and systemic vascular complications. Progress in Retinal and Eye Research. 27, 161-176 (2008).
  16. Smith, L. E. Through the eyes of a child: understanding retinopathy through ROP the Friedenwald lecture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 5177-5182 (2008).
  17. Caballero, S., et al. Ischemic vascular damage can be repaired by healthy, but not diabetic, endothelial progenitor cells. Diabetes. 56, 960-967 (2007).
  18. Wang, H., et al. VEGF-mediated STAT3 activation inhibits retinal vascularization by down-regulating local erythropoietin expression. Am J Pathol. 180, 1243-1253 (2012).
  19. Ritter, M. R., et al. Myeloid progenitors differentiate into microglia and promote vascular repair in a model of ischemic retinopathy. J Clin Invest. 116, 3266-3276 (2006).
  20. Saito, Y., Geisen, P., Uppal, A., Hartnett, M. E. Inhibition of NAD(P)H oxidase reduces apoptosis and avascular retina in an animal model of retinopathy of prematurity. Mol Vis. 13, 840-853 (2007).
  21. Connor, K. M., et al. Increased dietary intake of omega-3-polyunsaturated fatty acids reduces pathological retinal angiogenesis. Nat Med. 13, 868-873 (2007).
  22. Banin, E., et al. T2-TrpRS inhibits preretinal neovascularization and enhances physiological vascular regrowth in OIR as assessed by a new method of quantification. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 2125-2134 (2006).
  23. Dorrell, M. I., et al. Maintaining retinal astrocytes normalizes revascularization and prevents vascular pathology associated with oxygen-induced retinopathy. Glia. 58, 43-54 (2010).
  24. Joyal, J. -S., et al. Ischemic neurons prevent vascular regeneration of neural tissue by secreting semaphorin 3A. Blood. 117, 6024-6035 (2011).
  25. Binet, F., et al. Neuronal ER Stress Impedes Myeloid-Cell-Induced Vascular Regeneration through IRE1alpha Degradation of Netrin-1. Cell Metab. 17, 353-371 (2013).
  26. Fukushima, Y., et al. Sema3E-PlexinD1 signaling selectively suppresses disoriented angiogenesis in ischemic retinopathy in mice. J Clin Invest. 121, 1974-1985 (2011).
  27. Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Invest Ophthalmol Vis Sci. 35, 101-111 (1994).
  28. Lange, C., et al. Kinetics of retinal vaso-obliteration and neovascularisation in the oxygen-induced retinopathy (OIR) mouse model. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 247, 1205-1211 (2009).
  29. Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4, 1565-1573 (2009).
  30. Stahl, A., et al. The mouse retina as an angiogenesis model. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 2813-2826 (2010).
  31. Stahl, A., et al. Computer-aided quantification of retinal neovascularization. Angiogenesis. 12, 297-301 (2009).
  32. Stahl, A., et al. Postnatal Weight Gain Modifies Severity and Functional Outcome of Oxygen-Induced Proliferative Retinopathy. Am J Pathol. 177, 2715-2723 (2010).
  33. Cerani, A., et al. Neuron-Derived Semaphorin 3A is an Early Inducer of Vascular Permeability in Diabetic Retinopathy via Neuropilin-1. Cell Metabolism. 18, 505-518 (2013).
  34. Sapieha, P. Eyeing central neurons in vascular growth and reparative angiogenesis. Blood. 120, 2182-2194 (2012).
  35. Dorfman, A., Dembinska, O., Chemtob, S., Lachapelle, P. Early manifestations of postnatal hyperoxia on the retinal structure and function of the neonatal rat. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 458-466 (2008).
  36. Dorfman, A. L., Joly, S., Hardy, P., Chemtob, S., Lachapelle, P. The effect of oxygen and light on the structure and function of the neonatal rat retina. Doc Ophthalmol. 118, 37-54 (2009).
  37. Chopp, M., Zhang, Z. G., Jiang, Q. Neurogenesis, angiogenesis, and MRI indices of functional recovery from stroke. Stroke. 38, 827-831 (2007).
  38. Li, L., et al. Angiogenesis and improved cerebral blood flow in the ischemic boundary area detected by MRI after administration of sildenafil to rats with embolic stroke. Brain Res. 1132, 185-192 (2007).
  39. Robinson, R., Barathi, V. A., Chaurasia, S. S., Wong, T. Y., Kern, T. S. Update on animal models of diabetic retinopathy: from molecular approaches to mice and higher mammals. Dis Model Mech. 5, 444-456 (2012).
  40. Chia, R., Achilli, F., Festing, M. F., Fisher, E. M. The origins and uses of mouse outbred stocks. Nat Genet. 37, 1181-1186 (2005).
  41. Jenuth, J. P., Peterson, A. C., Shoubridge, E. A. Tissue-specific selection for different mtDNA genotypes in heteroplasmic mice. Nat Genet. 16, 93-95 (1997).
  42. Mattapallil, M. J., et al. The Rd8 mutation of the Crb1 gene is present in vendor lines of C57BL/6N mice and embryonic stem cells, and confounds ocular induced mutant phenotypes. Investigative ophthalmolog., & visual science. 53, 2921-2927 (2012).
Оценка сосудистой регенерации в ЦНС Использование мыши Retina
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Miloudi, K., Dejda, A., Binet, F., Lapalme, E., Cerani, A., Sapieha, P. Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (88), e51351, doi:10.3791/51351 (2014).More

Miloudi, K., Dejda, A., Binet, F., Lapalme, E., Cerani, A., Sapieha, P. Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (88), e51351, doi:10.3791/51351 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter