Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Bedömning av Vascular Regeneration i CNS Använda musen Retina

doi: 10.3791/51351 Published: June 23, 2014

Summary

Den gnagare näthinna har länge setts som ett tillgängligt fönster till hjärnan. I denna tekniska papper ger vi ett protokoll som använder den musmodell av syre-inducerad retinopati att studera de mekanismer som leder till misslyckande av vaskulär förnyelse inom det centrala nervsystemet efter ischemisk skada. Det beskrivna systemet kan även utnyttjas för att undersöka strategier för att främja återväxt av funktionella blodkärl i retina och CNS.

Abstract

Den gnagare näthinnan är kanske den mest tillgängliga däggdjurs system där för att undersöka neurovaskulär samspelet inom det centrala nervsystemet (CNS). Det allt större utsträckning erkänt att flera neurodegenerativa sjukdomar som Alzheimers, multipel skleros, och amyotrofisk lateralskleros presentera delar av vaskulär kompromiss. Dessutom är de mest framträdande orsakerna till blindhet hos barn och arbets åldersgrupper (retinopati hos prematura barn och diabetesretinopati, respektive) som kännetecknas av vaskulär degeneration och misslyckande fysiologiska kärl återväxt. Syftet med denna tekniska papper är att ge ett detaljerat protokoll för att studera CNS vaskulär förnyelse i näthinnan. Metoden kan användas för att belysa molekylära mekanismer som leder till misslyckande av vaskulär tillväxt efter ischemisk skada. Dessutom kan potentiella terapeutiska metoder för att påskynda och återställa sunda vaskulära plexus utforskas. Rönet obtained med den beskrivna metoden kan ge terapeutiska avenyer för ischemiska retinopatier liksom det av diabetes eller prematuritet och eventuellt dra andra vaskulära sjukdomar i CNS.

Introduction

Under hela CNS utveckling, nerver, immunceller och blodkärl etablera anmärkningsvärt kopplade nätverk för att säkerställa tillräcklig vävnadsperfusion och möjliggöra överföring av sensorisk information 1-5. Fördelningen av kärlsystem ger otillräcklig vävnad syresättning och nedsatt metabol utbud och är alltmer som en viktig bidragsgivare till patogenesen vid neurodegenerativa sjukdomar 6. Vaskulär dropout och försämringen av den neurovaskulära enhet inom hjärnan, till exempel, är i samband med vaskulär demens, kärlskador i den vita substansen i hjärnan 7 och Alzheimers sjukdom med stenos av arterioler och små kärl 8. Dessutom är försämrad vaskulär barriärfunktion tros bidra multipel skleros 9 och amyotrofisk lateralskleros 10.

Av direkt betydelse för retinal modell som beskrivs i detta protokoll, bländandesjukdomar, såsom diabetisk retinopati 11 och retinopati hos prematura 12, 13 kännetecknas av en fas av tidig vaskulär degeneration. Den påföljande ischemisk stress på neurovaskulära näthinnan utlöser en andra fas av överdriven och patologisk kärlnybildning som troligen har sitt ursprung som en kompensatorisk reaktion på återinföra syre-och energiförsörjning 14-16. En attraktiv strategi för att övervinna den ischemiska stress som är central för sjukdomsförloppet är att återskapa funktionella vaskulära nätverk specifikt i den ischemiska zoner i neuro-näthinnan (figur 2 och 3). Provocera en kontrollerad angiogena svar kan upplevas som krånglig för ett tillstånd där anti-angiogena behandlingar såsom anti VEGFs betraktas som anpassade behandlingar. Ändå är bevis för giltigheten av detta tillvägagångssätt montering. Till exempel, öka "fysiologisk-liknande" vaskulär återväxt i ischemic retinopatier har elegant visats genom införande av endothelial prekursorceller 17, hämning av Müller cell uttryckt VEGF inducerad nedreglering av andra angiogena faktorer 18, injektion av myeloida stamceller 19, hämning av NADPH-oxidas inducerad apoptos 20, öka kost ω-3 fleromättade fettsyror syraintaget 21, behandling med en karboxyl-terminala fragmentet av tryptofan tRNA-syntetas 22 och direkt administrering av VEGF eller FGF-2 för skydd av gliaceller 23. Dessutom har vi visat att modulera klassiska neuronala vägledning ledtrådar såsom semaforiner eller Netrins i ischemiska retinopatier accelererar vaskulär regeneration av friska fartyg inom näthinnan och följaktligen reducerar patologisk angiogenes 24, 25. Av direkt klinisk relevans, flera av de tidigare nämnda djurstudier ger belägg för att främja kärl regeneration under den tidiga ischemiska fasen av retinopatier kan avsevärt minska syn-hotande pre-retinal kärlnybildning 19, 23, 24, 26, troligen genom en minskning av ischemisk börda.

Utforma terapeutiska strategier som stimulerar förnyelse av funktionella fartyg är fortfarande en betydande utmaning för kärl biologer. Här beskriver vi ett experimentellt system som använder den musmodell av syre-inducerad retinopati (OIR) att undersöka strategier för att modulera kärl återväxt inom näthinnan. Utvecklad av Smith et al. 1994 27, tjänar denna modell som en proxy för mänskliga proliferativa retinopatier och består av att utsätta P7 mus valpar till 75% O 2 tills P12 och därefter återinföra valparna till omgivande rums O 2-spänning (Figur 1). Detta paradigm härmar löst ett scenario där en tidig spädbarn ventilerasmed O 2. Exponeringen av mus valpar till hyperoxia framkallar degenerering av retinala kapillärer och mikrocirkulation, och ger en reproducerbar yta på vaso-utplåning (VO) normalt bedöms vid utträde från O2 vid P12, även om maximal VO område nås vid 48 h (P9) efter exponering för O 2 28. I musen, de avaskulära VO zonerna regenerera spontant under loppet av veckan efter återinförande till rumsluft och så småningom VO zoner är helt omar vaskulariserad (Figur 2). Återinförande till rumsluften hos möss som utsätts för OIR provocerar också pre-retinal kärlnybildning (NV) (maximal vid P17) som normalt bedöms att bestämma effekten av anti-angiogena behandling paradigm. I sin renaste form, ger OIR modellen en mycket reproducerbar och kvantifierbar verktyg för att bedöma syre-inducerad kärldegeneration och fastställa omfattningen av destruktiva pre-retinal kärlnybildning 29-31.

30, 31. Här ger vi en enkel steg-för-steg för att undersöka modulering av fysiologiska revaskularisering inom det neurala näthinnan av farmakologiska föreningar, blivande terapi, virala vektorer eller att studera inverkan av kandidatgener i transgena eller knockout-möss.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etik uttalande: Alla djurförsök följer de riktlinjer djurskötsel fastställts av Föreningen för forskning i Vision och Oftalmologi (ARVO) uttalande om användningen av djur i ögon och Vision Research och den kanadensiska rådet om Animal Care.

1. Syre Induced Retinopati (OIR)

  1. Avstämningsdag för födelse mus valpar som P0.
  2. Spela in alla vikter av djur vid inträdet i O 2 för att säkerställa en adekvat viktområde. Obs: För C57BL / 6 möss vid P17, bör kroppsvikten variera mellan 5 och 7,5 g för maximal NV 32. För att upprätthålla miljö konsistens, är det rekommenderat att använda kullsyskon som kontroll (för genetiskt modifierade möss och möss som fick experimentella behandlingar). Vid bedömning av effekterna av en virusvektor, måste man överväga tropism av viruset och ger tillräckligt med tid för fullt uttryck av viralt levererade transgener. Snabbt uttrycka viralavektorer såsom tre tredje generationens lentivirus 24, 25, 33 rekommenderas.
  3. Placera musen valpar på P7 (C57BL / 6 eller önskad stam) och en CD 1 främja mor i en syrekammare inställd på 75% O2 under 5 dagar 27. Miljö luftfuktighet och temperatur hölls konstant under O 2 exponering. OBS: Forskningsanläggningar som är utrustade med en central källa till O2 är idealiska och begränsa besvärliga ersättning av tomma O 2 tankar. Om du arbetar med transgena eller knockout-möss, är det viktigt att se till att kontroll-och experimentmöss förvärvas från samma leverantör att begränsa genetiska avarter inom samma stammar 30, 29.
  4. I P12, ta bort möss från syrgaskammaren och tillbaka djuren till omgivande O 2.

2. Intravitreal injektion för leverans av föreningar till Inner Retina (Whsv Bedöma Effekter av en Farmakologisk förening eller rekombinant protein)

  1. I P14, söva möss med 2% isofluran i syre 2 L / min (eller djurskyddskommitté-godkänd bedövningsmedel val). För att kontrollera effektiviteten i anestesi, sekventiellt nypa svansen, bakre fot och öra med pincett.
  2. Placera musen på dess mage.
  3. Med användning av en steril 10 jil injektionsspruta försedd med en avfasad drog-glasnål, utföra en injektion av en maximal volym av 1 pl av lösning innehållande föreningen som undersöks eller vehikel (fysiologisk saltlösning) vid den bakre limbus av ögat, med en 45 ° vinkel undvika linsen. Obs! Drog glasålen är fäst i sprutan med hjälp av en droppe epoxi-harts.
  4. Applicera en droppe smörjmedel oftalmologiska salva (helst med antibiotika) med en bomullstopp till musen öga.
  5. Återgå musen tillbaka till buren med främja mamma. Möss är sedan noggrant övervakas tills retäckt och helt rörlig.

3. Bedömning av fartyg perfusion och Barrier Function (Integrity) genom fluoresceinangiografi

  1. Bedöva möss med 2% isofluran i syre 2 L / min (eller djurskyddskommitté-godkänd bedövningsmedel val). För att kontrollera effektiviteten i anestesi, sekventiellt nypa svansen, bakre fot och öra med pincett. OBS: Detta är vanligen utförs på P17 när regenere bedöms. Också bära ut analysen vid P19 och P21 för att avgöra om vaskulär integritet bevaras över tiden.
  2. När sövda, väger musen.
  3. Gör en mittlinjen buken snitt med dissekera sax. OBS: Analysera instrument bör regelbundet kontrolleras och slipas.
  4. Skär revbenen i sidled och höja bröstkorgen med hjälp av tång. OBS: Det är nödvändigt att skära i sidled som möjligt för att undvika skador på hjärtat.
  5. Efter avlägsnande peripHeral vävnad från hjärtat, klämma fallande aorta med hemostatiska pincett.
  6. Injicera långsamt fluorescein-dextran till vänster kammare med hjälp av en 25 G nål. OBS: Om vaskulär barriärfunktion undersöks, är 70 kDa fluorescein-dextran används som det kommer att läcka ut ur fartyg när fartyget integritet äventyras. Om utredaren vill kasta blodkärl, är 2 MDa fluorescein-dextran används. Kritiska steg: 1) För att säkerställa en homogen fördelning, centrifug fluorescein-dextran och injicera supernatanten, 2) För att förhindra att fartyg sammandragning, injicerar värmde fluorescein-dextran lösning, 3) dess cirkulationstiden bör inte överstiga 4 min.
  7. Halshugga möss 2 minuter efter injektion med drift sax.

4. Enucleation och ögonFixa

OBS: Vid bedömning andelen vaskulär regeneration, först samla näthinnor vid P12 och dessutom vid P14 och P17. Öka antalet tidspunkt provtass mer noggrann bestämning av andelen revaskularisering 24.

  1. Luta musen huvudet och placera den på sin sida.
  2. Ta bort hud och ögonlock som täcker ögonen med hjälp dissekera sax.
  3. Placera böjda pincett under ögat och försiktigt dra upp den tills synnerven är avskurna.
  4. Vänd musen huvud på dess andra sida och utför samma steg (steg 4.2 och 4.3).
  5. För att säkerställa bättre penetration av fixativ, punktera ett hål i främre ögonkammaren med hjälp av 30 G nål.
  6. Överför ögon till ett rör innehållande 4% paraformaldehyd (PFA) och fixera i 1 h vid rumstemperatur.
  7. Avlägsna PFA och tvätta ögonen 4 gånger med en lösning av iskall PBS.

5. Retinal Dissection

  1. Placera musen ögon i en petriskål med kall PBS och utför dissektion av näthinnor under ett stereomikroskop.
  2. Ta bort extra fett / vävnad som omger ögat med mikro-dissektion scissors.
  3. Skär av hornhinnan med mikro-dissektion sax.
  4. Med hjälp av två par pincett, noggrant skala sklera bort från periferin mot synnerven och kasta.
  5. Nyp objektivet (vitaktig boll under hornhinnan) med pincett och dra ut den från ögat koppen. Använd en pincett som en bärare, och den andra för att gripa och försiktigt lyfta och avlägsna linsen.
  6. Drag av de hyaloid fartyg från den inre sidan av näthinnan med hjälp av små borstar (storlek 0) och pincett.
  7. Ta bort buntar av hyaloid fartyg som är anslutna till den optiska skivan med pincett.
  8. Överför dissekerade näthinnor till 2 ml mikrocentrifugrör innehållande PBS och placera på is före start färgningsproceduren.

6. Retinal vaskulär Färgning

  1. Inkubera dissekerade näthinnor över natt med försiktig skakning vid 4 ° C i en lösning av fluorescenskopplade-isolectin B4 (Rhodamine-lektin eller annat) i PBS innehållande 1 mM CaCl2
  2. På den följande dagen, avlägsna färglösningen och tvätta näthinnor 3x i PBS under 10 min vid rumstemperatur.

7. Beredning av näthinnan Flatmounts

  1. Överför näthinnor, ljusmätare och ner, på ett objektglas och göra fyra djupa ekvidistanta radiella snitt använder en kirurgisk skalpell för att dela upp näthinnan i fyra lika stora kvadranter. Under snitt, spänna näthinnan med en borste så att den inte rör sig.
  2. Med hjälp av två borstar indränkt i PBS, försiktigt platta till kvadranter ljusmätare och-ner och sänk näthinnan i monteringsmedium för att förhindra fotoblekning. Sedan försiktigt placera ett täckglas på ytan av det monterade näthinnan utan tryck och se till att luftbubblor inte ackumuleras under locket halka. </ Li>

8. Avbildning och kvantifiering av Vasoobliteration (VO) och kärlnybildning (NV) som tidigare beskrivits 31

  1. Ta bilder av hela monterade näthinnorna med ett epi-fluorescensmikroskop vid en förstoring av 10X.
  2. Öppna den bild på näthinnan i fotoredigeringsprogram, sy ihop och mäta den totala retinala området, och avaskulär område. Område kan uttryckas i pixlar.
  3. Bestäm omfattning VO genom att dividera antalet pixlar i den avaskulära område av antalet bildpunkter i det totala retinala området.
  4. Bestäm omfattning NV genom att dividera antalet pixlar i NV med antalet bildpunkter i det totala retinala område som beskrivs 31.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den OIR Modellen används ofta för att studera syre-inducerad kärldegeneration och ischemi-inducerad patologisk kärlnybildning i näthinnan och har varit avgörande för utvecklingen av närvarande används anti-angiogena behandlingar för ögonsjukdomar 27, 29, 30. Rön som erhållits med hjälp av denna modell kan löst extrapoleras till ischemiska retinopatier såsom proliferativ diabetesretinopati och retinopati hos prematura 30.

Här presenterar vi en alternativ användning av denna modell för att studera vaskulär regeneration. Vi kommer att beskriva ett exempel på en strategi för att regenerera den ischemiska näthinnan som nyligen har publicerats av vårt labb. I den presenterade studien visar vi att uthållig neuronal ischemi aktiverar endoplasmatiska retiklet (ER) stress och via en av dess effektor endoribonucleases IRE1α, klyver mRNA av den klassiska neuronal vägledning cue netrin-1. Vi visardet intraokulära leverans av Netrin-1, stimulerar ett program för reparativ angiogenes i retinal myeloida celler och därmed accelererar nervvävnad revaskularisering efter OIR 25. Dessutom ger vi ett exempel på accelererad vaskulär regeneration med hjälp lentiviral medierad tysta IRE1α.

De beskrivna experimentella paradigm kan modifieras för att undersöka den undersökande behandling av valet. Viktigt är att tidpunkten för intravitreal injektion bestäms utifrån vilken typ av utfors förening och måste ta hänsyn till den mekanism genom vilken den undersökta behandlingen fungerar. Till exempel, för att studera en farmakologisk förening (receptoragonist, antagonist, etc.), P14 kan väljas eftersom det motsvarar en tidpunkt då retinal revaskularisering accelererar ännu ett snabbverkande insatser kan bidra till att påskynda takten i revaskulariserings (Siffror 2 och 3a). När virala vektorer äranvänds, tillräckligt med tid måste tilldelas för att medge fullständig expression av passageraren genen och en tidigare tidpunkt kan väljas för att säkerställa full expression av transgenen eller full tysta av målgenen (Figur 4). Lentiviral baserade vektorer är särskilt väl lämpade i detta avseende på grund av deras snabba uttryck, låg inflammatorisk respons och enkel produktion 24, 25. Det är också viktigt att se till att målet genen levereras till lämplig retinal cellpopulation (RGC, Endotelcell, Müller Cell, etc.), därav tropism för den valda virusvektor måste beaktas. Alternativt studera rollen av en gen i vaskulär regeneration med hjälp av transgena eller knockout djur har fördelen av att inte behöva utföra intraokulära injektioner.

Figur 1 Figur 1. Schematisk återgivning av den mus OIR modell. Musungar och ammande mödrar är utsatta för 75% O 2 från P7 till P12. En ventilerad syrgaskammare med stadig O2 leverans och oximetern krävs. Under denna inledande period, sker retinal vaso-utplåning. I P12, möss tillbaka till rumsluft (21% O2) till P17 då maximal patologisk pre-retinal tuftning inträffar. Neovaskularisation drar sig tillbaka under de följande dagarna. Den ideala tiden för att undersöka kärl förnyelse är fönstret mellan P12 och P17. Provtagning och bedömning av flera tidpunkter för omfattningen av vaso-utplåning är nyckeln till att belysa korrekta priser för revaskularisering.

Figur 2
Figur 2. Tidsförlopp för retinal revascularization följande syre-inducerad vaso-obliteranson. A) grafisk skildring av en retinal flatmounting förfarande. Ett snitt görs genom den övre delen av hornhinnan (svart-grå kupolen) och senhinnan (prickade röda linjer) och näthinnan är retad ut. Objektivet kan hämtas antingen efter att ha öppnat hornhinnan / senhinnan eller en gång sklera avlägsnas som visas i diagrammet. Hyaloid kärlen avlägsnas därefter och färgning av retinala kärl utförda. När färgningsprotokollet är klar visas näthinnan skärs sedan till fyra lika åtskilda sektioner och monteras på ett objektglas kärlet sida upp. B) Lektin-infärgade flatmount näthinnor från möss som utsatts för OIR. Som fartyg regenerera, området vaso-utplåning (här maximal vid P12) fyller i. Patologiska kärlnybildning är maximal vid P17 och visas som mättade fläckar i lektin färgade OIR näthinnor. Genom P19-P21, har näthinnor helt regener sina vaskulära nätverk. (Denna siffra har modifierats Cell Metabolism 2013 25 Binet et al.)

<p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "alltid"> Figur 3
. Figur 3 Exempel på en injicerbar behandling som påskyndar retinal kärl förnyelse: Netrin-1. A) Netrin-1 injiceras vid P14 och omfattningen av kärl återväxt bedömt vid P17. En dosberoende ökning av vaskulär regenerering observeras. B) Vascular integritet kan bedömas genom perfusion med en lågmolekylär fluorescerande dextran. Om fartygen visar nedsatt barriärfunktion, kommer den fluorescerande dextran läcka utanför kärlet (pilar). (Denna siffra har modifierats Cell Metabolism 2013 25 Binet et al.)

Figur 4
Figur 4. Exempel av geners uttryck with lentiviral levererade shRNAs för retinal kärl förnyelse:. Lv.shIRE1α För att bedöma möjligheten för geners uttryck av IRE1α i retinal ganglion nervceller för att hjälpa vaskulär regeneration, var en intravitreal injektion av ett lentivirus som kodar för ett shIRE1α injiceras på P3 för att ge tillräckligt med tid för geners uttryck när bedöms kärltillväxt och vaso-utplåning. Den 3: e generationens lentivirus användes i detta exempel innehåller en modifierad vesikulärt stomatitvirus glykoprotein (VSV-G), konstruerad för att rikta plasmamembran. Även om dessa vektorer effektivt infektera näthinneganglieceller, kan uttryck också noteras i andra lokala celltyper. (A) Denna behandling inte lett till märkbara variationer i syre-inducerad vaso-utplåning som bestäms vid P12, vilket innebär att alla observerade fördelar på vaso-utplåning mätt vid senare tidpunkter beror på ökad vaskulär förnyelse. (B) Hämning av IRE1α i.n detta paradigm förbättras dramatiskt vaskulär förnyelse i återväxt fasen av OIR vid P17. (Denna siffra har modifierats Binet et al. Cell Metabolism 2013 25) (C) Bedöma en tredje tidpunkt för vaso-utplåning såsom P14, krävs för att fastställa korrekta priser för revaskularisering. (Denna siffra har modifierats Joyal et al. Blood 2011 24) Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vad är det mest effektiva sättet att stimulera tillväxten av nya friska kärl i vävnader ischemisk nervös? Är det terapeutiskt giltigt att störa och accelerera naturligt förekommande kärl återväxt? I neuro-ischemiska sjukdomar såsom ischemiska retinopatier eller stroke, är vaskulär degeneration associerad med minskad neuronal funktion 35-38. Därför att motverka tidig skada, återinföra den regionala mikrocirkulationen under den omedelbara / tidig segment av sjukdom kan vara till nytta. Vid en okulär sammanhang experimentella paradigm som påskyndar revaskularisering av den ischemiska näthinnan minskar patologisk kärlnybildning 21-25, 34 och därmed denna modell förtjänar ytterligare utredning.

Sedan introduktionen för 20 år sedan, har det OIR modellen 27 revolution retinal angiogenesforskning 30. Här ger vi ett extra program för denna modell för att studera blivande strategier för att modulera fysiologiska kärl förnyelse i ischemiska näthinnan. En idealisk djurmodell bör omfatta flera kriterier såsom närheten till mänsklig patofysiologi, hög reproducerbarhet, snabb exekvering och helst låg kostnad. Den musmodell av OIR uppfyller alla dessa kriterier och kan inte finnas kvar på mindre än 3 veckor.

Trots de många börsnoterade fördelar, nackdelar inkluderar det nuvarande behovet av att offra musen innan analyser och därmed noggrann längd övervakning av ett djur är ännu inte möjligt med nuvarande bildframställning. För närvarande, in vivo imaging tekniker såsom OCT eller fluoresceinangiografi är till stor del misslyckats på grund av den inneboende optiska begränsningen av musen ögat (kurvradie och liten storlek) vilket minskar imaging täckning 39 till de mest centrala delarna av näthinnan som inte är relevanta för de tidiga stadierna av modellen.

När de används för att studera vaskulär förnyelse som pÖRSLAG i detta protokoll papper bör alla överväganden som gäller för att studera kärlnybildning också övervakas. Dessa inkluderar inspelning djurens vikt för att uppskatta den metaboliska hälsa på valpen, som kraftigt påverkar angiogenes 32. Noggrann reglering av syrespänningen i hyperoxisk kammaren är också kritisk. Variation i syrekoncentration har en direkt inverkan på vasoobliteration, vilket oundvikligen leder till viktiga data feltolkning. Det rekommenderas därför att antingen genomföra en kontinuerlig elektronisk övervakning av kammarsyrekoncentrationen eller det minsta, övervaka dagliga förändringar i syrehalten och begränsa oxycycler dörröppningen för att upprätthålla konstanta syrenivåer. Optimal behandling av näthinnor tar också praktik. Utvinning, montering och färgning av näthinnan måste utföras med försiktighet eftersom den är hyfsat ömtålig näthinnan måste noga hanteras. Dessutom, som för alla experiment med genetiskt modifierade djur, den genetisk drift av en koloni cen förbrylla resultat. I avsaknad av en selektiv kraft (i en mus koloni till exempel), är den allel eller genetisk drift en slumpmässig process som kan leda till stora förändringar i befolkningen under en kort tidsperiod. Allelfrekvenser kan förändras från generation till generation och att resultera i bildandet av en sub-koloni 40, 41. Dessa mutationer är i stort sett omöjlig att upptäcka och det är därför viktigt att begränsa antalet generationer som produceras av samma uppfödare paren i samma koloni. Det mest effektiva sättet att uppnå högsta genetiska stabilitet är att uppdatera "lager" varje fem generationer eller gå vidare till tillbakakorsning med en köpt mus av samma bakgrund.

Det rekommenderas också att testa för näthinnedegeneration mutationer (rd) 1 och 8 42, åtminstone en gång innan du startar en ny linje för att undvika confounding fenotyper som kan hänföras till tidig ljusmätare degeneration. För transgena djur,är det viktigt att se till att både kontroll och muterade möss erhålls från samma leverantör och är nödvändigtvis på samma genetiska bakgrund.

När vi fortsätter att klarlägga molekylära mekanismer för blodkärlsbildning och tillväxt, strategier roman att accelerera, långsam, eller styra begynnande blodkärl uppstår. Ett modellsystem där modulering av vaskularisering kan utforskas in vivo i en patologisk sammanhang kan ge ett värdefullt verktyg för att undersöka potentiella terapeutiska paradigm för att motverka neuronal ischemi i CNS. Anpassning musen OIR modell för att studera vaskulär regeneration ger en sådan plats och kommer att fortsätta vara ett värdefullt verktyg för att främja vår förståelse av den molekylära grunden för fysiologisk och patologisk angiogenes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgments

PS har en Canada Research Chair i Retinal cellbiologi och Alcon Research Institute New Investigator Award. Detta arbete har finansierats med bidrag från den kanadensiska Institutes of Health Research (221.478), den kanadensiska Diabetes Association (OG-3-11-3329-PS), naturvetenskap och teknisk forskning Council of Canada (418.637) och The FundamentStridighetBlindnessen Kanada. Stöd har också lämnats av Reseau de Recherche en Santé de la Vision du Québec.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57Bl/6 mice (Other strains may be used; angiogenic response varies from one strain to the other)
CD1 nursing mothers Vendor of choice
Operating Scissors straight World Precision Instruments 14192
Dissecting Scissors straight World Precision Instruments 14393
Vannas Eye Scissors Harvard Apparatus 72-8483
Iris Forceps, curved, serrated World Precision Instruments 15915
Brushes 362R size 0 Dynasty
Dumont Forceps #3; straight World Precision Instruments 500338
Surgical Blade, size 10 Bard-Parker 371110
Rhodamine Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I Vector Laboratories, Inc RL-1102
Microscope slides VWR 16004-368
Fluoromount G Electron Microscopy Sciences 17984-25
Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Phase and Fluorescence Microscope Zeiss
Leica MZ9.5 Stereomicroscope Leica
Fluorescein isothicyanate-dextran, 70000 Sigma-Aldrich 46945

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carmeliet, P., Tessier-Lavigne, M. Common mechanisms of nerve and blood vessel wiring. Nature. 436, 193-200 (2005).
  2. Eichmann, A., Thomas, J. L. Molecular Parallels between Neural and Vascular Development. Cold Spring Harb Perspect Med. 3, (2012).
  3. Larrivee, B., Freitas, C., Suchting, S., Brunet, I., Eichmann, A. Guidance of vascular development: lessons from the nervous system. Circ Res. 104, 428-441 (2009).
  4. Stefater Iii, J. A., et al. Regulation of angiogenesis by a non-canonical Wnt-Flt1 pathway in myeloid cells. Nature. 474, 511-515 (2011).
  5. Checchin, D., Sennlaub, F., Levavasseur, E., Leduc, M., Chemtob, S. Potential role of microglia in retinal blood vessel formation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 3595-3602 (2006).
  6. Quaegebeur, A., Lange, C., Carmeliet, P. The neurovascular link in health and disease: molecular mechanisms and therapeutic implications. Neuron. 71, 406-424 (2011).
  7. Yamamoto, Y., Craggs, L., Baumann, M., Kalimo, H., Kalaria, R. N. Review: molecular genetics and pathology of hereditary small vessel diseases of the brain. Neuropathol Appl Neurobiol. 37, 94-113 (2011).
  8. Brun, A., Englund, E. A white matter disorder in dementia of the Alzheimer type: a pathoanatomical study. Ann Neurol. 19, 253-262 (1986).
  9. Prat, A., et al. Migration of multiple sclerosis lymphocytes through brain endothelium. Arch Neurol. 59, 391-397 (2002).
  10. Rule, R. R., Schuff, N., Miller, R. G., Weiner, M. W. Gray matter perfusion correlates with disease severity in ALS. Neurology. 74, 821-827 (2010).
  11. Antonetti, D. A., Klein, R., Gardner, T. W. Diabetic retinopathy. N Engl J Med. 366, 1227-1239 (2012).
  12. Hartnett, M. E., Penn, J. S. Mechanisms and management of retinopathy of prematurity. N Engl J Med. 367, 2515-2526 (2012).
  13. Sapieha, P., et al. Retinopathy of prematurity: understanding ischemic retinal vasculopathies at an extreme of life. J Clin Invest. 120, 3022-3032 (2010).
  14. Chen, J., Smith, L. Retinopathy of prematurity. Angiogenesis. 10, 133-140 (2007).
  15. Cheung, N. Diabetic retinopathy and systemic vascular complications. Progress in Retinal and Eye Research. 27, 161-176 (2008).
  16. Smith, L. E. Through the eyes of a child: understanding retinopathy through ROP the Friedenwald lecture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 5177-5182 (2008).
  17. Caballero, S., et al. Ischemic vascular damage can be repaired by healthy, but not diabetic, endothelial progenitor cells. Diabetes. 56, 960-967 (2007).
  18. Wang, H., et al. VEGF-mediated STAT3 activation inhibits retinal vascularization by down-regulating local erythropoietin expression. Am J Pathol. 180, 1243-1253 (2012).
  19. Ritter, M. R., et al. Myeloid progenitors differentiate into microglia and promote vascular repair in a model of ischemic retinopathy. J Clin Invest. 116, 3266-3276 (2006).
  20. Saito, Y., Geisen, P., Uppal, A., Hartnett, M. E. Inhibition of NAD(P)H oxidase reduces apoptosis and avascular retina in an animal model of retinopathy of prematurity. Mol Vis. 13, 840-853 (2007).
  21. Connor, K. M., et al. Increased dietary intake of omega-3-polyunsaturated fatty acids reduces pathological retinal angiogenesis. Nat Med. 13, 868-873 (2007).
  22. Banin, E., et al. T2-TrpRS inhibits preretinal neovascularization and enhances physiological vascular regrowth in OIR as assessed by a new method of quantification. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 2125-2134 (2006).
  23. Dorrell, M. I., et al. Maintaining retinal astrocytes normalizes revascularization and prevents vascular pathology associated with oxygen-induced retinopathy. Glia. 58, 43-54 (2010).
  24. Joyal, J. -S., et al. Ischemic neurons prevent vascular regeneration of neural tissue by secreting semaphorin 3A. Blood. 117, 6024-6035 (2011).
  25. Binet, F., et al. Neuronal ER Stress Impedes Myeloid-Cell-Induced Vascular Regeneration through IRE1alpha Degradation of Netrin-1. Cell Metab. 17, 353-371 (2013).
  26. Fukushima, Y., et al. Sema3E-PlexinD1 signaling selectively suppresses disoriented angiogenesis in ischemic retinopathy in mice. J Clin Invest. 121, 1974-1985 (2011).
  27. Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Invest Ophthalmol Vis Sci. 35, 101-111 (1994).
  28. Lange, C., et al. Kinetics of retinal vaso-obliteration and neovascularisation in the oxygen-induced retinopathy (OIR) mouse model. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 247, 1205-1211 (2009).
  29. Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4, 1565-1573 (2009).
  30. Stahl, A., et al. The mouse retina as an angiogenesis model. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 2813-2826 (2010).
  31. Stahl, A., et al. Computer-aided quantification of retinal neovascularization. Angiogenesis. 12, 297-301 (2009).
  32. Stahl, A., et al. Postnatal Weight Gain Modifies Severity and Functional Outcome of Oxygen-Induced Proliferative Retinopathy. Am J Pathol. 177, 2715-2723 (2010).
  33. Cerani, A., et al. Neuron-Derived Semaphorin 3A is an Early Inducer of Vascular Permeability in Diabetic Retinopathy via Neuropilin-1. Cell Metabolism. 18, 505-518 (2013).
  34. Sapieha, P. Eyeing central neurons in vascular growth and reparative angiogenesis. Blood. 120, 2182-2194 (2012).
  35. Dorfman, A., Dembinska, O., Chemtob, S., Lachapelle, P. Early manifestations of postnatal hyperoxia on the retinal structure and function of the neonatal rat. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 458-466 (2008).
  36. Dorfman, A. L., Joly, S., Hardy, P., Chemtob, S., Lachapelle, P. The effect of oxygen and light on the structure and function of the neonatal rat retina. Doc Ophthalmol. 118, 37-54 (2009).
  37. Chopp, M., Zhang, Z. G., Jiang, Q. Neurogenesis, angiogenesis, and MRI indices of functional recovery from stroke. Stroke. 38, 827-831 (2007).
  38. Li, L., et al. Angiogenesis and improved cerebral blood flow in the ischemic boundary area detected by MRI after administration of sildenafil to rats with embolic stroke. Brain Res. 1132, 185-192 (2007).
  39. Robinson, R., Barathi, V. A., Chaurasia, S. S., Wong, T. Y., Kern, T. S. Update on animal models of diabetic retinopathy: from molecular approaches to mice and higher mammals. Dis Model Mech. 5, 444-456 (2012).
  40. Chia, R., Achilli, F., Festing, M. F., Fisher, E. M. The origins and uses of mouse outbred stocks. Nat Genet. 37, 1181-1186 (2005).
  41. Jenuth, J. P., Peterson, A. C., Shoubridge, E. A. Tissue-specific selection for different mtDNA genotypes in heteroplasmic mice. Nat Genet. 16, 93-95 (1997).
  42. Mattapallil, M. J., et al. The Rd8 mutation of the Crb1 gene is present in vendor lines of C57BL/6N mice and embryonic stem cells, and confounds ocular induced mutant phenotypes. Investigative ophthalmolog., & visual science. 53, 2921-2927 (2012).
Bedömning av Vascular Regeneration i CNS Använda musen Retina
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Miloudi, K., Dejda, A., Binet, F., Lapalme, E., Cerani, A., Sapieha, P. Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (88), e51351, doi:10.3791/51351 (2014).More

Miloudi, K., Dejda, A., Binet, F., Lapalme, E., Cerani, A., Sapieha, P. Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (88), e51351, doi:10.3791/51351 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter